納米銀團(tuán)簇在檢測次氯酸含量的應(yīng)用及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測次氯酸含量的方法，以納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，通過熒光光譜法檢測次氯酸含量。本發(fā)明將具有熒光性的納米銀團(tuán)簇應(yīng)用到次氯酸的定量檢測中，利用次氯酸將納米銀團(tuán)簇氧化而造成納米銀團(tuán)簇的熒光猝滅的原理，以納米銀團(tuán)簇溶液為探針，通過控制溶液的pH、納米銀團(tuán)簇的量以及熒光強(qiáng)度的測量等步驟實(shí)現(xiàn)對次氯酸的定量檢測。
【專利說明】納米銀團(tuán)簇在檢測次氯酸含量的應(yīng)用及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種熒光檢測方法，具體而言是一種將納米銀團(tuán)簇作為熒光探針應(yīng)用于檢測氯酸含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]有機(jī)生命體在有氧新陳代謝過程中會產(chǎn)生次氯酸自由基(HC10)。這種內(nèi)源性次氯酸是在髓過氧化物酶(myeloperoxidase，ΜΡ0)催化下，通過過氧化氫氧化體內(nèi)的氯離子而產(chǎn)生的。在人體日常的新陳代謝過程中，次氯酸起著重要的作用，例如宿主防御、殺死入侵體內(nèi)的病原體等。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，體內(nèi)次氯酸的含量也被作為一種病理指標(biāo)，用于一些像老年癡呆癥、動脈粥樣硬化、炎癥、心血管疾病、癌癥器官移植排斥反應(yīng)等疾病的分析。因此，生命體系中次氯酸的檢測對于上述多種疾病的防治具有重要的意義。在疾病的早期診斷、治療以及生命科學(xué)的研究中需要準(zhǔn)確的獲得次氯酸的濃度。
[0003]熒光光譜測定法具有靈敏度高、方法簡單、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在測定離子方面尤其是生物體內(nèi)的離子含量方面展現(xiàn)出重要的應(yīng)用價值。
[0004]近年來，一些基于有機(jī)染料被次氯酸氧化從而造成其熒光猝滅或者產(chǎn)生的原理而被開發(fā)成為熒光探針用于次氯酸的檢測的文獻(xiàn)和專利已有報道。然而這些有機(jī)熒光探針也有一些缺點(diǎn)，例如:熒光激發(fā)光譜窄、寬發(fā)射峰、熒光穩(wěn)定性差、斯托克位移小、對氧敏感、容易光漂白等。
[0005]半導(dǎo)體量子點(diǎn)(QDs)作為一種新型的熒光納米材料具有很多獨(dú)特且優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，如耐光漂白能力強(qiáng)、化學(xué)穩(wěn)定性好、吸收光譜寬、發(fā)射光譜窄、發(fā)射波長可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，可以避免有機(jī)熒光探針的缺點(diǎn)。目前，研究人員們發(fā)現(xiàn)具有核殼結(jié)構(gòu)的硒化鎘(CdSe)半導(dǎo)體量子點(diǎn)的熒光發(fā)射強(qiáng)度對次氯酸存在很強(qiáng)的敏感性，因此已經(jīng)被開發(fā)成為一種熒光探針用于細(xì)胞及生物體內(nèi)的次氯酸濃度的檢測。然而，半導(dǎo)體量子點(diǎn)也存在一些缺點(diǎn)，例如:毒性較大、尺寸較大(通常為10?20 nm)、強(qiáng)分子冥律間歇現(xiàn)象等。這些缺點(diǎn)也限制了其在生物領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。
[0006]因此，我們需要一種操作簡單、成本較低的方法用于樣品中次氯酸的檢測。該方法不僅可以克服傳統(tǒng)熒光染料激發(fā)光譜窄、斯托克位移小、光穩(wěn)定性差、激發(fā)波長受限等不足之處，還具有半導(dǎo)體量子點(diǎn)所不具有的優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出一種采用無毒，且生物相容性好的納米銀團(tuán)簇作為探針，用于檢測生命體系中次氯酸濃度的新方法。該方法的特點(diǎn)是:簡單、易于操作，對次氯酸的定量檢測具有良好的靈敏性和選擇性。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案是:
一種檢測次氯酸含量的方法，以納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，通過熒光光譜檢測次氯酸含量。[0009]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述方法是:取0.2 ml-0.5 ml pH值為7.4的納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，在PH值為7.4的緩沖溶液下與待測溶液混合并靜置15~30 min，用熒光光譜儀在37°C下檢測混合溶液在637 nm處的熒光強(qiáng)度。
[0010]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述熒光光譜儀的激發(fā)波長設(shè)置為510 nm、激發(fā)狹縫寬度為2 nm、發(fā)射狹縫寬度為3 nm 。
[0011]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述緩沖溶液為PBS緩沖溶液。
[0012]在本發(fā)明一較優(yōu)實(shí)施例中，提供一種檢測次氯酸含量的方法，所述方法具體包括:
(1)制備納米銀團(tuán)簇溶液:
以聚甲基丙烯酸鈉為模板，以硝酸銀溶液為銀源，兩者混合后將所得混合液PH值調(diào)節(jié)為4.5 ;然后，將所述混合液置于紫外燈下并不斷攪拌，用365 nm的紫外光進(jìn)行照射70min,獲得具有強(qiáng)熒光的水溶性納米銀團(tuán)簇溶液；調(diào)節(jié)獲得的納米銀團(tuán)簇溶液的pH值為7.4；
(2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并獲得線性回歸方程式
取0.2 ml-0.5 ml步驟(1)獲得的pH值為7.4的納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，在pH值為7.4的PBS緩沖溶液緩沖條件下，與次氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液混合；調(diào)節(jié)混合液中次氯酸的濃度依次為:0、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 μ mol/L ;靜置 15~30 min 后，用熒光光譜儀在 37°C下分別檢測上述各混合液在637 nm處熒光強(qiáng)度，獲得相對熒光強(qiáng)度與次氯酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得熒光強(qiáng)度與次氯酸濃度的線性回歸方程式；
(3)檢測
取0.2 ml-0.5 ml pH值為7.4的納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，在pH值為7.4的緩沖溶液下與待測溶液混合并靜置15~30 min，用熒光光譜儀在37°C下檢測混合溶液在637 nm處的熒光強(qiáng)度；
(4)計算
將步驟(3)檢測到的熒光強(qiáng)度代入步驟(2)獲得的線性回歸方程式，計算得到待測溶液的次氯酸濃度；
所述熒光光譜儀的激發(fā)波長設(shè)置為510 nm、激發(fā)狹縫寬度為2 nm、發(fā)射狹縫寬度為3nm。
[0013]本發(fā)明還提供納米銀團(tuán)簇在檢測次氯酸含量的應(yīng)用。
[0014]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述應(yīng)用是以納米銀團(tuán)簇作為探針，通過熒光光譜測定法檢測次氯酸含量。
[0015]在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述應(yīng)用是以pH值為7.4的納米銀團(tuán)簇作為探針，與待測溶液混合獲得混合液，用熒光光譜儀在37 °C下檢測所述混合液在637 nm處的熒光強(qiáng)度。
[0016]本發(fā)明將具有熒光性的納米銀團(tuán)簇應(yīng)用到次氯酸的定量檢測中，利用次氯酸將納米銀團(tuán)簇氧化而造成納米銀團(tuán)簇的熒光猝滅的原理，以納米銀團(tuán)簇溶液為探針，通過控制溶液的pH、納米銀團(tuán)簇的量以及熒光強(qiáng)度的測量等步驟實(shí)現(xiàn)對次氯酸的定量檢測。
[0017]本發(fā)明提供的方法具有探針制備簡單、對環(huán)境沒有毒害、檢測方法快速簡便、檢測靈敏性好、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，克服了以熒光有機(jī)染料為探針存在的激發(fā)光譜窄、斯托克位移小、光穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。同時，本發(fā)明提供的方法與現(xiàn)有技術(shù)中以半導(dǎo)體量子點(diǎn)為探針檢測次氯酸的方法相比，銀比半導(dǎo)體的生物相容性更好，毒性也更低，并且銀與次氯酸作用后生成的銀離子會與氯離子形成氯化銀，而非半導(dǎo)體量子點(diǎn)生成具有毒性的重金屬鎘離子，更適合應(yīng)用到生物領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1:pH為7.4條件下，含有不同濃度次氯酸的熒光納米銀團(tuán)簇溶液的熒光光譜圖(從上到下次氯酸鈉的濃度依次為:0、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 μ mol/L)。激發(fā)波長為 510 nm。
[0019]圖2:pH為7.4條件下，納米銀團(tuán)簇的熒光強(qiáng)度與次氯酸濃度的線性關(guān)系圖。激發(fā)波長為510 nm。其中Itl為不含次氯酸鈉時納米銀團(tuán)簇在637 nm處的熒光強(qiáng)度，I為含有一定濃度的次氯酸鈉時，納米銀團(tuán)簇在637 nm處的熒光強(qiáng)度。
[0020]圖3:pH為7.4條件下，不同自由基對納米銀熒光強(qiáng)度的影響。
[0021]圖4:pH為7.4條件下，不同陰(A)陽(B)離子對納米銀熒光強(qiáng)度的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做詳細(xì)的說明，實(shí)施例旨在解釋而非限定本發(fā)明的技術(shù)
方案。
[0023]實(shí)施例1確定檢測熒光強(qiáng)度
在本實(shí)施例中，以納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，檢測不同標(biāo)準(zhǔn)濃度次氯酸溶液在560-800nm處的熒光強(qiáng)度，獲得熒光光譜圖，從而確定熒光光譜測定法的檢測熒光波長。具體步驟為:
(I)納米銀團(tuán)簇和次氯酸溶液的配制 ①PH值為7.4的納米銀團(tuán)簇溶液
用移液管準(zhǔn)確移取24 ml新鮮配制的0.05 mol/L的硝酸銀溶液于燒杯中，在攪拌的情況下加入3 ml 0.8 mol/L的聚丙烯酸鈉溶液，并用硝酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH值為4.5。在避光的條件下將混合溶液攪拌10 min，使Ag+與羧酸根充分絡(luò)合。然后，將混合溶液置于365 nm紫外燈下進(jìn)行照射，并不斷攪拌，每隔10 min對混合溶液進(jìn)行紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的測量。取熒光最強(qiáng)時的光照時間為最佳反應(yīng)時間。反應(yīng)完成后，將得到的納米銀團(tuán)簇溶液稀釋到30 ml，并用硝酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為7.4。最后將制備的納米銀團(tuán)簇溶液在避光的條件下儲存在4°C的冰箱中。
[0024]②次氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液
用移液槍量取適量的市售次氯酸鈉溶液，用重蒸水稀釋后，調(diào)節(jié)溶液的PH值為12。然后用紫外-可見分光光度計測溶液在292 nm處的紫外吸收，根據(jù)ε 292= 350 M4cnT1計算得到次氯酸鈉的濃度，然后再稀釋到1.0X10_4mOl/L，放于避光處備用。次氯酸鈉在中性條件下的水溶液中會自發(fā)的發(fā)生酸堿平衡移動而形成次氯酸。
[0025](2)繪制熒光光譜圖
取0.2 ml-0.5 ml pH值為7.4的納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，在pH值為7.4的PBS緩沖溶液緩沖條件下，與適量次氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，并用重蒸水稀釋至5.0 ml，使混合液中次氯酸鈉的濃度依次為:0、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 μ mol/L。將上述混合液靜置15~30min后，用熒光光譜儀在37 °C下分別檢測上述各混合液在56(T800 nm處的熒光強(qiáng)度，所述熒光光譜儀的激發(fā)波長設(shè)置為510 nm、激發(fā)狹縫寬度為2 nm、發(fā)射狹縫寬度為3 nm。
[0026]從而獲得如圖1所示的熒光光譜圖。由圖1確定本發(fā)明的熒光光譜測定法的檢測熒光波長為637 nm。
[0027]實(shí)施例2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 在本實(shí)施例中，以納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，檢測不同標(biāo)準(zhǔn)濃度次氯酸溶液在637 nm處的熒光強(qiáng)度，獲得熒光強(qiáng)度與次氯酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體步驟為:
以實(shí)施例1步驟(1)的方法制備納米銀團(tuán)簇溶液和次氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0028]取0.2 ml-0.5 ml pH值為7.4的納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，在pH值為7.4的PBS緩沖溶液緩沖條件下，與適量次氯酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，并用重蒸水稀釋至5.0 ml，使混合液中次氯酸鈉的濃度依次為:0、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 μ mol/L。將上述混合液靜置15^30 min后，用熒光光譜儀在37 °C下分別檢測上述各混合液在637 nm處熒光強(qiáng)度，所述熒光光譜儀的激發(fā)波長設(shè)置為510 nm、激發(fā)狹縫寬度為2 nm、發(fā)射狹縫寬度為3 nm。其中Itl為不含次氯酸鈉時納米銀團(tuán)簇在637 nm處的熒光強(qiáng)度，I為含有一定濃度的次氯酸鈉時，納米銀團(tuán)簇在637 nm處的熒光強(qiáng)度。計算及繪圖時取3次測量的平均值。
[0029]從而獲得如圖2所示的相對熒光強(qiáng)度與次氯酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)圖2所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程式y(tǒng)=_0.0386x-0.1630，R2=0.9944。
[0030]實(shí)施例3檢驗不同自由基對納米銀團(tuán)簇探針熒光強(qiáng)度的影響
在本實(shí)施例中，檢測不同自由基對納米銀團(tuán)簇探針熒光強(qiáng)度的影響。各溶液的配制方法如下。
[0031](I)過氧化氫溶液的配制:用移液槍量取適量的有市售的過氧化氫溶液，用重蒸水稀釋后，用紫外-可見分光光度計測其在230 nm處的紫外吸收，根據(jù)ε 23(|= 81 M4cnT1計算得到過氧化氫的濃度，然后再將其稀釋到1.0 X IO-4 mol/L,放于避光處備用。
[0032](2)羥基自由基(.0H)溶液的配制:首先按照上述方法配制2.0X 10_3 mol/L的過氧化氫溶液，然后再與2.0X 10_4 mol/L的硫酸亞鐵溶液按體積比1:1混合，即可得到濃度為1.0 X 10_4 mol/L的羥基自由基溶液，放于避光處備用。
[0033](3) I, 1- 二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液的配制:準(zhǔn)確稱取35 mg DPPH，加入無水乙醇充分溶解，定容于100 ml棕色容量瓶中，得到暗紫色均一的1.0X10_4 mol/L的DPPH溶液，放于4 V冰箱中避光保存。
[0034]取0.2 ml-0.5 ml pH值為7.4的納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，在pH值為7.4的PBS緩沖溶液緩沖條件下，分別與適量過氧化氫溶液、羥基自由基溶液、DPPH溶液、四丁基氫氧化膦(TBPH)溶液混合，并用重蒸水稀釋至5.0 ml，使混合液中各自由基的濃度為16 μ mol/L。將上述混合液靜置15~30 min后，用熒光光譜儀在37 °C下分別檢測上述各混合液在637nm處熒光強(qiáng)度，所述熒光光譜儀的激發(fā)波長設(shè)置為510 nm、激發(fā)狹縫寬度為2 nm、發(fā)射狹縫寬度為3 nm。繪圖時取3次測量的平均值。其中Itl為不含上述各自由基時納米銀團(tuán)簇在637 nm處的熒光強(qiáng)度，I為含有一定濃度的上述各自由基時，納米銀團(tuán)簇在637 nm處的熒光強(qiáng)度。
[0035]從而獲得如圖3所示的pH為7.4條件下，不同自由基對納米銀團(tuán)簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響。由圖3可以看出，不同自由基納米銀團(tuán)簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響并不大，對于本發(fā)明檢測次氯酸的干擾很小。
[0036]實(shí)施例4不同陰(A)陽(B)離子對納米銀團(tuán)簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響。
[0037]在本實(shí)施例中，考察人體所含常規(guī)離子對納米銀團(tuán)簇探針熒光強(qiáng)度的影響。主要考察Cl' NO3' SO4' H2PO4' Na+、K+、Ca2+、Mg2+離子對納米銀團(tuán)簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響。
[0038]首先與實(shí)施例3相似的，先配置離子濃度分別為1.0X 10_3 mol/L的溶液。然后取
0.2 πιmΟ.5 ml pH值為7.4的納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，在pH值為7.4的PBS緩沖溶液緩沖條件下，分別與適量上述各離子溶液混合，并用重蒸水稀釋至5.0 ml，使混合液中各離子的濃度為1.0X 10_4 mol/L和16 μ mol/L。將上述混合液靜置15~30 min后，用熒光光譜儀在37 °C下分別檢測上述各混合液在637 nm處熒光強(qiáng)度，所述熒光光譜儀的激發(fā)波長設(shè)置為510 nm、激發(fā)狹縫寬度為2 nm、發(fā)射狹縫寬度為3 nm。繪圖時取3次測量的平均值。
[0039]從而獲得如圖4所示的pH為7.4條件下，不同離子對納米銀團(tuán)簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響。由圖4可以看出，生物體組織液中的鹽溶液(例如氯化鈉、氯化鉀等)的存在不會影響本發(fā)明對于次氯酸的檢測。
[0040]實(shí)施例5應(yīng)用
在本實(shí)施例中，應(yīng)用本發(fā)明提供的方法，對一待測液體進(jìn)行檢測，具體檢測步驟如下:以實(shí)施例1步驟(1)的方法制備pH值為7.4的納米銀團(tuán)簇溶液。取0.2 πιmΟ.5 ml所述納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，在pH值為7.4的緩沖溶液下與待測溶液混合并靜置15~30min，用熒光光譜儀在37 °C下檢測混合溶液在637 nm處的熒光強(qiáng)度。所述熒光光譜儀的激發(fā)波長設(shè)置為510 nm、激發(fā)狹縫寬度為2 nm、發(fā)射狹縫寬度為3 nm。通過實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程計算獲得待測液體中次氯酸的含量。
[0041]本發(fā)明將具有熒光性的納米銀團(tuán)簇應(yīng)用到次氯酸的定量檢測中，利用次氯酸將納米銀團(tuán)簇氧化而造成納米銀團(tuán)簇的熒光猝滅的原理，以納米銀團(tuán)簇溶液為探針，通過控制溶液的pH、納米銀團(tuán)簇的量以及熒光強(qiáng)度的測量等步驟實(shí)現(xiàn)對次氯酸的定量檢測。
[0042]本發(fā)明提供的方法具有探針制備簡單、對環(huán)境沒有毒害、檢測方法快速簡便、檢測靈敏性好、選擇性高等優(yōu) 點(diǎn)，克服了以熒光有機(jī)染料為探針存在的激發(fā)光譜窄、斯托克位移小、光穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。同時，本發(fā)明提供的方法與現(xiàn)有技術(shù)中以半導(dǎo)體量子點(diǎn)為探針檢測次氯酸的方法相比，銀比半導(dǎo)體的生物相容性更好，毒性也更低，并且銀與次氯酸作用后生成的銀離子會與氯離子形成氯化銀，而非半導(dǎo)體量子點(diǎn)生成具有毒性的重金屬鎘離子，更適合應(yīng)用到生物領(lǐng)域。
[0043]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干改變、改進(jìn)和潤飾，這些改變、改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測次氯酸含量的方法，其特征在于，所述方法是以納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，通過熒光光譜檢測次氯酸含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是:取0.2 ml、.5 ml pH值為7.4的納米銀團(tuán)簇溶液作為探針，在pH值為7.4的緩沖溶液下與待測溶液混合并靜置15?30min，用熒光光譜儀在37 °C下檢測混合溶液在637 nm處的熒光強(qiáng)度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述熒光光譜儀的激發(fā)波長設(shè)置為510nm、激發(fā)狹縫寬度為2 nm、發(fā)射狹縫寬度為3 nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述緩沖溶液為PBS緩沖溶液。
5.納米銀團(tuán)簇在檢測次氯酸含量的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是以納米銀團(tuán)簇作為探針，通過熒光光譜檢測次氯酸含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是以pH值為7.4的納米銀團(tuán)簇作為探針，與待測溶液混合獲得混合液，用熒光光譜儀在37°C下檢測所述混合液在637nm處的突光強(qiáng)度。
【文檔編號】G01N21/64GK103940788SQ201310017205
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月17日
【發(fā)明者】安學(xué)勤, 黃文學(xué) 申請人:華東理工大學(xué)