一種檢測(cè)非體液性稀有有核細(xì)胞的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)非體液性稀有有核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的新方法，對(duì)于多種手段得到生物體液中的非體液性稀有有核細(xì)胞，通過(guò)聯(lián)合使用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體以及非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針，達(dá)到鑒別富集后的該稀有有核細(xì)胞的目的。相對(duì)于目前市場(chǎng)上已有的商品化鑒別方法而言，本方法將處理非體液性稀有有核細(xì)胞的熒光原位雜交（FISH）方法與處理體液性有核細(xì)胞的免疫熒光染色進(jìn)行了良好的結(jié)合，針對(duì)同一張標(biāo)本片進(jìn)行系統(tǒng)的結(jié)合性處理，能同時(shí)并清晰地觀察到這兩種處理的結(jié)果。
【專利說(shuō)明】一種檢測(cè)非體液性稀有有核細(xì)胞的方法和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種非體液性稀有有核細(xì)胞的檢測(cè)方法，其包括在對(duì)樣品進(jìn)行重固定之后，結(jié)合使用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體和非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針處理待檢測(cè)樣品。本發(fā)明還涉及包含1.)體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體；i1.)非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針；和ii1.)重固定劑的試劑盒，該試劑盒用于本發(fā)明的方法的用途，以及實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法的檢測(cè)系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，越來(lái)越多的報(bào)道熱衷于循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CEC)、腫瘤干細(xì)胞等的研究，成果多覆蓋于乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等實(shí)體瘤(Joost，CytometryPart A, 75A, 2009; Shaffer DR, Clin Cancer Research, 2007，13 (I))。其中美國(guó)國(guó)家食品藥品管理局已審批通過(guò)Immunicon/Veridex公司的CellSearch?循環(huán)腫瘤細(xì)胞試劑盒,通過(guò)對(duì)CTC的捕獲后計(jì)數(shù)，可用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等腫瘤預(yù)后情況的臨床預(yù)測(cè)。目前該試劑盒也已通過(guò)我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的審批，可在國(guó)內(nèi)臨床上使用。
[0003]很多報(bào)道顯示，CTC計(jì)數(shù)不但可為腫瘤的預(yù)測(cè)、治療、預(yù)后等提供很好的判斷依據(jù)，同時(shí)也可為下一步研究提供良好的平臺(tái)，例如在該細(xì)胞基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究患者腫瘤細(xì)胞的遺傳信息。因此準(zhǔn)確分離CTC，并可長(zhǎng)時(shí)間保存尤為重要。已有報(bào)道的分離CTC的方法主要以免疫磁珠分離法以及基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的富集法等為主，后期再輔以相應(yīng)的方法鑒別所得細(xì)胞，主要為上皮源標(biāo)志物，也有特異性探針的熒光原位雜交(FISH)方法檢測(cè)。
[0004]多數(shù)免疫磁珠分離法的報(bào)道依賴于上皮源標(biāo)志物對(duì)CTC的免疫陽(yáng)性捕獲及檢測(cè)，例如CellSearch?的CTC檢測(cè)試劑盒，即是利用上皮源標(biāo)志物EpCAM的免疫磁珠捕獲CTC，后期采用上皮源標(biāo)志物CK8，18和/或19的免疫熒光染色方法來(lái)進(jìn)一步鑒別。
[0005]目前血液中出現(xiàn)上皮源標(biāo)志的細(xì)胞即被認(rèn)為是CTCjBEpCAM,細(xì)胞角蛋白(CK)等，但缺乏有力的證據(jù)證明這些細(xì)胞就是CTC，而不是上皮細(xì)胞本身進(jìn)入體液帶來(lái)的假陽(yáng)性細(xì)胞。除此之外，EpCAM和CK等上皮源標(biāo)志物在入血的過(guò)程中，經(jīng)過(guò)上皮間皮轉(zhuǎn)化過(guò)程，其陽(yáng)性會(huì)有所減弱甚至消失，因此弱陽(yáng)性及假陰性給CTC的判定帶來(lái)了很大的干擾。另外，因缺乏高特異性的腫瘤相關(guān)抗原，免疫陽(yáng)性捕獲在分離CTC的過(guò)程中容易丟失真正的腫瘤細(xì)胞，如后期檢測(cè)繼續(xù)使用上皮標(biāo)志物，則增加了假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。
[0006]另有一種免疫磁珠分離法叫做陰性免疫磁珠CTC富集法，其利用包被了血源性表面標(biāo)志物CD45的免疫磁珠去除血液樣本中98-99%的白細(xì)胞，將剩余細(xì)胞涂片，再對(duì)這些剩余的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。該富集方法避開(kāi)了依賴于上皮標(biāo)志物的免疫陽(yáng)性捕獲途徑，能高效地拿到CTC。但該方法的局限性在于后期檢測(cè)靈敏度及特異性較低。經(jīng)陰性去除白細(xì)胞富集所得的CTC及白細(xì)胞混合物，背景較高，如利用上皮源標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，則更容易受到弱陽(yáng)性及假陰性的困擾。
[0007]利用形態(tài)學(xué)的CTC富集法是目前常用的另一種富集腫瘤細(xì)胞的方法，該方法對(duì)設(shè)備要求不高，方法較為簡(jiǎn)單。例如OncoQuick分離法，用一種專用的50ml試管，內(nèi)置多孔屏障，其下為密度梯度分離液，使用時(shí)，將標(biāo)本置于屏障之上，從而避免在離心時(shí)直接與分離液混合而污染。該法比常用的Ficoll法對(duì)腫瘤細(xì)胞的回收率更高(Rosenber R，Cytometry, 2002，49(4))。但過(guò)多依賴于腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特性，如相對(duì)密度、細(xì)胞大小等，缺乏特異性。近幾年興起的ISET分離法，根據(jù)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的大小不同來(lái)分離腫瘤細(xì)胞，目前還沒(méi)有報(bào)道證實(shí)所有的腫瘤細(xì)胞都大于8um，使其分離的靈敏性受到質(zhì)疑。因此對(duì)該法分離的CTC，如不能輔以很好的后期檢測(cè)，則由判定引起的細(xì)胞丟失的可能性也較大。
[0008]對(duì)于檢測(cè)來(lái)說(shuō)，有多種檢測(cè)方法，其中一種為利用免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)來(lái)檢測(cè)CTC的方法，即利用腫瘤標(biāo)志物來(lái)對(duì)獲得的細(xì)胞進(jìn)行定位、定性及定量，如上皮源細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin，CK)，上皮細(xì)胞膜特異性抗原(EMA、HMFG, HEA-125等)，腫瘤相關(guān)糖蛋白(TAG)等。其優(yōu)點(diǎn)為可觀察到細(xì)胞形態(tài)，缺陷在于敏感性較低。
[0009]另一個(gè)用的較多的檢測(cè)方法為流式細(xì)胞術(shù)，但其易受標(biāo)本保存、研究人員差異等因素干擾，造成結(jié)果誤差。
[0010]此外，新近出現(xiàn)的CTCs-ChiP也是一項(xiàng)集富集與檢測(cè)為一體的先進(jìn)技術(shù)，檢測(cè)靈敏度非常高，即使只有極少量的腫瘤細(xì)胞。也只需一個(gè)步驟即可從全血中富集CTC，檢驗(yàn)可隨時(shí)進(jìn)行，結(jié)果不會(huì)受腫瘤細(xì)胞間斷釋放的影響，便于對(duì)患者進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，且不影響細(xì)胞活性，有利于進(jìn)一步進(jìn)行分子生物學(xué)和遺傳學(xué)分析(Nagrath S，Nature2007, 450 (7131)) ?但其價(jià)格昂貴。
[0011]后期鑒定的方法中，也有少數(shù)報(bào)道采用了 FISH技術(shù)來(lái)鑒別(Joost，CytometryPart A, 2009 ;75A; Katz R L, Clin Cancer Res; 2008，16 (15))。FISH 方法依賴于遺傳學(xué)的改變，相比于上皮標(biāo)志物來(lái)說(shuō)有很大的穩(wěn)定性，能很大程度地避免上述的上皮細(xì)胞污染，以及弱陽(yáng)性和假陰性的產(chǎn)生。而對(duì)于陰性去除白細(xì)胞的方法，用FISH檢測(cè)，更容易受到殘留的雜質(zhì)等因素的影響，帶來(lái)了另外一種假陽(yáng)性細(xì)胞干擾，給結(jié)果的判斷及更進(jìn)一步的研究帶來(lái)很大困難。因此，無(wú)論是利用上皮標(biāo)志物，還是采用傳統(tǒng)的FISH檢測(cè)，均不可避免地干擾了結(jié)果的最終判斷。且單獨(dú)使用FISH同樣缺乏證據(jù)證明其是CTC，而不是血源性的異常細(xì)胞，例如已有報(bào)道顯示在肺癌初期淋巴細(xì)胞也有遺傳性的改變(B J Dave, CancerEpidemiol Biomarkers Prev, 1995,4(7))。
[0012]已有的以FISH、CK陽(yáng)性、⑶45陰性鑒定CTC的報(bào)道中，多為免疫熒光染色和FISH分開(kāi)處理標(biāo)本，即先用免疫熒光方法將標(biāo)本染色，經(jīng)讀片鑒定后，揭去蓋玻片，洗掉免疫突光信號(hào)，再用FISH處理(任傳利,2008,中國(guó)腫瘤，17(6) ；Margaret A, Clin CancerRes; 2009, 15 (6) ;Elizebeth A, Plos ONE, 2010,5(9) )? 如將兩種方法分開(kāi)處理待檢測(cè)樣品，則先進(jìn)行免疫熒光后FISH處理，不能先進(jìn)行FISH處理，因?yàn)殡S著離體時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞上的抗原降解愈發(fā)嚴(yán)重，如在標(biāo)本觀察結(jié)果后再進(jìn)行免疫熒光，則很可能已無(wú)法觀察到CK或⑶45。但無(wú)論哪種處理順序，需將標(biāo)本蓋上蓋玻片，待顯微鏡下鑒別完畢后，再洗去蓋玻片進(jìn)行下一步處理。這樣處理，雖然可以利用FISH鑒別信號(hào)，但在揭掉蓋玻片的過(guò)程中，極易丟失及損壞細(xì)胞。如第一次鏡下鑒別到陽(yáng)性細(xì)胞，在此定位基礎(chǔ)上再定位尋找目標(biāo)細(xì)胞，容易發(fā)生偏差，如無(wú)精密的定位裝置，而依靠人工定位或不精密的定位裝置，則會(huì)使找尋工作需耗費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，降低了檢測(cè)效率。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]針對(duì)以上提出的單獨(dú)使用上皮細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè)非體液性稀有有核細(xì)胞易產(chǎn)生假陽(yáng)性、弱陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，而單獨(dú)使用FISH不能確定是否為淋巴細(xì)胞突變或雜質(zhì)干擾，以及分開(kāi)使用FISH及免疫熒光處理容易丟失及損傷細(xì)胞，重復(fù)定位操作困難，且先進(jìn)行FISH處理及FISH結(jié)果的觀察，容易弓I起免疫標(biāo)志物的降解等技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出一種稀有細(xì)胞的檢測(cè)方法，其結(jié)合使用白細(xì)胞標(biāo)志物作為體液性細(xì)胞表面標(biāo)志，以腫瘤特異性的核酸突變作為FISH檢測(cè)探針的方法，既能夠同時(shí)觀察兩種信號(hào)，又能避免細(xì)胞丟失及損傷，且因省略了一次結(jié)果的觀察，能夠最大程度避免細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物的降解，提高了非體液性稀有有核細(xì)胞細(xì)胞檢測(cè)的靈敏度和特異性，另一方面又可以提高讀片速度，避免重復(fù)定位。用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物抗體去除血源性細(xì)胞及雜質(zhì)的干擾；用FISH特異性探針鑒定稀有細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明在傳統(tǒng)的FISH技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，將其與生物的體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)合起來(lái)，即對(duì)于同一個(gè)標(biāo)本，先以重固定劑例如多聚甲醛進(jìn)行重固定，再用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體及非體液性稀有有核細(xì)胞的FISH特異性探針兩個(gè)試劑來(lái)處理所得細(xì)胞(可視體液有核細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)強(qiáng)弱及實(shí)驗(yàn)需求，設(shè)置調(diào)換兩種方法的處理順序)。最終同時(shí)用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判定所得細(xì)胞區(qū)分體液性有核細(xì)胞和非體液性稀有有核細(xì)胞，排除了體液性有核細(xì)胞的假陽(yáng)性干擾。
[0015]具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容:
[0016]實(shí)施方式1.一種對(duì)非體液性稀有有核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的方法，其包括:
[0017]a.用重固定劑重固定待檢測(cè)樣品，
[0018]b.在步驟a之后，使用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體和非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針處理待檢測(cè)樣品，
[0019]c.在顯微鏡下讀取處理結(jié)果。
[0020]實(shí)施方式2.實(shí)施方式I的檢測(cè)方法，其中所述待檢測(cè)樣品是從生物體液富集非體液性稀有有核細(xì)胞獲得的樣品。
[0021]實(shí)施方式3.實(shí)施方式I的方法，其中所述非體液性稀有有核細(xì)胞是體液中非體液性質(zhì)的稀有有核細(xì)胞。
[0022]實(shí)施方式4.實(shí)施方式I的方法，其中所述體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物是用于免疫熒光技術(shù)的標(biāo)志物，包括:CD3、CD31、CD34、CD45、CD50、CD69、CD84，或 CD 102。
[0023]實(shí)施方式5.實(shí)施方式I的方法，其中所述非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針是用于熒光原位雜交(FISH)的探針。
[0024]實(shí)施方式6.實(shí)施方式I的方法，步驟b為以下的任一種:
[0025](i):先用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體處理，再用非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針處理；
[0026](ii):先用非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針處理，再用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體處理；
[0027](iii):同時(shí)使用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體和非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針處理；
[0028](iv):交替使用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體和非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針處理，或包含(i)至(iii)中兩種、三種或四種的組合。
[0029]實(shí)施方式7.實(shí)施方式I的方法，其中所述重固定劑選自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸鈾、鉻酸、苦味酸，或其組合，優(yōu)選為多聚甲醛為0.2-8%(W/V)，更優(yōu)選0.8-5%多聚甲醛，最優(yōu)選1.2-4%多聚甲醛。
[0030]實(shí)施方式8.實(shí)施方式I的方法，其中所述方法用于非治療用途。
[0031]實(shí)施方式9.實(shí)施方式8的方法，其中所述非治療用途包括:用于科研目的的非體液性稀有有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，用于非體液性稀有有核細(xì)胞遺傳信息的研究平臺(tái)。
[0032]實(shí)施方式10.—種用于檢測(cè)稀有細(xì)胞的試劑盒，其包括:1.)體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體)非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針；和ii1.)重固定劑。
[0033]實(shí)施方式11.實(shí)施方式10的試劑盒，其中所述體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物是用于免疫熒光技術(shù)的標(biāo)志物。
[0034]實(shí)施方式12.實(shí)施方式10的試劑盒，其中所述非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針是用于熒光原位雜交技術(shù)的探針。
[0035]實(shí)施方式13.實(shí)施方式11的試劑盒，其中所述用于免疫熒光技術(shù)的標(biāo)志物為血源性細(xì)胞表面標(biāo)志物。
[0036]實(shí)施方式14.實(shí)施方式12的試劑盒，其中所述用于熒光原位雜交技術(shù)的探針為所述非體液性稀有有核細(xì)胞特異性的核酸探針。
[0037]實(shí)施方式15.實(shí)施方式10的試劑盒，其還包括說(shuō)明書，其中所述說(shuō)明書中記載前述實(shí)施方式I至9中任一項(xiàng)的方法。
[0038]實(shí)施方式16.實(shí)施方式10的試劑盒，其中所述重固定劑選自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸鈾、鉻酸、苦味酸，或其組合，優(yōu)選為多聚甲醛為0.2-8% (ff/V),更優(yōu)選0.8-5%多聚甲醛，最優(yōu)選1.2-4%多聚甲醛。
[0039]實(shí)施方式17.—種稀有細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)，其能夠進(jìn)行實(shí)施方式I至9中任一項(xiàng)的方法，和/或能夠使用實(shí)施方式10至16中任一項(xiàng)的試劑盒處理待檢測(cè)樣品。
[0040]實(shí)施方式18.實(shí)施方式17的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)是自動(dòng)化系統(tǒng)。
[0041]實(shí)施方式19.實(shí)施方式10至16中任一項(xiàng)的試劑盒用于實(shí)施方式I至9中任一項(xiàng)的方法中的用途。
[0042]本發(fā)明的主要特征之一是結(jié)合使用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體和非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針處理待檢測(cè)樣品。在具體的實(shí)施方式中，用FISH特異性探針鑒定非體液性稀有有核細(xì)胞，使用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體去除體液性細(xì)胞的干擾，以排除FISH的假陽(yáng)性。如將兩種方法分開(kāi)處理待檢測(cè)樣品，無(wú)論是先進(jìn)行FISH后免疫熒光處理，或先進(jìn)行免疫熒光后FISH處理，均需將標(biāo)本蓋上蓋玻片，待顯微鏡下鑒別完畢后，再洗去蓋玻片進(jìn)行下一步處理，此操作極易丟失及損傷細(xì)胞。且如先進(jìn)行FISH處理，待觀察后再進(jìn)行免疫熒光處理的話，則細(xì)胞表面的免疫標(biāo)志物隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，降解程度將急劇增力口。而本方法同時(shí)觀察這兩種方法處理所得的信號(hào)，不需通過(guò)重復(fù)定位找到目標(biāo)細(xì)胞來(lái)觀察第二次處理結(jié)果。并且避免分開(kāi)處理導(dǎo)致的細(xì)胞丟失及傷害等情況，從而提高了檢測(cè)效率及靈敏度。此外，本方法可根據(jù)目的需求來(lái)調(diào)換FISH及免疫熒光的處理順序，為不同目的的實(shí)驗(yàn)提供了極大的便利。
[0043]總之，本發(fā)明優(yōu)勢(shì)在于:[0044]1.體液性有核細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體與非體液性稀有有核細(xì)胞特異性探針組合檢測(cè)，具有很高的檢測(cè)靈敏度、特異性以及效率。
[0045]2.本方法可用于多種體液中的非體液性稀有有核細(xì)胞的鑒別。
[0046]3.進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在使用重固定劑多聚甲醛后，效果更好。
[0047]4.更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，1%多聚甲醛的最佳固定時(shí)間第8-12分鐘(即可控時(shí)間范圍為4分鐘)，相比于2%、4%多聚甲醛的可控時(shí)間范圍(〈2分鐘)，更利于標(biāo)本較多時(shí)的操作。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用1%多聚甲醛作為重固定劑處理4-20分鐘，更優(yōu)選8-12分鐘。
[0048]5.多個(gè)腫瘤標(biāo)志物與FISH聯(lián)合，可稍許提高陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果，但同時(shí)也增加了假陽(yáng)性，且操作繁瑣。因此本方法更利于特異性的提高。
[0049]6.本方法處理后的標(biāo)本片，仍可作為下一步基因研究的平臺(tái)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0050]圖1是本方法的靈敏度測(cè)試結(jié)果。
[0051]圖2是僅用FISH方法的靈敏度測(cè)試結(jié)果。
[0052]圖3是正常人中本方法與僅用FISH方法測(cè)得的假陽(yáng)性結(jié)果。
[0053]圖4是血液標(biāo)本中本方法檢測(cè)到的陽(yáng)性細(xì)胞。
[0054]圖5是本方法檢測(cè)到的腫瘤細(xì)胞的EGFR基因電泳圖。
[0055]圖6是不同濃度多聚甲醛固定效果的對(duì)比結(jié)果。
[0056]定義:
[0057]體液性有核細(xì)胞:指某種生物的體液中所含有的有核細(xì)胞，如白細(xì)胞，白細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞)、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等。
[0058]非體液性稀有有核細(xì)胞:循環(huán)的具有上皮來(lái)源的或不具有上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞和循環(huán)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，某些免疫細(xì)胞等稀有細(xì)胞。所述非體液性稀有有核細(xì)胞在血液中占所有有核細(xì)胞的0.1 %以下。在本申請(qǐng)中，在描述本發(fā)明的方法時(shí)，術(shù)語(yǔ)稀有細(xì)胞就是指此處的非體液性稀有有核細(xì)胞。
[0059]循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cell, CTC):通常把進(jìn)入人體外周血的腫瘤細(xì)胞稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。循環(huán)腫瘤細(xì)胞是非體液性稀有有核細(xì)胞的一種。
[0060]循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(Circulating endothelial cell, CEC):把脫落入血的血管內(nèi)皮細(xì)胞稱為循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞。循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞也是非體液性稀有有核細(xì)胞的一種。
[0061]免疫突光技術(shù)(Immunofluorescence):用突光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法，稱為熒光抗體法；用已知的熒光抗原示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。
[0062]突光原位雜交技術(shù)(Fluorescencein situ hybridization, FISH):用突光標(biāo)記的核酸探針在染色體上進(jìn)行的雜交方法，以確定與探針互補(bǔ)的核酸序列在染色體上的位置和分布。
[0063]間期(Interphase):細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂的分裂期之前的時(shí)期，是有絲分裂的準(zhǔn)備階段。一個(gè)細(xì)胞在細(xì)胞循環(huán)90%左右的時(shí)間是在間期中。
[0064]同源染色體(Homologous chromosomes):在二倍體生物細(xì)胞中，形態(tài)、結(jié)構(gòu)基本相同的染色體。
[0065]等位基因(Allele):位于一對(duì)同源染色體的相同位置上控制某一性狀的不同形態(tài)的基因。
【具體實(shí)施方式】
[0066]本發(fā)明中的待檢測(cè)樣品通常是從生物體液富集非體液性稀有有核細(xì)胞獲得的樣品O
[0067]對(duì)于已富集的非體液性稀有有核細(xì)胞，用固定劑固定，均勻涂在載玻片上，室溫放置，直至樣本全部干燥。但勿放置過(guò)久，以免體液性標(biāo)志物降解。一般室溫下可過(guò)夜，之后短期內(nèi)，可放于4°C冰箱待處理；長(zhǎng)期不進(jìn)行檢測(cè)，可放于-20°C冰箱待處理。
[0068]FISH處理，使標(biāo)本的目標(biāo)核酸結(jié)合上特異性的熒光探針。
[0069]免疫熒光處理，使標(biāo)本的目標(biāo)蛋白結(jié)合上體液性表面標(biāo)志物。
[0070]經(jīng)以上處理后的標(biāo)本可長(zhǎng)期保存于4°C達(dá)二年以上。
[0071]從生物體液樣本中富集稀有細(xì)胞的方法介紹
[0072]在本申請(qǐng)中，以富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的方法為例，介紹富集稀有細(xì)胞的方法。富集CTC的方法以形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)為主，主要有以下幾種:
[0073]基于形態(tài)學(xué)的富集方法:
[0074]單核細(xì)胞相對(duì)于其他血液成分密度較低，因此能根據(jù)密度梯度的差別將其分離。采用1.077g/ml的密度梯度，單核細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞可以與血液其他成分分離。Oncoquick就是基于密度梯度分離的原則，增加了多孔屏障，使分離出的細(xì)胞更加純化。
[0075]ISET方法利用分子大小來(lái)分離腫瘤細(xì)胞，通過(guò)不同大小的孔徑，將>8um的腫瘤細(xì)胞保存下來(lái)。
[0076]基于免疫學(xué)的富集方法:
[0077]免疫磁珠法原理是細(xì)胞表面抗原分子能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場(chǎng)的作用下，通過(guò)抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸引而留在磁場(chǎng)中，而其他細(xì)胞因?yàn)椴粠Т判裕荒茉诖艌?chǎng)中停留，從而使細(xì)胞得以分離。基于免疫學(xué)的富集方法分為陰性和陽(yáng)性兩種。免疫陰性富集可用抗CD45抗體，或是抗CD61抗體移除血液中的巨核細(xì)胞及血小板。免疫陽(yáng)性分選可通過(guò)磁性微球連接上抗上皮的抗體，如EpCAM。
[0078]一般的稀有細(xì)胞的檢測(cè)方法的步驟:
[0079]免疫細(xì)胞化學(xué)法是指以顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和細(xì)胞化學(xué)的呈色反應(yīng)。其檢測(cè)技術(shù)主要分為三類:1)上皮細(xì)胞角蛋白(CK)，如CK19、CK20等；2)上皮細(xì)胞膜特異性抗原，如黏蛋白類，包括EMA、HMFG、HEA-125等；3)腫瘤相關(guān)蛋白(TAG)。其主要優(yōu)點(diǎn)是可進(jìn)行細(xì)胞大小和形態(tài)學(xué)的分析，缺點(diǎn)是靈敏度低，只能在IO5個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到一個(gè)腫瘤細(xì)胞。
[0080]流式細(xì)胞術(shù)作為檢測(cè)CTC數(shù)目的方法之一，集激光、電子物理、光電測(cè)量、計(jì)算機(jī)、細(xì)胞熒光化學(xué)及單克隆抗體技術(shù)為一體，不僅能鑒定標(biāo)本中細(xì)胞抗原性和形態(tài)學(xué)特征，還能使富集的目的細(xì)胞保持形態(tài)學(xué)特性并保持細(xì)胞活力。但該技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的價(jià)值很大程度上依賴于可分析的細(xì)胞數(shù)量，且受標(biāo)本固定貯存及研究人員間的差異等因素的干擾，且價(jià)格昂貴、耗時(shí)較長(zhǎng)。[0081]PCR檢測(cè)CTC主要是通過(guò)檢測(cè)癌基因、抑癌基因的突變。該方法靈敏度高，能在IO6個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到一個(gè)腫瘤細(xì)胞，但極易出現(xiàn)假陽(yáng)性，且使用范圍有限。因血液中CTC和核酸的半衰期不穩(wěn)定，檢測(cè)到的游離DNA，可能僅僅是核酸，而不是真正的腫瘤細(xì)胞。
[0082]近些年開(kāi)發(fā)出的實(shí)時(shí)定量RT-PCR，具有引物和探針的雙重特性，擴(kuò)增效率高，反應(yīng)污染少，Ct值穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，但是該方法不能對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析。
[0083]本發(fā)明的稀有細(xì)胞的檢測(cè)方法包括以下步驟:
[0084]1.重固定劑重固定待檢測(cè)樣品；
[0085]2.進(jìn)行FISH和免疫熒光處理；
[0086]3.讀片(例如，在顯微鏡下讀取處理結(jié)果)。
[0087]通常，在使用重固定劑重固定待檢測(cè)樣品之前，常常需要準(zhǔn)備已固定于載玻片上的待檢測(cè)樣品；若待檢測(cè)樣品為液體，則要涂于載玻片上至完全干燥。然而這個(gè)步驟對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠進(jìn)行該步驟。
[0088]在步驟I中，對(duì)于待檢測(cè)樣品例如已富集的非體液性稀有有核細(xì)胞進(jìn)行多聚甲醛重固定。
[0089]FISH處理:在37 °C的2 X SSC中浸泡5_15min，后經(jīng)75%、85%、無(wú)水乙醇逐級(jí)脫水。加入IOul探針，蓋上蓋玻片，變性5分鐘，雜交20分鐘-4小時(shí)不等。然后甲酰胺(ρΗ7.0±0.I)中洗滌 15min，或 ΝΡ40 洗滌 l_5min。
[0090]免疫熒光處理:室溫下，體液性表面標(biāo)志物避光孵育標(biāo)本40分鐘-1小時(shí)。輕輕洗掉標(biāo)志物后，DAPI (4，6-二氨基一 2—苯基吲哚)復(fù)染封片，即可鏡下觀察。該處理后的標(biāo)本可長(zhǎng)期保存于4°C。
[0091]讀片:在顯微鏡下讀取檢測(cè)結(jié)果。鏡下“S”型掃讀，確保無(wú)遺漏細(xì)胞。體液性有核細(xì)胞表現(xiàn)為:單個(gè)核呈圓形或橢圓形，體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物抗體呈陽(yáng)性，DAPI呈陽(yáng)性，以及任何數(shù)量的探針陽(yáng)性點(diǎn)個(gè)數(shù)，多數(shù)情況下為2個(gè)點(diǎn)，部分細(xì)胞因試劑或血液中殘留的雜質(zhì)或自身的突變而表現(xiàn)為3個(gè)以上的點(diǎn)，或較少部分細(xì)胞未能充分雜交而呈現(xiàn)為I個(gè)點(diǎn)。非體液性稀有有核細(xì)胞需符合以下要求:單個(gè)核呈圓形或橢圓形，擴(kuò)增型探針陽(yáng)性表現(xiàn)為> 3個(gè)點(diǎn)，體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物為陰性，DAPI陽(yáng)性。缺失型探針表現(xiàn)為〈2個(gè)點(diǎn)，體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物陰性，DAPI陽(yáng)性。
[0092]本發(fā)明的方法提高靈敏度和特異性的原因:
[0093]DNA在穩(wěn)定性方面，優(yōu)于蛋白以及RNA等，因此利用FISH檢測(cè)DNA，具有較高的靈敏度，但是如前述，檢測(cè)同時(shí)產(chǎn)生的假陽(yáng)性對(duì)特異性影響很大。本發(fā)明的方法在使用了 FISH技術(shù)的基礎(chǔ)上，又結(jié)合了體液細(xì)胞標(biāo)志物，降低了假陽(yáng)性的出現(xiàn)，從而在很大程度上提高了特異性。
[0094]從生物體液中，通過(guò)上述某一種富集方法富集得到的非體液性稀有有核細(xì)胞后，將富集所得的樣本涂于載玻片，并加以固定。經(jīng)過(guò)本方法鑒定之后，該細(xì)胞可以其他方式將細(xì)胞取出，進(jìn)行PCR的檢測(cè)。
[0095]該體液可以是外周循環(huán)血、臍帶血、尿液、脊髓及胸腔積液、腹水、精液、骨髓、羊水、痰液等多種可能存在稀有有核細(xì)胞，且可用于富集的生物體液。非體液性稀有有核細(xì)胞包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞，循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞，干細(xì)胞，血中胎兒細(xì)胞，某些免疫細(xì)胞等稀有細(xì)胞。[0096]該體液如含白細(xì)胞，即可用血源性表面標(biāo)志物對(duì)其進(jìn)行免疫熒光染色處理。血源性標(biāo)志物包括:⑶3、⑶31、⑶34、⑶45、⑶50、⑶69、⑶84，或⑶102等。用于熒光原位雜交技術(shù)的探針為對(duì)待檢測(cè)的稀有有核細(xì)胞具有特異性的核酸探針，其在腫瘤細(xì)胞中會(huì)有某種特異性的突變，如擴(kuò)增、缺失等。
[0097]對(duì)標(biāo)本處理，調(diào)節(jié)免疫熒光染色與熒光原位雜交的順序，對(duì)最終效果有不同的影響。
[0098]同樣條件下，包括同樣的溫度、PH值、處理時(shí)間，同樣的固定方法等，不同的處理順序所得到的效果不盡相同。
[0099]對(duì)標(biāo)本先進(jìn)行FISH，再進(jìn)行免疫熒光染色處理，所得到的免疫熒光效果較弱。例如，在使用來(lái)源于血液的標(biāo)本的情況下，在體液標(biāo)本中的血源性表面標(biāo)志物表達(dá)較強(qiáng)的情況下，該順序操作較為簡(jiǎn)單，血源性表面標(biāo)志物即可起到很好的輔助判斷作用，且FISH信號(hào)能較好地得到保持。
[0100]而對(duì)于血源性表面標(biāo)志物表達(dá)一般的情況下，先進(jìn)行免疫熒光染色，再進(jìn)行FISH處理；若該標(biāo)志物表達(dá)較弱，可先進(jìn)行免疫熒光染色，再進(jìn)行FISH處理，之后再進(jìn)行一次免疫熒光染色。這樣所得的順序，能得到較強(qiáng)的免疫熒光染色效果，又能觀察到較好的FISH信號(hào)。
[0101]而同時(shí)進(jìn)行免疫熒光和FISH處理，在這些處理順續(xù)中，屬于效果較不理想的一項(xiàng)。二者均受對(duì)方處理方式的影響，以至于效果均受影響，所得的免疫熒光效果稍顯彌散，F(xiàn)ISH信號(hào)也較弱。
[0102]以上任意一種本方法的處理，均可用自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行編程，繼而對(duì)標(biāo)本進(jìn)行操作，包括不同順序的處理，以及向標(biāo)本加探針、抗體，以及對(duì)標(biāo)本進(jìn)行掃描讀片等操作。
[0103]本發(fā)明的技術(shù)方法的具體步驟:
[0104]可用不同的富集方法，對(duì)可用于富集的體液進(jìn)行富集非體液性稀有有核細(xì)胞獲得帶檢測(cè)樣品，用固定劑固定，均勻涂在載玻片上，面積約為4cm2。室溫放置，直至樣本全部干燥。
[0105]FISH處理，使標(biāo)本的目標(biāo)核酸結(jié)合上特異性的熒光探針。
[0106]免疫熒光處理，使標(biāo)本的目標(biāo)蛋白結(jié)合上體液性表面標(biāo)志物。
[0107]讀片。
[0108]一方面，本發(fā)明提供了一種對(duì)非體液性稀有有核細(xì)胞檢測(cè)的方法，其包括使用體液性表面標(biāo)志物、非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針以及連接試劑1%多聚甲醛處理待檢測(cè)樣品。
[0109]另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)非體液性稀有有核細(xì)胞試劑盒，包括:a.)體液性表面標(biāo)志物；b.)非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針」和/或c)其組合；d) —種連接FISH和免疫熒光染色方法的試劑1%多聚甲醛。其中體液性表面標(biāo)志物為抗單克隆或多克隆的混合物。特異性探針為適用于FISH雜交的核酸探針。
[0110]本發(fā)明的方法或者試劑盒具有高特異性、高靈敏度的特點(diǎn)，減小了細(xì)胞丟失頻率，避免了操作的復(fù)雜性，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置處理順序，并且同時(shí)觀察可極大地提高鑒別速度。而將兩種方法分開(kāi)處理樣本則操作復(fù)雜(即先用FISH處理，鏡下鑒別觀察后，洗掉蓋玻片，再進(jìn)行免疫熒光；或反之，但均需洗掉蓋玻片，該步驟極容易丟失細(xì)胞，操作需非常小心謹(jǐn)慎)，易丟失細(xì)胞，需重復(fù)定位，對(duì)于第一次處理后鑒別的陽(yáng)性細(xì)胞，如無(wú)精密的定位系統(tǒng)，只有人工定位或不精密的定位裝置，找到該陽(yáng)性細(xì)胞的工作將非常困難。
[0111]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，體液性表面標(biāo)志物為某一生物的體液中，該體液性有核細(xì)胞共同表達(dá)或大部分表達(dá)的抗原。
[0112]優(yōu)選地，生物體液性標(biāo)志物是指血源性表面標(biāo)志物，例如⑶3、⑶31、⑶34、⑶45、⑶50、⑶69、⑶84，或⑶102等，但不限于這些物質(zhì)。
[0113]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述的生物體液性標(biāo)志物使用標(biāo)記蛋白類的熒光素進(jìn)行
己 O
[0114]優(yōu)選地，標(biāo)記蛋白的熒光素是指能夠直接或間接與蛋白共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)的任何顏色的突光素，例如，Alexa Flour系列分子,FITC, Texas Red,羅丹明(rhodamine),生物素(biotin),地高辛(digoxigenin),但不限于這些物質(zhì)。
[0115]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，F(xiàn)ISH雜交所用的核酸探針為在某種疾病中出現(xiàn)遺傳性改變的核酸片段。所述在某種疾病中出現(xiàn)遺傳性改變的核酸片段包括擴(kuò)增、缺失、重排，以及其他形式的突變等情況。
[0116]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，F(xiàn)ISH方法的鑒別原理是檢測(cè)間期細(xì)胞的基因突變情況。正常人的體液性有核細(xì)胞正常情況下不會(huì)分裂生長(zhǎng)，而處于間期狀態(tài)，此時(shí)含有2條同源染色體，或2個(gè)等位基因。而惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生擴(kuò)增或缺失等突變時(shí)，間期表現(xiàn)為> 3或< I條染色體，> 3或< I個(gè)等位基因。利用核酸探針，可與每條染色體發(fā)生突變的區(qū)域雜交，并通過(guò)結(jié)合熒光素，達(dá)到鏡下觀察的目的。CTC為惡性腫瘤細(xì)胞從組織上脫落入血，具有典型的惡性腫瘤細(xì)胞的特征。鏡下觀察到的FISH信號(hào)以“點(diǎn)”的形式表現(xiàn)出來(lái)，即I條染色體或I個(gè)等位基因?qū)?yīng)I個(gè)點(diǎn)，如正常人體液性有核細(xì)胞為2個(gè)點(diǎn)，即可對(duì)應(yīng)2條染色體，或2個(gè)等位基因。
[0117]優(yōu)選地，由于某些惡性腫瘤的淋巴細(xì)胞也會(huì)發(fā)生突變，或試劑及血液中殘留的雜質(zhì)，部分細(xì)胞雜交異常等原因，使得體液性有核細(xì)胞也表現(xiàn)為異常，即鏡下觀察為> 3或< I個(gè)點(diǎn)。本發(fā)明的實(shí)施方式，通過(guò)體液性表面標(biāo)志物⑶45即可排除以上三種形式的干擾，從而鑒別出真正的非體液性稀有有核細(xì)胞。因此當(dāng)我們觀察到一個(gè)細(xì)胞核中信號(hào)數(shù)目> 3或< 1，且無(wú)⑶45時(shí)，即可視為CTC陽(yáng)性；反之，為陰性。
[0118]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，該核酸探針尤其是指雙鏈或單鏈DNA探針。
[0119]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，優(yōu)選待測(cè)樣品是從生物體液富集非體液性稀有有核細(xì)胞獲得的樣品。
[0120]優(yōu)選地，如檢測(cè)對(duì)象為RNA，則一定在進(jìn)行生物體液的前期富集步驟中采用RNA保護(hù)劑，以避免RNA降解。
[0121]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述的特異性探針使用標(biāo)記核酸類的熒光素進(jìn)行標(biāo)記。
[0122]優(yōu)選地，標(biāo)記核酸類的熒光素是指能夠直接或間接與核酸共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的任何顏色的熒光素，例如，Alexa Flour系列分子，F(xiàn)ITC，Texas Red，羅丹明(rhodamine)，生物素(biotin),地高辛(digoxigenin),但不限于這些物質(zhì)。
[0123]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，需將待檢測(cè)樣品涂在載玻片上。
[0124]優(yōu)選地，載玻片是指任何經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò)化學(xué)處理的適合熒光顯微鏡下觀察的載玻片。[0125]優(yōu)選地，為了減少非體液性稀有有核細(xì)胞的丟失，本技術(shù)所用的載玻片尤其是指防脫載玻片，即在普通載玻片表面涂有防脫劑，如多聚賴氨酸，但不限于該物質(zhì)。
[0126]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，在室溫下利用免疫熒光技術(shù)，將樣本與體液性標(biāo)志物孵育。
[0127]優(yōu)選地，該孵育過(guò)程避光處理，可避免光線引起的熒光素降解。
[0128]在一種實(shí)施方式中，使用本方法提供的試劑盒時(shí)，或者實(shí)施本發(fā)明的方法時(shí)，在FISH過(guò)程中控制變性溫度為71-81°C，優(yōu)選為76 V ;控制雜交溫度為32至42°C，優(yōu)選為37。。。
[0129]在一種實(shí)施方式中，為了減少非體液性稀有有核細(xì)胞的丟失，可使用雜交儀。所述雜交儀是一種通過(guò)金屬加熱板對(duì)載玻片整體溫度進(jìn)行控制的儀器。避免使用液體控溫，因?yàn)槿绻麑⑤d玻片浸沒(méi)在液體中，則有可能增加稀有有核細(xì)胞丟失的可能性。
[0130]對(duì)于不同的疾病來(lái)說(shuō)，例如腫瘤、心臟病等，只要其細(xì)胞具備進(jìn)入體液的功能，使用相應(yīng)的特異性探針，即可將其與生物體液性有核細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，增加了鑒定的特異性。該點(diǎn)克服了上皮源標(biāo)志物不具有指向性的缺陷，從而為腫瘤的早期診斷提供了良好的手段。
[0131]而相比于傳統(tǒng)FISH，本方法借助于生物體液性標(biāo)志物，很大程度上減小了假陽(yáng)性的出現(xiàn)率，解決了 CTC鑒別上的難題(圖1)。
[0132]本鑒定技術(shù)不受富集方法的影響，對(duì)于任何一種富集方法所得的非體液性稀有有核細(xì)胞，只要將所得細(xì)胞涂片于載玻片上，均可用該試劑盒來(lái)鑒別。
[0133]另一方面，該方法避開(kāi)上皮標(biāo)志物的使用，能很大程度減小因上皮間皮化而產(chǎn)生的弱陽(yáng)性及假陰性，以及上皮細(xì)胞的假陽(yáng)性污染。
[0134]該手段檢測(cè)到的腫瘤細(xì)胞，結(jié)果清晰，易于觀察，特異性高，為進(jìn)一步研究搭建了良好的平臺(tái)。
[0135]該法由于靈敏度高，對(duì)用血量要求即可降低到3.75ml左右，較FDA通過(guò)的CellSearch? CTC檢測(cè)試劑盒所需的7.5ml血量低，從而進(jìn)一步減少了處理血樣品所耗費(fèi)的人力及物力。
[0136]本方法的標(biāo)本(本申請(qǐng)中所述的標(biāo)本即為待檢測(cè)樣品)來(lái)源為人或其他動(dòng)物的體液。
[0137]優(yōu)選地，本方法的標(biāo)本來(lái)源尤其是指人的體液。
[0138]優(yōu)選地，本方法的標(biāo)本來(lái)源尤其是血液。
[0139]本方法不需對(duì)標(biāo)本進(jìn)行任何處理，如消除外源性蛋白酶、RNA等，從而減小了損失細(xì)胞的可能性，同時(shí)也利于最大程度地保存生物體液的標(biāo)志物。
[0140]后期鑒定方法標(biāo)志性較強(qiáng)，很大程度上排除了主觀上的干擾，能夠相對(duì)客觀地評(píng)價(jià)出非生物性稀有有核細(xì)胞。
[0141]除此之外，該方法耗時(shí)相對(duì)較短，整個(gè)操作過(guò)程可控制在2小時(shí)內(nèi)完成。
[0142]本發(fā)明的方法的優(yōu)點(diǎn)在于，是針對(duì)同一標(biāo)本，在一次系統(tǒng)性結(jié)合性的操作中完成FISH與免疫熒光染色，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)置兩種方法的處理順序，最后同時(shí)觀察這兩種處理結(jié)果，而不是分次完成，分別觀察上述兩種結(jié)果。
[0143]相對(duì)于目前市場(chǎng)上已有的商品化鑒別方法而言，本方法將處理特異性稀有有核細(xì)胞的熒光原位雜交(FISH)方法與處理體液性有核細(xì)胞的免疫熒光染色進(jìn)行了良好的結(jié)合，針對(duì)同一張標(biāo)本片進(jìn)行系統(tǒng)的結(jié)合性處理，能同時(shí)并清晰地觀察到這兩種標(biāo)志物。避免了分開(kāi)使用上述兩種方法處理同一標(biāo)本，導(dǎo)致的細(xì)胞丟失及傷害的可能性，不需通過(guò)重復(fù)定位來(lái)找尋第一次處理所得的目標(biāo)細(xì)胞，從而使鑒別的靈敏度、特異性、觀察速度均有了很大提高，且已被證明成本低、效率高、耗時(shí)短，能夠滿足檢測(cè)稀有有核細(xì)胞的需要。
[0144]實(shí)施例
[0145]實(shí)施例中使用的材料以及來(lái)源
【權(quán)利要求】
1.一種對(duì)非體液性稀有有核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的方法，其包括: a.用重固定劑重固定待檢測(cè)樣品， b.在步驟a之后，使用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體和非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針處理待檢測(cè)樣品， c.讀片，例如在顯微鏡下讀取處理結(jié)果。
2.權(quán)利要求1的檢測(cè)方法，其中所述待檢測(cè)樣品是從生物體液富集非體液性稀有有核細(xì)胞獲得的樣品。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述非體液性稀有有核細(xì)胞是體液中非體液性質(zhì)的稀有有核細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物是用于免疫熒光技術(shù)的標(biāo)志物，包括:CD3、CD31、CD34、CD45、CD50、CD69、CD84,或 CD102。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針是用于熒光原位雜交(FISH)的探針。
6.權(quán)利要求1的方法，步驟b為以下的任一種: (i):先用體液性細(xì) 胞表面標(biāo)志物的抗體處理，再用非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針處理； (?):先用非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針處理，再用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體處理； (iii):同時(shí)使用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體和非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針處理； (iv):交替使用體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體和非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針處理，或包含(i)至(iii)中兩種、三種或四種的組合。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述重固定劑選自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸鈾、鉻酸、苦味酸，或其組合，優(yōu)選為多聚甲醛為0.2-8% (W/V)，更優(yōu)選0.8-5%多聚甲醛，最優(yōu)選1.0-4%多聚甲醛。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法用于非治療用途。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述非治療用途包括:用于科研目的的非體液性稀有有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，用于非體液性稀有有核細(xì)胞遺傳信息的研究平臺(tái)。
10.一種用于檢測(cè)稀有細(xì)胞的試劑盒，其包括:1.)體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物的抗體；i1.)非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針；和ii1.)重固定劑。
11.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述體液性細(xì)胞表面標(biāo)志物是用于免疫熒光技術(shù)的標(biāo)志物。
12.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述非體液性稀有有核細(xì)胞的特異性探針是用于熒光原位雜交技術(shù)的探針。
13.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述用于免疫熒光技術(shù)的標(biāo)志物為血源性細(xì)胞表面標(biāo)志物。
14.權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述用于熒光原位雜交技術(shù)的探針為所述非體液性稀有有核細(xì)胞特異性的核酸探針。
15.權(quán)利要求10的試劑盒，其還包括說(shuō)明書，其中所述說(shuō)明書中記載前述權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法。
16.權(quán)利要求10的試劑盒，其中所述重固定劑選自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸鈾、鉻酸、苦味酸，或其組合，優(yōu)選為多聚甲醛為0.2-8% (W/V)，更優(yōu)選0.8-5%多聚甲醛，最優(yōu)選1.0-4%多聚甲醛。
17.一種稀有細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)，其能夠進(jìn)行權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法，和/或能夠使用權(quán)利要求10至16中任一項(xiàng)的試劑盒處理待檢測(cè)樣品。
18.權(quán)利要求17的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)是自動(dòng)化系統(tǒng)。
19.權(quán)利要求10至16中任一項(xiàng)的試劑盒用于權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法中的用途。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104007257SQ201310057307
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2013年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月24日
【發(fā)明者】詹廳 申請(qǐng)人:北京萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司