熒光粒子的檢測(cè)方法
【專利摘要】一種熒光粒子的檢測(cè)方法，其包括：調(diào)制包含熒光粒子和促進(jìn)前述熒光粒子從三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的試樣溶液；以及計(jì)數(shù)調(diào)制的試樣溶液中存在的熒光粒子的分子數(shù)。計(jì)數(shù)前述熒光粒子的分子數(shù)包括如下工序：使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)，在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置；一邊在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置，一邊檢測(cè)由前述光檢測(cè)區(qū)域中的前述熒光粒子發(fā)出的光信號(hào)，逐個(gè)檢測(cè)前述熒光粒子；和將前述逐個(gè)檢測(cè)到的熒光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)數(shù)前述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)到的前述熒光粒子的個(gè)數(shù)的工序。
【專利說(shuō)明】熒光粒子的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使用共聚焦顯微鏡、或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)等能夠檢測(cè)來(lái)自溶液中的微小區(qū)域的光的光學(xué)體統(tǒng)而檢測(cè)熒光粒子的方法。
[0002]本申請(qǐng)基于2011年8月12日在日本提交的日本特愿2011-176699號(hào)主張優(yōu)先權(quán)，本文援引其內(nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0003]隨著近年來(lái)光學(xué)測(cè)量技術(shù)的發(fā)展，使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和能夠進(jìn)行光子計(jì)數(shù)(單光子檢測(cè))的超高靈敏度的光檢測(cè)技術(shù)，能夠檢測(cè)/測(cè)定單光子或單分子熒光水平的微弱光。因此，提出了使用這樣的微弱光的檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)行生物分子等分子間相互作用或者分子間的結(jié)合/解離反應(yīng)的檢測(cè)的各種裝置或方法。例如，熒光相關(guān)分光分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如，參見(jiàn)專利文獻(xiàn) 1、2、非專利文獻(xiàn)I?3)中，使用激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)，對(duì)于進(jìn)出試樣溶液中的微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子或被熒光標(biāo)記的分子所發(fā)出的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定。由該測(cè)定的熒光強(qiáng)度的自相關(guān)函數(shù)的值確定微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的平均滯留時(shí)間(平移擴(kuò)散時(shí)間)以及滯留的分子個(gè)數(shù)的平均值。基于微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的平均滯留時(shí)間以及滯留的分子個(gè)數(shù)的平均值，實(shí)現(xiàn)取得熒光分子等的運(yùn)動(dòng)速度或大小、濃度這類信息，或者檢測(cè)到分子的結(jié)構(gòu)或大小的變化、分子的結(jié)合/解離反應(yīng)或分散/聚集的各種現(xiàn)象。需要說(shuō)明的是，前述微小區(qū)域是指顯微鏡的激光束被聚光的焦點(diǎn)區(qū)域，被稱為共焦體積。另外，熒光強(qiáng)度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如，專利文獻(xiàn) 3)、光子計(jì)數(shù)直方圖(Photon Counting Histogram:PCH。例如，專利文獻(xiàn)4),與FCS同樣地，生成檢測(cè)到的出入共焦體積內(nèi)的熒光分子等的熒光強(qiáng)度的直方圖。通過(guò)對(duì)該直方圖的分布擬合統(tǒng)計(jì)學(xué)模型式，算出熒光分子等固有的明亮度的平均值和共焦體積內(nèi)滯留的分子個(gè)數(shù)的平均值。根據(jù)上述信息，推測(cè)分子結(jié)構(gòu)或大小的變化、結(jié)合/解離狀態(tài)、分散/聚集狀態(tài)等。此夕卜，專利文獻(xiàn)5、6中提出了:基于使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)測(cè)定出的試樣溶液的熒光信號(hào)的時(shí)程來(lái)檢測(cè)熒光性物質(zhì)的方法。專利文獻(xiàn)7中提出了一種信號(hào)運(yùn)算處理技術(shù)，其用于:使用光子計(jì)數(shù)技術(shù)，測(cè)量在流式細(xì)胞儀內(nèi)流過(guò)的熒光微?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒馕⒘Ｋl(fā)出的微弱光，檢測(cè)液流中或基板上存在的熒光粒子。
[0004]特別是，通過(guò)應(yīng)用FCS、FIDA等、使用了共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)技術(shù)的微小區(qū)域的熒光測(cè)定技術(shù)的方法，測(cè)定所必需的試樣的濃度比以前低得多且可以是微量(每次測(cè)定使用的量最多數(shù)十UL左右)，測(cè)定時(shí)間也大幅地縮短(每次測(cè)定中可重復(fù)進(jìn)行數(shù)次的秒數(shù)量級(jí)時(shí)間的測(cè)定。)。因此，特別在對(duì)于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的研究開(kāi)發(fā)領(lǐng)域中經(jīng)常使用的稀少或高價(jià)的試樣進(jìn)行分析的情況下或者在疾病的臨床診斷、生理活性物質(zhì)的篩選等被檢體多的情況下，這些技術(shù)與現(xiàn)有的生物化學(xué)的方法相比較，可以期待能夠成為低廉或迅速地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或檢測(cè)的強(qiáng)有力的工具。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)[0006]專利文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2005-098876號(hào)公報(bào)
[0008]專利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2008-292371號(hào)公報(bào)
[0009]專利文獻(xiàn)3:日本專利第4023523號(hào)公報(bào)
[0010]專利文獻(xiàn)4:國(guó)際公開(kāi)第08/080417號(hào)公報(bào)
[0011]專利文獻(xiàn)5:日本特開(kāi)2007-20565號(hào)公報(bào)
[0012]專利文獻(xiàn)6:日本特開(kāi)2008-116440號(hào)公報(bào)
[0013]專利文獻(xiàn)7:日本特開(kāi)平4-337446號(hào)公報(bào)
[0014]非專利文獻(xiàn)
[0015]非專利文獻(xiàn)1:金城政孝、蛋白質(zhì)核酸酵素、1999年、第44卷、第9號(hào)、第1431?1438 頁(yè)。
[0016]非專利文獻(xiàn)2:Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy>R.Rigler編、Springer、柏林、2000 年、第 204 ?224 頁(yè)。
[0017]非專利文獻(xiàn)3:加藤則子等4名、遺伝子醫(yī)學(xué)、2002年、第6卷、第2號(hào)、第271?277 頁(yè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018]發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0019]上述FCS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)簡(jiǎn)而言之是通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)算所測(cè)量的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間波動(dòng)的大小，根據(jù)該波動(dòng)的大小確定在試樣溶液中的微小區(qū)域內(nèi)出入的熒光分子等的各種特性。因此，為了在上述的光分析技術(shù)中得到有意義的結(jié)果，作為試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度優(yōu)選調(diào)整成在平衡狀態(tài)下在秒數(shù)量級(jí)長(zhǎng)度的一次檢測(cè)時(shí)間內(nèi)有能夠統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的個(gè)數(shù)的熒光分子等出入微小區(qū)域內(nèi)。作為試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象的熒光分子等的濃度或數(shù)密度優(yōu)選調(diào)制成在平衡狀態(tài)下、在微小區(qū)域內(nèi)經(jīng)常地存在有一個(gè)左右的熒光分子等。典型地，共焦體積的體積成為IfL左右，所以，熒光分子等的濃度優(yōu)選為InM左右或其以上。換言之，試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度大幅低于能夠統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的程度時(shí)，例如，大幅地低于InM時(shí)，產(chǎn)生檢測(cè)時(shí)間內(nèi)只有稀少的觀測(cè)對(duì)象物進(jìn)入微小區(qū)域內(nèi)的狀態(tài)，熒光強(qiáng)度的檢測(cè)結(jié)果中長(zhǎng)期包括著觀測(cè)對(duì)象物在微小區(qū)域內(nèi)完全不存在的狀態(tài)。并且，顯著的熒光強(qiáng)度的觀測(cè)量變少，通過(guò)如上述的基于熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)學(xué)波動(dòng)的光分析技術(shù)難以獲得有意義的或精度良好的分析結(jié)果。
[0020]專利文獻(xiàn)5、6中所述的、使用共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的熒光性物質(zhì)的檢測(cè)方法中公開(kāi)有:不進(jìn)行如上述的涉及熒光強(qiáng)度波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，根據(jù)數(shù)秒的測(cè)量時(shí)間內(nèi)有無(wú)顯著強(qiáng)度的熒光信號(hào)的產(chǎn)生，判斷試樣中的觀測(cè)對(duì)象的熒光分子等的有無(wú)，而得到顯著強(qiáng)度的熒光信號(hào)的頻率與試樣中的熒光分子等的粒子數(shù)的相關(guān)性。特別是在專利文獻(xiàn)6中，提出了產(chǎn)生攪拌試樣溶液的隨機(jī)流動(dòng)時(shí)，檢測(cè)靈敏度提高。然而，即便這些方法，也只停留在檢測(cè)通過(guò)擴(kuò)散或隨機(jī)的流動(dòng)概率地進(jìn)入微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的存在，不能把握微小區(qū)域內(nèi)的熒光分子等的粒子行為，并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)例如:粒子的計(jì)數(shù)、定量地算出粒子的濃度或數(shù)密度。另外，專利文獻(xiàn)7中記載的技術(shù)是逐個(gè)檢測(cè)流式細(xì)胞儀的液流中的熒光微?；蚬潭ㄔ诨迳系臒晒馕⒘５拇嬖诘募夹g(shù)。專利文獻(xiàn)7中記載的技術(shù)不是用于檢測(cè)試樣溶液中在通常的狀態(tài)下溶解或分散的分子或膠體等粒子，即，不是用于對(duì)于在試樣溶液中隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。因此，并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)定量地算出在試樣溶液中溶解或分散的粒子的濃度或數(shù)密度。另外，專利文獻(xiàn)7的技術(shù)包含流式細(xì)胞儀中的測(cè)量或者熒光粒子向基板上的固定化處理的過(guò)程，因此可以認(rèn)為，檢測(cè)所需要的試樣量遠(yuǎn)大于FCS、FIDA、PCH等的光分析技術(shù)的情況，并且對(duì)實(shí)施者要求復(fù)雜的高難度的操作技術(shù)。
[0021]從而，本發(fā)明的方式不包含如FCS、FIDA、PCH等光分析技術(shù)中實(shí)行的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。因此，目的在于提供通過(guò)對(duì)于觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度低于這些光分析技術(shù)中處理水平的試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的狀態(tài)或特性能夠進(jìn)行檢測(cè)的新型的光分析技術(shù)，更靈敏地檢測(cè)熒光粒子的方法。
[0022]用于解決問(wèn)題的方案
[0023]為了解決上述問(wèn)題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)試樣溶液中分散并隨機(jī)地運(yùn)動(dòng)的熒光粒子的情況下，通過(guò)使用掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行熒光粒子的檢測(cè)，即便在試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象的粒子的濃度非常低的情況下也能夠靈敏度良好地檢測(cè)熒光粒子；進(jìn)而，通過(guò)在三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的存在下進(jìn)行利用掃描分子計(jì)數(shù)法的檢測(cè)，能夠更高靈敏度地檢測(cè)熒光粒子。
[0024]此處，掃描分子計(jì)數(shù)法是日本特愿2010-044714中提出的新型光分析技術(shù)。
[0025]即，本發(fā)明的一方式提供:
[0026](I) 一種在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的熒光粒子的檢測(cè)方法，其包括:
[0027](a)調(diào)制包含熒光粒子和促進(jìn)前述熒光粒子從三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的試樣溶液的工序；和
[0028](b)算出前述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中存在的熒光粒子的分子數(shù)的工序，
[0029]前述工序(b)中的熒光粒子的分子數(shù)的計(jì)算包括:
[0030]使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序；
[0031]在前述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)前述光檢測(cè)區(qū)域的位置的同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)由前述光檢測(cè)區(qū)域中存在的前述熒光粒子發(fā)出的光信號(hào)，逐個(gè)檢測(cè)前述熒光粒子的工序；和
[0032]通過(guò)將前述逐個(gè)檢測(cè)到的熒光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)數(shù)前述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)期間檢測(cè)到的前述熒光粒子的個(gè)數(shù)的工序。
[0033](2)根據(jù)前述(I)所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，前述試樣溶液中的前述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的濃度為0.1mM?20mM。
[0034](3)根據(jù)前述(I)所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，前述試樣溶液中的前述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的濃度為0.3mM?10mM。
[0035](4)根據(jù)前述(I)所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，前述試樣溶液中的前述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的濃度為0.5mM?5mM。
[0036](5)根據(jù)前述⑴?⑷的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，前述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)為選自碘化鉀和半胱胺的一種以上。
[0037](6)根據(jù)前述(I)?(5)的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，前述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序包括以規(guī)定的速度移動(dòng)前述光檢測(cè)區(qū)域的位置。
[0038](7)根據(jù)前述(I)?(6)的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，前述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序包括以比前述熒光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度更快的速度移動(dòng)前述光檢測(cè)區(qū)域的位置。
[0039](8)根據(jù)前述⑴?(7)的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自每個(gè)前述熒光粒子的光信號(hào)來(lái)逐個(gè)檢測(cè)前述熒光粒子的工序包括根據(jù)檢測(cè)到的按照時(shí)間順序的光信號(hào)的形狀來(lái)檢測(cè)單個(gè)前述熒光粒子向前述光檢測(cè)區(qū)域中的進(jìn)入。
[0040]發(fā)明的效果
[0041]本發(fā)明的熒光粒子的檢測(cè)方法中應(yīng)用的掃描分子計(jì)數(shù)法不實(shí)行計(jì)算熒光強(qiáng)度波動(dòng)這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。因此，通過(guò)本發(fā)明的方式的熒光粒子的檢測(cè)方法，即便試樣中僅極微量地存在作為解析對(duì)象的熒光粒子時(shí)，也能夠檢測(cè)試樣中的前述熒光粒子。進(jìn)而，本發(fā)明的方式的熒光粒子的檢測(cè)方法中，由于利用掃描分子計(jì)數(shù)法在三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的存在下進(jìn)行檢測(cè)，所以能夠非常高靈敏度地檢測(cè)熒光粒子。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1A是用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的示意圖。
[0043]圖1B是共焦體積(共聚焦顯微鏡的觀察區(qū)域)的示意圖。
[0044]圖1C是改變鏡7的方向，在試樣溶液內(nèi)部移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)的示意圖。
[0045]圖2A是說(shuō)明基于用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的光檢測(cè)原理的示意圖。
[0046]圖2B是利用用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的光檢測(cè)中測(cè)量的光強(qiáng)度的時(shí)間變化的示意圖。
[0047]圖3A是觀測(cè)對(duì)象粒子一邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)一邊橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的示意圖。
[0048]圖3B是表示觀測(cè)對(duì)象粒子邊進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)邊橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖。
[0049]圖4A是以快于觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度移動(dòng)試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置、從而觀測(cè)對(duì)象粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的示意圖。
[0050]圖4B是以快于觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度的速度移動(dòng)試樣溶液內(nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置、從而觀測(cè)對(duì)象粒子橫穿光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化的例子的圖。
[0051]圖5是以流程圖的形式顯示根據(jù)掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)的處理次序的圖。
[0052]圖6A是說(shuō)明在根據(jù)通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子計(jì)數(shù)的處理次序中的、檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)處理工序的例子的圖。
[0053]圖6B是說(shuō)明在根據(jù)通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)(光強(qiáng)度)的時(shí)間變化進(jìn)行粒子計(jì)數(shù)的處理次序中的、檢測(cè)信號(hào)的信號(hào)處理工序的例子的圖。
[0054]圖7表示通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法測(cè)量的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的實(shí)測(cè)例(柱狀圖)、和將數(shù)據(jù)平滑化后獲得的曲線(虛線)、和峰存在區(qū)域中擬合的高斯函數(shù)(實(shí)線)。圖中，帶有“噪音”的信號(hào)作為由噪音或雜質(zhì)帶來(lái)的信號(hào)被無(wú)視。
[0055]圖8A是表不參考例I中包含Rhodamine Green(注冊(cè)商標(biāo))的各試樣溶液中的突光分子中的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。[0056]圖8B是表不參考例I中包含Rhodamine Green(注冊(cè)商標(biāo))的各試樣溶液中的突光分子的每一分子的明亮度的圖。
[0057]圖9A是表示參考例I中包含Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488的各試樣溶液中的熒光分子中的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。
[0058]圖9B是表示參考例I中包含Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488的各試樣溶液中的熒光分子中的三重激發(fā)態(tài)的比例、以及熒光分子的每一分子的明亮度CPP的圖。
[0059]圖1OA是表示參考例2中包含Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488的各試樣溶液中的熒光分子中的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。
[0060]圖1OB是表示參考例2中包含Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488的各試樣溶液中的熒光分子的每一分子的明亮度的圖。
[0061]圖1lA是表不參考例2中包含TAMRA(注冊(cè)商標(biāo))的各試樣溶液中的突光分子中的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。
[0062]圖1lB是表不參考例2中包含TAMRA (注冊(cè)商標(biāo))的各試樣溶液中的突光分子的每一分子的明亮度CPP的圖。
[0063]圖12是表不實(shí)施例1中對(duì)于包含Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。
[0064]圖13是表不實(shí)施例2中對(duì)于包含Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。
[0065]圖14是表示實(shí)施例2中對(duì)于包含TAMRA (注冊(cè)商標(biāo))的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。
[0066]圖15是表不實(shí)施例3中對(duì)于Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488的濃度為IpM的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。
[0067]圖16是表示實(shí)施例3中對(duì)于Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488的濃度為IOOpM的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0068]首先，對(duì)掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行說(shuō)明。掃描分子計(jì)數(shù)法為如下技術(shù):一邊通過(guò)微小區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)，一邊當(dāng)在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的發(fā)出光的粒子(以下，稱為“發(fā)光粒子”。)橫穿微小區(qū)域內(nèi)時(shí)，檢測(cè)由微小區(qū)域中的發(fā)光粒子發(fā)出的光。由此，掃描分子計(jì)數(shù)法能夠一個(gè)一個(gè)逐個(gè)檢測(cè)試樣溶液中的發(fā)光粒子，獲得與發(fā)光粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的發(fā)光粒子的濃度或數(shù)密度的相關(guān)信息。與FIDA等光分析技術(shù)同樣地，檢測(cè)所需的試樣可以是微量(例如，數(shù)十μ L左右)，另外測(cè)定時(shí)間短。并且與FIDA等光分析技術(shù)的情況相t匕，對(duì)于更低濃度或數(shù)密度的發(fā)光粒子，可以定量檢測(cè)其濃度或數(shù)密度等特性。
[0069]需要說(shuō)明的是，發(fā)光粒子是指通過(guò)熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、光散射等發(fā)出光的粒子。本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測(cè)方法中，以發(fā)光粒子中的熒光粒子作為檢測(cè)對(duì)象。
[0070]本實(shí)施方式中，共焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的“光檢測(cè)區(qū)域”是指在共焦顯微鏡或多光子顯微鏡中檢測(cè)到光的微小區(qū)域，當(dāng)由物鏡照射照明光時(shí)，相當(dāng)于該照明光聚光的區(qū)域。需要說(shuō)明的是，在共聚焦顯微鏡中，該區(qū)域尤其根據(jù)物鏡與小孔之間的位置關(guān)系確定。[0071]邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置、即通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)邊逐次地進(jìn)行光的檢測(cè)。于是，當(dāng)移動(dòng)的光檢測(cè)區(qū)域包含了與隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子結(jié)合或締合的發(fā)光探針時(shí)，檢測(cè)到來(lái)自發(fā)光探針的光。由此，檢測(cè)到一個(gè)粒子的存在。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的方式，也可以存在如下情況:發(fā)光探針與希望檢測(cè)到的粒子暫時(shí)結(jié)合后，在光的檢測(cè)時(shí)，從粒子解離。接著，在逐次檢測(cè)到的光中逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自發(fā)光探針的光信號(hào)。由此，一個(gè)一個(gè)地逐個(gè)逐次地檢測(cè)粒子或與發(fā)光探針結(jié)合的粒子的存在，能夠得到關(guān)于粒子在溶液內(nèi)的狀態(tài)的各種信息。具體而言，例如，在上述構(gòu)成中，可以計(jì)數(shù)逐個(gè)檢測(cè)到的粒子，從而計(jì)數(shù)在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)中檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)(粒子的計(jì)數(shù))。根據(jù)該構(gòu)成，通過(guò)組合粒子的個(gè)數(shù)與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)量，能夠獲得與試樣溶液中的粒子的數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息。特別是通過(guò)任意手法例如以規(guī)定速度移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置等來(lái)確定光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)軌跡的總體積，就能夠具體計(jì)算粒子的數(shù)密度或濃度。當(dāng)然，并不是直接確定絕對(duì)數(shù)密度值或濃度值，也可以計(jì)算相對(duì)于多個(gè)試樣溶液、或者相對(duì)于成為濃度或數(shù)密度基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)試樣溶液的相對(duì)的數(shù)密度或濃度之比。另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，通過(guò)采用改變光學(xué)系統(tǒng)的光路而移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的構(gòu)成，光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)是迅速的，并且在試樣溶液中實(shí)質(zhì)上不產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)、流體力學(xué)的作用。因此，作為檢測(cè)對(duì)象的粒子能夠不受力學(xué)的作用的影響而以穩(wěn)定的狀態(tài)進(jìn)行光的測(cè)量(在試樣溶液中有振動(dòng)或流動(dòng)作用時(shí)，有粒子的物理性質(zhì)變化的可能性。)。并且，由于流通試樣溶液這樣的構(gòu)成不是必需的，因此能夠用與FCS、FIDA等情況下同樣微量(IyL?數(shù)十μ L左右)的試樣溶液進(jìn)行測(cè)量和分析。
[0072]在上述的逐個(gè)地檢測(cè)粒子的工序中，由逐次檢測(cè)到的光信號(hào)判定與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針是否進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域時(shí)，可以根據(jù)按照時(shí)間順序檢測(cè)到的光信號(hào)的形狀而進(jìn)行。本實(shí)施方式中，典型地，當(dāng)檢測(cè)到具有比規(guī)定閾值大的強(qiáng)度的光信號(hào)時(shí)，能夠檢測(cè)到與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針進(jìn)入了光檢測(cè)區(qū)域。需要說(shuō)明的是，本實(shí)施方式中，與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針包括:一個(gè)發(fā)光探針與一個(gè)粒子結(jié)合的情況；多個(gè)發(fā)光探針與一個(gè)粒子結(jié)合的情況；以及根據(jù)實(shí)驗(yàn)方式的、與一個(gè)粒子結(jié)合之后從粒子解離的發(fā)光探針的情況。
[0073]此外，在上述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，可以根據(jù)與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度，適當(dāng)改變?cè)嚇尤芤簝?nèi)部的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，由與粒子結(jié)合的發(fā)光探針?biāo)鶛z測(cè)到的光的形態(tài)，可能會(huì)根據(jù)其特性或試樣溶液中的數(shù)密度或濃度而改變。特別是，光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度過(guò)快時(shí)，由與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針得到的光量降低，所以為了精度良好或靈敏度良好地測(cè)量來(lái)自與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的光，優(yōu)選適當(dāng)?shù)馗淖児鈾z測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0074]進(jìn)一步，在上述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序中，適當(dāng)?shù)氖菍⒃嚇尤芤簝?nèi)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為高于與作為檢測(cè)對(duì)象的粒子結(jié)合的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度(由布朗運(yùn)動(dòng)造成的粒子的平均移動(dòng)速度)。如上述說(shuō)明，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法，當(dāng)光檢測(cè)區(qū)域通過(guò)存在有與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針的位置時(shí)，檢測(cè)由該發(fā)光探針發(fā)出的光而逐個(gè)檢測(cè)發(fā)光探針。然而，當(dāng)與粒子結(jié)合的發(fā)光探針在溶液中由于布朗運(yùn)動(dòng)而隨機(jī)移動(dòng)，在光檢測(cè)區(qū)域中出入多次時(shí)，多次檢測(cè)到來(lái)自一個(gè)發(fā)光探針的(表示希望檢測(cè)的粒子存在)光信號(hào)，難以將檢測(cè)到的光信號(hào)與一個(gè)希望檢測(cè)的粒子的存在對(duì)應(yīng)起來(lái)。因此，如上述，將光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為高于與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的擴(kuò)散移動(dòng)速度，由此，能夠使與一個(gè)粒子結(jié)合的發(fā)光探針對(duì)應(yīng)于一個(gè)(表示粒子的存在的)光信號(hào)。本實(shí)施方式中，具體而言，將光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度設(shè)定為快于作為檢測(cè)對(duì)象的熒光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度。需要說(shuō)明的是，擴(kuò)散移動(dòng)速度隨著與粒子結(jié)合的發(fā)光探針而改變，所以優(yōu)選如上述那樣根據(jù)與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的特性(特別是擴(kuò)散常數(shù))適當(dāng)改變光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)速度。
[0075]可以以任意方式，進(jìn)行用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的光學(xué)系統(tǒng)的光路改變。
[0076]例如，可以利用激光掃描型光學(xué)顯微鏡中采用的檢流計(jì)鏡改變光路，使光檢測(cè)區(qū)域的位置發(fā)生變化。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可以任意地設(shè)定，也可以選自例如圓形、橢圓形、矩形、直線和曲線。
[0077]掃描分子計(jì)數(shù)法中，其光檢測(cè)機(jī)理自身與FIDA等光分析技術(shù)的情況相同，采取對(duì)來(lái)自共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡的光檢測(cè)區(qū)域的光進(jìn)行檢測(cè)的構(gòu)成，所以試樣溶液的量同樣地可以是微量的。然而，掃描分子計(jì)數(shù)法中，不實(shí)施計(jì)算熒光強(qiáng)度的波動(dòng)這樣的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所以掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)可以適用于粒子的數(shù)密度或濃度比FIDA等光分析技術(shù)所需要的水平大幅地低的試樣溶液。
[0078]另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，在溶液中分散或溶解的每個(gè)粒子被逐個(gè)檢測(cè)出。因此，使用該信息，可以定量地進(jìn)行粒子的計(jì)數(shù)、試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度的計(jì)算、或者取得與濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。即，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法，使通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的粒子與檢測(cè)到的光信號(hào)一一對(duì)應(yīng)，一個(gè)一個(gè)地檢測(cè)出粒子，所以能夠進(jìn)行溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子的計(jì)數(shù)。因此，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法，與以前相比，能夠精度良好地確定試樣溶液中的粒子的濃度或數(shù)密度。實(shí)際上，根據(jù)逐個(gè)檢測(cè)熒光粒子并計(jì)數(shù)其數(shù)目而確定粒子濃度的本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測(cè)方法，即使試樣溶液中的熒光粒子的濃度是比基于通過(guò)熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)量的熒光強(qiáng)度能夠確定的濃度更低的濃度，也能夠檢測(cè)目標(biāo)粒子。
[0079]進(jìn)一步，利用改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、利用光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液中的方式，在不對(duì)試樣溶液產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)或流體力學(xué)作用、試樣溶液內(nèi)部均勻的狀態(tài)或試樣溶液機(jī)械上穩(wěn)定的狀態(tài)下進(jìn)行觀察。因此，例如，與試樣中發(fā)生流動(dòng)的情況相比較，定量檢測(cè)結(jié)果的可靠性提高，另外，對(duì)于試樣溶液中的成為檢測(cè)對(duì)象的粒子，能夠在沒(méi)有力學(xué)作用的影響下或沒(méi)有人為影響的狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)量。需要說(shuō)明的是，對(duì)于試樣引起流動(dòng)時(shí)通常難以引起均勻的流速，并且裝置結(jié)構(gòu)復(fù)雜化。另外，需要的試樣量大幅地增大。進(jìn)而，由流動(dòng)導(dǎo)致的流體力學(xué)的作用，溶液中的粒子、發(fā)光探針或結(jié)合體或者其他的物質(zhì)存在變質(zhì)或變性的可能性。
[0080]<用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置的構(gòu)成>
[0081]可以通過(guò)在基本的構(gòu)成中如圖1A中示意性的示例那樣組合能夠?qū)嵤〧CS、FIDA等的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光檢測(cè)器而構(gòu)成的光分析裝置實(shí)施掃描分子計(jì)數(shù)法。參照?qǐng)D1A，光分析裝置I是由光學(xué)系統(tǒng)2?17、和用于控制光學(xué)系統(tǒng)的各部分的行為并獲得、分析數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)18構(gòu)成的。光分析裝置I的光學(xué)系統(tǒng)可以與通常的共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)同樣，此處，自光源2放射的在單模光纖3內(nèi)傳播的激光(Ex)在光纖的射出端以固有的NA (Numerical Aperture)規(guī)定的角度放射為發(fā)散的光,通過(guò)準(zhǔn)直儀4成為平行光,在分色鏡5、反射鏡6、7處發(fā)生反射，入射至物鏡8。在物鏡8的上方，典型地配置有分注了 I μ L?數(shù)十μ L的試樣溶液的試樣容器或排列有孔10的微孔板9。自物鏡8射出的激光在試樣容器或孔10內(nèi)的試樣溶液中聚集為焦點(diǎn)，形成光強(qiáng)度強(qiáng)的區(qū)域(激發(fā)區(qū)域)。試樣溶液中，分散或溶解有作為觀測(cè)對(duì)象物的粒子、與前述粒子結(jié)合的發(fā)光探針、帶有發(fā)光標(biāo)記(典型地為熒光色素等)的分子。與發(fā)光探針結(jié)合或締合的粒子(根據(jù)實(shí)驗(yàn)的方式，與粒子暫時(shí)結(jié)合后從粒子解離的發(fā)光探針)進(jìn)入激發(fā)區(qū)域時(shí)，發(fā)光探針就在其間被激發(fā)而發(fā)出光。發(fā)出的光(Em)通過(guò)物鏡8、分色鏡5，在鏡11處反射，在聚光鏡12處聚光，通過(guò)小孔13，透過(guò)二次濾片14(此處，只選擇特定的波長(zhǎng)范圍的光成分。)被導(dǎo)入至多模光纖15而到達(dá)光檢測(cè)器16，轉(zhuǎn)換成按照時(shí)間順序的電信號(hào)之后，輸入至計(jì)算機(jī)18，按照后面說(shuō)明的方式實(shí)施用于光分析的處理。需要說(shuō)明的是，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，在上述的構(gòu)成中，小孔13配置于與物鏡8的焦點(diǎn)位置共軛的位置上。由此，僅自圖1B中示意地所示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域即激發(fā)區(qū)域內(nèi)發(fā)出的光通過(guò)小孔13，而來(lái)自激發(fā)區(qū)域以外的光被擋住。圖1B所例示的激光的焦點(diǎn)區(qū)域通常是具有IfL?IOfL左右的實(shí)際體積的、位于本光分析裝置中的光檢測(cè)區(qū)域(典型地，光強(qiáng)度呈現(xiàn)以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)的高斯型分布或洛倫茲型分布。實(shí)際體積是以光強(qiáng)度為l/e2的面為界面的略橢球體的體積。)，被稱為共焦體積。另外，掃描分子計(jì)數(shù)法中，檢測(cè)到來(lái)自一個(gè)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或來(lái)自發(fā)光探針的光，例如，來(lái)自一個(gè)或數(shù)個(gè)熒光色素分子的微弱光，所以光檢測(cè)器16優(yōu)選使用能夠用于光子計(jì)數(shù)的超高靈敏度的光檢測(cè)器。此外，為了改變欲進(jìn)行觀察的孔10，在顯微鏡的平臺(tái)(沒(méi)有圖示)上可以設(shè)有用于移動(dòng)微孔板9的水平方向位置的平臺(tái)位置變化裝置17a?？梢酝ㄟ^(guò)計(jì)算機(jī)18控制平臺(tái)位置變化裝置17a的動(dòng)作。通過(guò)所述的構(gòu)成，即使被檢體為多個(gè)，也能夠?qū)崿F(xiàn)快速的測(cè)量。
[0082]進(jìn)一步，上述的光分析裝置的光學(xué)系統(tǒng)中，設(shè)置有改變光學(xué)系統(tǒng)的光路、通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)部的、即用于在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)焦點(diǎn)區(qū)域(即，光檢測(cè)區(qū)域)的位置的機(jī)構(gòu)。該用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)，例如如圖1C示意性示例的，也可以采用改變反射鏡7的方向的鏡轉(zhuǎn)向器17。所述的鏡轉(zhuǎn)向器17也可以與裝備在普通的激光掃描型顯微鏡中的檢流計(jì)鏡裝置相同。另外，為了實(shí)現(xiàn)預(yù)期的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)模式，鏡轉(zhuǎn)向器17是在計(jì)算機(jī)18的控制下，與通過(guò)光檢測(cè)器16的光檢測(cè)協(xié)調(diào)而被驅(qū)動(dòng)的。光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)軌跡可任意地選自圓形、橢圓形、矩形、直線、曲線或它們的組合(可以從計(jì)算機(jī)18的程序中的各種移動(dòng)模式中選擇。)。需要說(shuō)明的是，圖中沒(méi)有顯示但也可以通過(guò)上下移動(dòng)物鏡8而使光檢測(cè)區(qū)域的位置沿上下方向移動(dòng)。如上所述，若利用的是不移動(dòng)試樣溶液而是改變光學(xué)系統(tǒng)的光路從而移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的構(gòu)成，試樣溶液內(nèi)實(shí)質(zhì)上不發(fā)生機(jī)械振動(dòng)或流體力學(xué)的作用，能夠排除對(duì)于觀測(cè)對(duì)象物的力學(xué)作用的影響，能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的測(cè)量。
[0083]當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過(guò)吸收多光子而發(fā)光時(shí)，上述光學(xué)系統(tǒng)作為多光子顯微鏡使用。在此情況下，僅在激發(fā)光的焦點(diǎn)區(qū)域(光檢測(cè)區(qū)域)中發(fā)出光，所以可以去除小孔13。此外，當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過(guò)化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光現(xiàn)象而不依賴激發(fā)光發(fā)光時(shí)，可以省略用于產(chǎn)生激發(fā)光的光學(xué)系統(tǒng)2?5。當(dāng)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過(guò)磷光或散射發(fā)光時(shí)，直接使用上述共聚焦顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。另外，在光分析裝置I中，可以如圖1A所示那樣設(shè)置多個(gè)激發(fā)光源2，可以根據(jù)用于將粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針激發(fā)的光的波長(zhǎng)，選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光的波長(zhǎng)。同樣地，可以具備多個(gè)光檢測(cè)器16，當(dāng)試樣中包含波長(zhǎng)不同的多種粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針時(shí)，可以根據(jù)波長(zhǎng)分別檢測(cè)來(lái)自它們的光。
[0084]<掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理>
[0085]FIDA等分光分析技術(shù)與以前的生物化學(xué)分析技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)是必需的試樣量非常少，并且可以快速實(shí)施檢查。然而，在FIDA等分光分析技術(shù)中，原理上根據(jù)熒光強(qiáng)度波動(dòng)計(jì)算觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或特性。為了獲得精度良好的檢測(cè)結(jié)果，要求試樣溶液中的觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度是如下水平:在熒光強(qiáng)度測(cè)量中，在光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)總是存在一個(gè)左右的觀測(cè)對(duì)象粒子，在測(cè)量時(shí)間內(nèi)總是檢測(cè)到顯著的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))。如果當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度或數(shù)密度低于上述時(shí)，例如，當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子只是偶爾進(jìn)入光檢測(cè)區(qū)域CV內(nèi)的水平時(shí)，僅在一部分測(cè)量時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)顯著的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))，因而難以以良好的精度計(jì)算光強(qiáng)度的波動(dòng)。此外，在觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度大幅地低于測(cè)量中通常在光檢測(cè)區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)左右的觀測(cè)對(duì)象粒子的水平時(shí)，光強(qiáng)度波動(dòng)的運(yùn)算易受背景的影響，用于獲得對(duì)運(yùn)算而言為充分量的顯著的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)的測(cè)量時(shí)間延長(zhǎng)。與此相對(duì)，即使當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度低于FIDA等分光分析技術(shù)要求的水平時(shí)，用掃描分子計(jì)數(shù)法也能夠檢測(cè)觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度等特性。
[0086]掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)中，作為實(shí)行的處理，直接了當(dāng)?shù)卣f(shuō)，驅(qū)動(dòng)用于移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的機(jī)構(gòu)(鏡偏向器17)而改變光路，如圖2A中示意地描述，一邊在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域CV的位置即利用光檢測(cè)區(qū)域CV掃描試樣溶液內(nèi)，一邊實(shí)施光檢測(cè)。
[0087]如此一來(lái)，例如，如圖2A所示，在光檢測(cè)區(qū)域CV移動(dòng)期間(圖中，時(shí)間t0?t2)，當(dāng)通過(guò)存在有I個(gè)粒子(圖中，發(fā)光探針結(jié)合有熒光色素)的區(qū)域時(shí)(tl)，檢測(cè)到如圖2B所述的顯著的光強(qiáng)度(Em)。如此，實(shí)行上述的光檢測(cè)區(qū)域CV的位置的移動(dòng)和光檢測(cè)，通過(guò)一個(gè)一個(gè)地檢測(cè)在此期間出現(xiàn)的如圖2B所例示的顯著的光強(qiáng)度。由此，逐個(gè)檢測(cè)出與發(fā)光探針結(jié)合的粒子，通過(guò)將其個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，能夠得到與存在于所測(cè)量的區(qū)域內(nèi)的粒子的個(gè)數(shù)或者濃度或數(shù)密度相關(guān)的信息。所述掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的原理中，粒子一個(gè)一個(gè)地被檢測(cè)出且不進(jìn)行如熒光強(qiáng)度波動(dòng)的計(jì)算這類統(tǒng)計(jì)學(xué)運(yùn)算處理。由此，可以認(rèn)為即便是欲觀測(cè)粒子濃度低至無(wú)法用FIDA等以充分精度分析程度的試樣溶液，也能夠得到關(guān)于粒子的濃度或數(shù)密度的信息。
[0088]另外，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法這類逐個(gè)檢測(cè)、計(jì)數(shù)試樣溶液中的粒子的方法，與由通過(guò)熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)量的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時(shí)相比，能夠測(cè)定至更低的濃度。當(dāng)通過(guò)熒光分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀來(lái)檢測(cè)某被熒光標(biāo)記的粒子的濃度時(shí)，通常假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例。然而，該情況下，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度充分地降低時(shí)，噪音信號(hào)的量相對(duì)于由被熒光標(biāo)記的粒子發(fā)出的光的信號(hào)量變大(S/N比惡化)，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光信號(hào)量之間的比例關(guān)系瓦解。結(jié)果，確定的濃度值的精度變得惡化。另一方面，掃描分子計(jì)數(shù)法在由被檢測(cè)的光信號(hào)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的信號(hào)的工序中，從檢測(cè)結(jié)果中排除了噪音信號(hào)，只將對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的信號(hào)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)算濃度。由此，與通過(guò)假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測(cè)濃度時(shí)相比較，能夠檢測(cè)至更低的濃度。
[0089]進(jìn)而還有，當(dāng)一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子結(jié)合有多個(gè)發(fā)光探針時(shí)，與傳統(tǒng)的假定熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而確定濃度的方法相比，掃描分子計(jì)數(shù)法這類對(duì)試樣溶液中的粒子逐個(gè)檢測(cè)、計(jì)數(shù)的方法的情況下，粒子濃度高一側(cè)的粒子濃度的測(cè)量精度提高。在一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子結(jié)合有多個(gè)發(fā)光探針的情況下，向試樣溶液添加某一量的發(fā)光探針時(shí)，觀測(cè)對(duì)象粒子的濃度升高時(shí)，相對(duì)而言與粒子結(jié)合的發(fā)光探針的個(gè)數(shù)降低。在此情況下，由于每一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子的熒光強(qiáng)度降低，因此，被熒光標(biāo)記的粒子的濃度與光量之間的比例關(guān)系瓦解，所確定的濃度值的精度惡化。另一方面，掃描分子計(jì)數(shù)法在由檢測(cè)到的光信號(hào)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的信號(hào)的工序中，每個(gè)粒子的熒光強(qiáng)度的降低的影響少，由粒子數(shù)計(jì)算濃度。因此，與通過(guò)假設(shè)熒光強(qiáng)度與被熒光標(biāo)記的粒子的濃度成比例而檢測(cè)濃度時(shí)相比較，能夠檢測(cè)至更高的濃度。
[0090]<通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法的試樣溶液的光強(qiáng)度的測(cè)定>
[0091]就掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析中的光強(qiáng)度的測(cè)定而言，除了在檢測(cè)中驅(qū)動(dòng)鏡轉(zhuǎn)向器17，在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置(試樣溶液內(nèi)部的掃描)以外，可以以與FCS或FIDA中的光強(qiáng)度檢測(cè)工序相同的方式實(shí)施光強(qiáng)度檢測(cè)。在操作處理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入試樣溶液而載置于顯微鏡的平臺(tái)上之后，使用者對(duì)計(jì)算機(jī)18輸入測(cè)定開(kāi)始的指示。接著，計(jì)算機(jī)18根據(jù)存儲(chǔ)裝置(沒(méi)有圖示)存儲(chǔ)的程序(將用于在試樣溶液內(nèi)移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的光路進(jìn)行改變的次序、和在光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)中檢測(cè)來(lái)自光檢測(cè)區(qū)域的光的次序)，開(kāi)始試樣溶液內(nèi)光檢測(cè)區(qū)域中的激發(fā)光的照射以及光強(qiáng)度的測(cè)量。該測(cè)量中，在根據(jù)計(jì)算機(jī)18的程序的處理操作的控制下，鏡偏向器17驅(qū)動(dòng)鏡7(檢電鏡)，在孔10內(nèi)進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)。與此同時(shí)，光檢測(cè)器16將逐次檢測(cè)到的光轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，傳送給計(jì)算機(jī)18。計(jì)算 機(jī)18以任意方式由送達(dá)的光信號(hào)生成按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)并保存。需要說(shuō)明的是，典型地光檢測(cè)器16為能夠檢測(cè)到單光子到達(dá)的超高靈敏度光檢測(cè)器。由此，光的檢測(cè)是以如下方式進(jìn)行的光子計(jì)數(shù):在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，間隔規(guī)定的單位時(shí)間(ΒΙΝ--ΜΕ)如每10 μ秒逐次地測(cè)量到達(dá)光檢測(cè)器的光子的個(gè)數(shù)，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)可以為按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。
[0092]光強(qiáng)度測(cè)量中的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度可以是任意的，可以為按照適合例如實(shí)驗(yàn)或分析目的的方式設(shè)定的規(guī)定速度。當(dāng)根據(jù)所檢測(cè)到的觀測(cè)對(duì)象粒子的個(gè)數(shù)獲得與其數(shù)密度或濃度相關(guān)的信息時(shí)，光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的大小或體積是必需的。因此，以移動(dòng)距離受掌握的方式進(jìn)行光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)。需要說(shuō)明的是，測(cè)量中的經(jīng)過(guò)時(shí)間與光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)距離成比例關(guān)系的方式，能夠容易地解釋測(cè)定結(jié)果，因此，移動(dòng)速度基本上優(yōu)選為恒定速度，但并非僅限于此。
[0093]此外，為了由測(cè)量的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)逐個(gè)檢測(cè)觀測(cè)對(duì)象粒子，或以良好的精度定量實(shí)施觀測(cè)對(duì)象粒子數(shù)的計(jì)數(shù)，優(yōu)選將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為比觀測(cè)對(duì)象粒子(更嚴(yán)密地，粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針、本實(shí)施方式中為熒光粒子)的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)即布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的移動(dòng)速度更快的值。掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析技術(shù)的觀測(cè)對(duì)象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，由于布朗運(yùn)動(dòng)，位置伴隨著時(shí)間而移動(dòng)。因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度比粒子的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的移動(dòng)慢時(shí)，如圖3Α示意地描述，粒子在區(qū)域內(nèi)隨機(jī)地移動(dòng)。由此，光強(qiáng)度如圖3Β所示隨機(jī)地變化(如已知，光檢測(cè)區(qū)域的激發(fā)光強(qiáng)度以區(qū)域的中心為頂點(diǎn)向外側(cè)降低。)，難以確定對(duì)應(yīng)于各個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子的顯著的光強(qiáng)度的變化。
[0094]此處，將光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度優(yōu)選設(shè)定為快于粒子的布朗運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的平均的移動(dòng)速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)，從而如圖4Α所示使粒子略直線地橫穿光檢測(cè)區(qū)域。因此，按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，如圖4Β例示，對(duì)應(yīng)于各個(gè)粒子的光強(qiáng)度變化的分布圖大致一致，能夠容易地確定各個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子與光強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)。粒子略直線地通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域的情況下，光強(qiáng)度變化的曲線與激發(fā)光強(qiáng)度分布幾乎相同。
[0095]具體而言，由于布朗運(yùn)動(dòng)，具有擴(kuò)散系數(shù)D的觀測(cè)對(duì)象粒子(更嚴(yán)密的是，粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體，或與粒子結(jié)合后再分解、游離的發(fā)光探針)通過(guò)半徑Wo的光檢測(cè)區(qū)域(共焦體積)時(shí)所需的時(shí)間At是由均方位移的關(guān)系式如下所示。
[0096](2Wo)2 = 6D.At...(I)
[0097]根據(jù)
[0098]At = (2ffo)2/6D— (2) [0099]觀測(cè)對(duì)象粒子通過(guò)布朗運(yùn)動(dòng)移動(dòng)的速度(擴(kuò)散移動(dòng)速度)Vdif大約如下所示。
[0100]Vdif = 2ffo/ At = 3D/Wo…(3)
[0101]此處，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度可以參考前述Vdif而設(shè)定為比之更快的值。例如，假定觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)為D = 2.0X10-V/S左右的情況下，當(dāng)設(shè)定Wo為0.62 μ m左右時(shí)，則Vdif為1.0X 10_3m/s。因此，光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)定為其大約10倍的15mm/s即可。此外，當(dāng)觀測(cè)對(duì)象粒子的擴(kuò)散系數(shù)未知時(shí)，為了找到使在光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度的各種設(shè)定下的光強(qiáng)度變化曲線成為預(yù)期曲線(典型的是與激發(fā)光強(qiáng)度分布幾乎相同)的條件，可以重復(fù)進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，確定適當(dāng)?shù)墓鈾z測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度。
[0102]<通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法的光強(qiáng)度的分析>
[0103]經(jīng)上述處理獲得試樣溶液的按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)時(shí)，可以在計(jì)算機(jī)18中，根據(jù)存儲(chǔ)在存儲(chǔ)裝置中的程序進(jìn)行處理(由檢測(cè)到的光逐個(gè)檢測(cè)來(lái)自各個(gè)發(fā)光粒子的光信號(hào)的次序)，由此實(shí)施如下所述的光強(qiáng)度的分析。
[0104](i) 一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)
[0105]在按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度數(shù)據(jù)中，當(dāng)一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)的軌跡是如圖4A所示幾乎直線狀時(shí)，與該粒子相對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)度變化如圖6A示意性地描述，具有反映(由光學(xué)系統(tǒng)確定的)光檢測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度分布的曲線(通常略呈鐘形)。因此，觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)的手法之一中，對(duì)于光強(qiáng)度設(shè)定閾值Ιο，超過(guò)該閾值的光強(qiáng)度持續(xù)的時(shí)間寬度Λ τ在規(guī)定的范圍時(shí)，判定為該光強(qiáng)度的分布圖與一個(gè)粒子通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域相對(duì)應(yīng)，可以視為檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子。針對(duì)光強(qiáng)度的閾值1以及針對(duì)時(shí)間寬度△ τ的規(guī)定的范圍是根據(jù)觀測(cè)對(duì)象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后再分解而游離的發(fā)光探針)所發(fā)出的光的強(qiáng)度而預(yù)想的曲線確定的；所述觀測(cè)對(duì)象粒子相對(duì)于光檢測(cè)區(qū)域以規(guī)定的速度相對(duì)地移動(dòng)。其具體的值可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)任意地設(shè)定，也可以根據(jù)觀測(cè)對(duì)象粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體(或者與粒子結(jié)合后分解而游離的發(fā)光探針)的特性而選擇確定。
[0106]此外，作為觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)的其他方法，光檢測(cè)區(qū)域的光強(qiáng)度分布假定為高斯分布:
[0107]I=A- exp(-2t2/a2)...⑷時(shí)，對(duì)顯著的光強(qiáng)度曲線(可以明確判斷為非背景的曲線)，根據(jù)式(4)擬合計(jì)算的強(qiáng)度A和寬度a落入規(guī)定范圍內(nèi)時(shí)，該光強(qiáng)度曲線可判斷為對(duì)應(yīng)一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子通過(guò)了光檢測(cè)區(qū)域，可以視為檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子。當(dāng)強(qiáng)度A和寬度a落在規(guī)定范圍之外時(shí)，可以在分析中作為噪音或異物而無(wú)視。
[0108](ii)觀測(cè)對(duì)象粒子的計(jì)數(shù)
[0109]觀測(cè)對(duì)象粒子的計(jì)數(shù)可以如下進(jìn)行:通過(guò)任意方法計(jì)數(shù)通過(guò)上述觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)方法檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)。然而，當(dāng)粒子的個(gè)數(shù)較多時(shí)，也可以通過(guò)例如圖5和圖6B所示例的處理來(lái)進(jìn)行。[0110]參照?qǐng)D5和圖6B，根據(jù)按照時(shí)間順序的光強(qiáng)度(光子計(jì)數(shù))數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)粒子數(shù)的方法的一個(gè)例子為上述說(shuō)明的光強(qiáng)度的測(cè)定。即，用光檢測(cè)區(qū)域掃描試樣溶液內(nèi)和進(jìn)行光子計(jì)數(shù)，獲得按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)(光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù))后(步驟100)。對(duì)該按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)(圖6B最上部分“檢測(cè)結(jié)果(未處理)”)，進(jìn)行SMOOTHING (平滑化)處理(步驟110，圖6B中上部分“SMOOTHING”)。粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針發(fā)出的光是概率地發(fā)出的，所以在微小的時(shí)間內(nèi)存在數(shù)據(jù)值的欠缺。因此，通過(guò)所述平滑化處理，可以無(wú)視如前述的數(shù)據(jù)值的欠缺。平滑化處理可以例如通過(guò)移動(dòng)平均法而進(jìn)行。需要說(shuō)明的是，可以根據(jù)獲得光信號(hào)數(shù)據(jù)時(shí)的光檢測(cè)區(qū)域的位置移動(dòng)速度(掃描速度)、BIN TIME，適當(dāng)設(shè)定實(shí)施平滑化處理時(shí)的參數(shù)，例如，在移動(dòng)平均法中一次取平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)或移動(dòng)平均的次數(shù)等。
[0111]然后，為了檢測(cè)在平滑化處理后的按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)中存在顯著信號(hào)的時(shí)間區(qū)域(峰存在區(qū)域)，對(duì)平滑化處理后的按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)對(duì)時(shí)間進(jìn)行一階微分值運(yùn)算(步驟120)。按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的時(shí)間微分值，如圖6B中下部分的“時(shí)間微分”所示，信號(hào)值變化時(shí)間點(diǎn)處的值的變化變大，因此通過(guò)參考所述時(shí)間微分值可以有利地確定顯著的信號(hào)(峰信號(hào))的起點(diǎn)和終點(diǎn)。
[0112]之后，在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)中，逐次檢測(cè)顯著的信號(hào)(峰信號(hào))，判斷檢測(cè)到的峰信號(hào)是否是與觀測(cè)對(duì)象粒子相對(duì)應(yīng)的信號(hào)。
[0113]具體而言，首先，在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的按照時(shí)間順序的時(shí)間微分值數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，逐次地參照時(shí)間微分值，搜索、確定一個(gè)峰信號(hào)的始點(diǎn)和終點(diǎn)，從而確定峰存在區(qū)域(步驟130)。一旦確定了一個(gè)峰存在區(qū)域，就對(duì)該峰存在區(qū)域中的平滑化的按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)進(jìn)行鐘形函數(shù)擬合(圖6B下部分的“鐘形函數(shù)擬合”)。由此，計(jì)算鐘形函數(shù)的峰強(qiáng)度Imax、峰寬度(半高全寬(full width half maximum))W、擬合中的(最小二乘法的)相關(guān)系數(shù)等參數(shù)(步驟140)。需要說(shuō)明的是，擬合的鐘形函數(shù)典型的是高斯函數(shù)，也可以是洛倫茲型函數(shù)。由此，判斷計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)是否落在一個(gè)粒子與發(fā)光探針的結(jié)合體或發(fā)光探針通過(guò)光檢測(cè)區(qū)域時(shí)檢測(cè)到的光信號(hào)所描述的鐘形曲線參數(shù)的規(guī)定范圍內(nèi)，即，峰強(qiáng)度、峰寬度、相關(guān)系數(shù)是否分別落在規(guī)定范圍內(nèi)等(步驟150)。這樣，如圖7左側(cè)所示，計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)被判斷為落在與一個(gè)粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體或者與發(fā)光探針對(duì)應(yīng)的光信號(hào)規(guī)定的范圍內(nèi)時(shí)，則該信號(hào)判定為與一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子對(duì)應(yīng)的信號(hào)。由此，判斷為檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子，計(jì)數(shù)為一個(gè)粒子(粒子數(shù)的計(jì)數(shù)增加。工序160)。另一方面，如圖7右側(cè)所示，將計(jì)算的鐘形函數(shù)的參數(shù)沒(méi)有在預(yù)定范圍內(nèi)的峰信號(hào)作為噪音而無(wú)視。
[0114]上述的步驟130?160的處理中的峰信號(hào)的搜索和判定可以在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的整個(gè)領(lǐng)域內(nèi)重復(fù)地進(jìn)行，每檢測(cè)到一個(gè)觀測(cè)對(duì)象粒子，則作為粒子而計(jì)數(shù)。因此，在結(jié)束對(duì)按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)全部區(qū)域的峰信號(hào)搜索后(步驟170)，將所獲得的粒子計(jì)數(shù)值作為在按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)中檢測(cè)到的觀測(cè)對(duì)象粒子的個(gè)數(shù)。
[0115](iii)觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度的確定
[0116]進(jìn)行了觀測(cè)對(duì)象粒子的計(jì)數(shù)后，使用在獲得按照時(shí)間順序的光信號(hào)數(shù)據(jù)的過(guò)程中光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積，確定觀測(cè)對(duì)象粒子的數(shù)密度或濃度。然而，光檢測(cè)區(qū)域的實(shí)際體積依賴于激發(fā)光或檢測(cè)光的波長(zhǎng)、透鏡的開(kāi)口數(shù)、光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整狀態(tài)而改變，所以由設(shè)計(jì)值計(jì)算通常是困難的。因此，計(jì)算光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積也不簡(jiǎn)單。在本文中，典型的是，可以在與所要檢查的試樣溶液的測(cè)定相同的條件下，對(duì)已知粒子濃度的溶液(參照溶液)進(jìn)行上文說(shuō)明的光強(qiáng)度測(cè)定、粒子的檢測(cè)和計(jì)數(shù)，根據(jù)檢測(cè)到的粒子的個(gè)數(shù)和參照溶液的粒子的濃度，確定光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域的總體積，即確定觀測(cè)對(duì)象粒子的檢測(cè)數(shù)和濃度之間的關(guān)系。
[0117]作為參照溶液的粒子，可以優(yōu)選為與觀測(cè)對(duì)象粒子所形成的粒子和發(fā)光探針的結(jié)合體(或與觀測(cè)對(duì)象粒子結(jié)合后再游離的發(fā)光探針)具有相同發(fā)光特性的發(fā)光標(biāo)記(熒光色素等)。具體而言，例如，對(duì)于粒子濃度為C的參照溶液，其粒子的檢測(cè)數(shù)為N時(shí)，光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)的區(qū)域總體積Vt則根據(jù)以下的式子求出。
[0118]Vt = N/C— (5)
[0119]另外，準(zhǔn)備多個(gè)不同濃度的溶液作為參照溶液，分別對(duì)其實(shí)施測(cè)定，將計(jì)算的Vt的平均值作為光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)區(qū)域的總體積Vt而采用即可。因此，一旦獲得Vt值，粒子的計(jì)數(shù)結(jié)果為η的試樣溶液的粒子的數(shù)密度c就根據(jù)以下的式子求出。
[0120]c = n/Vt…(6)，需要說(shuō)明的是，可以不通過(guò)上述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA等得到光檢測(cè)區(qū)域的體積、光檢測(cè)區(qū)域所通過(guò)區(qū)域的總體積。此外，本實(shí)施方式的光分析裝置也可以如下構(gòu)成，對(duì)于規(guī)定的光檢測(cè)區(qū)域的移動(dòng)模式，將各種標(biāo)準(zhǔn)粒子的濃度C和粒子的個(gè)數(shù)N之間的關(guān)系(式(5))的信息預(yù)先存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)18的存儲(chǔ)裝置中，裝置的使用者在實(shí)施光分析時(shí)可以適當(dāng)利用存儲(chǔ)的關(guān)系信息。
[0121]<熒光粒子的檢測(cè)方法>
[0122]本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測(cè)方法為檢測(cè)試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的熒光粒子的方法，在促進(jìn)熒光粒子由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的存在下，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法對(duì)熒光粒子進(jìn)行計(jì)數(shù)而檢測(cè)。掃描分子計(jì)數(shù)法為能夠在分子離散的狀況下測(cè)定每一粒發(fā)光粒子的測(cè)定方法，所以對(duì)于PM級(jí)以下的濃度比較低的發(fā)光粒子也能夠進(jìn)行測(cè)定。因此，通過(guò)本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測(cè)方法，即使當(dāng)試樣溶液中的解析對(duì)象的目標(biāo)粒子的濃度非常低時(shí)，也能夠高靈敏度地計(jì)數(shù)熒光粒子。進(jìn)而，本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測(cè)方法在促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)(三重激發(fā)態(tài)猝滅劑)的存在下進(jìn)行通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)定，由此能夠非常高靈敏度地檢測(cè)熒光粒子。
[0123]對(duì)處于基態(tài)的分子照射光時(shí)，成為單重激發(fā)狀態(tài)，之后再恢復(fù)至基態(tài)。由單重激發(fā)狀態(tài)恢復(fù)至基態(tài)的路徑有2個(gè)。一個(gè)為:由單重激發(fā)狀態(tài)直接恢復(fù)至基態(tài)的路徑，此時(shí)發(fā)出的光為熒光。剩下的一個(gè)為:由單重激發(fā)狀態(tài)通過(guò)三重激發(fā)態(tài)恢復(fù)至基態(tài)的路徑，通過(guò)前述路徑恢復(fù)至基態(tài)的分子不能發(fā)出熒光。已知，熒光的壽命在多個(gè)分子中為納秒數(shù)量級(jí)。另一方面，由單重激發(fā)狀態(tài)通過(guò)三重激發(fā)態(tài)恢復(fù)至基態(tài)的(不產(chǎn)生熒光)路徑通常需要微秒數(shù)量級(jí)以上。
[0124]即，從熒光發(fā)光的觀點(diǎn)出發(fā)，被激發(fā)至單重激發(fā)狀態(tài)的分子中的一部分通過(guò)三重激發(fā)態(tài)恢復(fù)至基態(tài)，由此產(chǎn)生浪費(fèi)。
[0125]本實(shí)施方式中，根據(jù)單重激發(fā)狀態(tài)的壽命和三重激發(fā)態(tài)的壽命的長(zhǎng)度不同，相比于與單重激發(fā)狀態(tài)的分子，三重激發(fā)態(tài)猝滅劑與三重激發(fā)態(tài)的分子更高頻地碰撞而使熒光亮度提高。具體而言，通過(guò)在三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的存在下進(jìn)行利用掃描分子計(jì)數(shù)法的測(cè)定，試樣溶液中的處于三重激發(fā)態(tài)的熒光粒子通過(guò)三重激發(fā)態(tài)猝滅劑恢復(fù)至基態(tài)?；謴?fù)至基態(tài)的熒光粒子通過(guò)光照射再次被激發(fā)成單重激發(fā)狀態(tài)。即，通過(guò)迅速地消除不產(chǎn)生熒光的三重激發(fā)態(tài)而提高熒光亮度，結(jié)果能夠更高靈敏度地檢測(cè)熒光粒子。
[0126]作為本實(shí)施方式中使用的三重激發(fā)態(tài)猝滅劑，只要是具有使處于三重激發(fā)態(tài)的分子恢復(fù)至基態(tài)作用的物質(zhì)，就沒(méi)有特別地限定。作為三重激發(fā)態(tài)猝滅劑，可以考慮熒光粒子的種類、激發(fā)光的波長(zhǎng)、熒光的波長(zhǎng)等從公知的三重激發(fā)態(tài)猝滅劑中適宜選擇而使用。作為三重激發(fā)態(tài)粹滅劑，可列舉出例如:碘化鉀(Potassium 1dide、KI)、半胱胺(2-aminoethanethiol)、環(huán)辛四烯(Cyclo-octatetraene)等。本實(shí)施方式中，優(yōu)選使用碘化鉀或半胱胺。需要說(shuō)明的是，三重激發(fā)態(tài)猝滅劑可以僅使用一種，也可以組合使用兩種以上。
[0127]例如，熒光粒子的檢測(cè)中，檢測(cè)熒光波長(zhǎng)包含510nm?560nm至少一部分的情況下，優(yōu)選使用選自碘化鉀和半胱胺的一種以上作為三重激發(fā)態(tài)猝滅劑。在熒光粒子的檢測(cè)中，檢測(cè)突光波長(zhǎng)包含510nm?620nm的至少一部分的情況下,優(yōu)選使用半胱胺作為三重激發(fā)態(tài)猝滅劑。作為熒光波長(zhǎng)包含510nm?560nm的至少一部分的熒光粒子，可列舉出例如:Rhodamine Green (注冊(cè)商標(biāo))、Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488、fluorescein、FITC、5-carboxyfluorescein (5-FAM)、Cy2 (注冊(cè)商標(biāo))等突光物質(zhì)、以及結(jié)合有這些突光物質(zhì)的粒子等。作為熒光波長(zhǎng)包含560nm?620nm的至少一部分的熒光粒子，可以列舉例如 TAMRA (注冊(cè)商標(biāo))、Rhodamine> Cy3 (注冊(cè)商標(biāo))、Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))546、AlexaFluor (注冊(cè)商標(biāo))555等熒光物質(zhì)、以及結(jié)合有這些熒光物質(zhì)的粒子等。
[0128]具體而言，本實(shí)施方式的目標(biāo)粒子的定量方法具有下述工序(a)?(b)。
[0129](a)調(diào)制包含熒光粒子和促進(jìn)前述熒光粒子從三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的試樣溶液的工序；
[0130](b)算出前述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中存在的熒光粒子的分子數(shù)的工序
[0131]以下，對(duì)于每個(gè)工序進(jìn)行說(shuō)明。
[0132]本實(shí)施方式中，“在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子”是指在試樣溶液中分散或溶解的原子、分子或者它們的聚集體等粒子(可以為發(fā)光的或不發(fā)光的的任一者。)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)的粒子。
[0133]作為本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測(cè)方法的檢測(cè)對(duì)象的熒光粒子，只要是通過(guò)放射特定波長(zhǎng)的光而發(fā)出熒光的物質(zhì)就沒(méi)有特別地限定，可列舉出:熒光色素、量子點(diǎn)等熒光物質(zhì)等。另外，本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測(cè)方法還可以通過(guò)使用熒光探針而檢測(cè)非熒光物質(zhì)。具體而言，使用如下熒光探針:具有與作為檢測(cè)對(duì)象的目標(biāo)粒子(非熒光物質(zhì))特異地或非特異地結(jié)合或吸附的部位，并且在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下發(fā)出熒光。向包含目標(biāo)粒子的試樣溶液中添加熒光探針而使兩者結(jié)合。與形成的目標(biāo)粒子結(jié)合的熒光探針為熒光粒子，能夠通過(guò)本實(shí)施方式的熒光粒子的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0134]目標(biāo)粒子為試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的粒子，可列舉出例如:蛋白質(zhì)、肽、核酸、核酸類似物質(zhì)、脂質(zhì)、糖鏈、氨基酸或它們的聚集體等生物分子、病毒、細(xì)胞等粒子狀的生物學(xué)的對(duì)象物或非生物學(xué)的粒子(例如:原子、分子、膠束、金屬膠體等)等。核酸可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增的核酸。核酸類似物質(zhì)可列舉DNA或RNA這類天然類型核苷酸(天然存在的核苷酸)的側(cè)鏈等被氨基等官能團(tuán)修飾的物質(zhì)、用蛋白質(zhì)或低分子化合物等標(biāo)記的物質(zhì)等。更具體而言，可列舉出例如:橋式核酸(BNA, Bridgednucleic acid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子置換的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位輕基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA, Hexitol Nucleic Acid)、肽核酸(PNA)
坐寸ο
[0135]另外，作為用于與目標(biāo)粒子結(jié)合的熒光探針，優(yōu)選為在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)和單獨(dú)存在的狀態(tài)下發(fā)出的光的發(fā)光特性不同的物質(zhì)。在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)以及單獨(dú)存在的狀態(tài)下熒光探針的發(fā)光特性不同是指:在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)以及單獨(dú)存在的狀態(tài)下，特定的波長(zhǎng)的光強(qiáng)度不同。使熒光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)以及與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下特定波長(zhǎng)的光的強(qiáng)度不同(例如，使熒光強(qiáng)度不同)，由此能夠在掃描分子計(jì)數(shù)法中區(qū)別地檢測(cè)出兩者。
[0136]例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，熒光探針可列舉出:使與目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸結(jié)合熒光物質(zhì)等發(fā)光物質(zhì)而成的物質(zhì)、結(jié)合有熒光物質(zhì)等核酸結(jié)合性蛋白質(zhì)、與核酸結(jié)合的熒光色素分子等。作為前述寡核苷酸，可以為DNA，也可以為RNA，也可以為cDNA這樣的人工擴(kuò)增物質(zhì)。可以為包含部分或全部核酸類似物質(zhì)的物質(zhì)；所述核酸類似物質(zhì)能夠與天然的核酸堿基同樣地形成核苷酸鏈或堿基對(duì)。
[0137]另外，目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，作為熒光探針，可以使用將目標(biāo)粒子的抗原或抗體、目標(biāo)粒子的配體或受體用熒光物質(zhì)標(biāo)記了的物質(zhì)。需要說(shuō)明的是，熒光物質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)等目標(biāo)粒子特異或非特異地結(jié)合或吸附的物質(zhì)的結(jié)合可以通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行。
[0138]與目標(biāo)粒子結(jié)合的熒光探針也可以為與目標(biāo)粒子非特異地結(jié)合等的物質(zhì)，從目標(biāo)粒子的檢測(cè)、定量的精度的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選特異地結(jié)合等的物質(zhì)。需要說(shuō)明的是，作為與目標(biāo)粒子特異地結(jié)合的熒光探針，只要是與物理或化學(xué)的性質(zhì)與目標(biāo)粒子類似的其他物質(zhì)相比更優(yōu)先與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)即可，不需要與除了目標(biāo)粒子以外的物質(zhì)完全地不結(jié)合的物質(zhì)。例如，目標(biāo)粒子為核酸的情況下，被作為熒光探針使用的熒光物質(zhì)標(biāo)記的寡核苷酸既可以具有與前述目標(biāo)粒子的堿基序列完全地互補(bǔ)的堿基序列，也可以具有與前述目標(biāo)粒子的堿基序列包含錯(cuò)配的堿基序列。
[0139]目標(biāo)粒子為蛋白質(zhì)的情況下，與蛋白質(zhì)結(jié)合且改變周圍環(huán)境時(shí)熒光強(qiáng)度、熒光波長(zhǎng)變化的色素(例如，疏水性探針ANS、MANS、TNS這類的熒光色素)可以作為熒光探針使用。另外，熒光探針自身也可以不發(fā)光。例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，使用與前述目標(biāo)粒子雜交的寡核苷酸作為熒光探針，即便在試樣溶液中與前述熒光探針一起添加與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，也能夠在發(fā)光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)以及在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下使發(fā)光特性不同。作為與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，可列舉出熒光性嵌入劑或結(jié)合了熒光物質(zhì)的溝結(jié)合劑等。
[0140]其他的，可以使用例如:由至少兩個(gè)構(gòu)成要素形成的、通過(guò)與目標(biāo)粒子結(jié)合而使前述的至少兩個(gè)構(gòu)成要素的相互位置變化而發(fā)出熒光的物質(zhì)作為熒光探針。作為這樣的物質(zhì)的例子，可列舉出:與某粒子結(jié)合時(shí)結(jié)構(gòu)變化而發(fā)出強(qiáng)的熒光的熒光性蛋白質(zhì)、或者與某粒子結(jié)合時(shí)聚集而形成熒光性金屬絡(luò)合物的分子(絡(luò)合物的配體)。通過(guò)所述的構(gòu)成，在所有情況下，單獨(dú)的熒光探針或不與目標(biāo)粒子結(jié)合的熒光探針均幾乎不發(fā)光，或者即便發(fā)光也與目標(biāo)粒子和熒光探針的結(jié)合體的波長(zhǎng)不同，所以能夠選擇地檢測(cè)由目標(biāo)粒子和熒光探針的結(jié)合體發(fā)出的光。
[0141]另外，通過(guò)利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(FRET)，能夠使試樣溶液中單獨(dú)存在的熒光探針、和與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)的熒光探針的發(fā)光特性不同。例如，作為發(fā)光探針可以使用如下物質(zhì):使在FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)(熒光物質(zhì)、猝滅物質(zhì))按照在熒光探針單獨(dú)存在的狀態(tài)下產(chǎn)生FRET、在與目標(biāo)粒子結(jié)合的狀態(tài)下不產(chǎn)生FRET的方式在與目標(biāo)粒子結(jié)合的物質(zhì)上結(jié)合而形成的物質(zhì)。與目標(biāo)粒子結(jié)合后的熒光探針不再產(chǎn)生FRET，所以由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。另外，從單獨(dú)存在的熒光探針中，檢測(cè)不到由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，或檢測(cè)到的熒光是減弱的。因此，通過(guò)檢測(cè)由成為能量供體的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，能夠與單獨(dú)存在的熒光探針區(qū)別地檢測(cè)到與突光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子。
[0142]例如，目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，可以優(yōu)選使用分子信標(biāo)探針作為熒光探針；該分子信標(biāo)探針如下形成:使FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)和成為能量受體的物質(zhì)，按照單鏈核酸分子的狀態(tài)下產(chǎn)生FRET、與其他單鏈核酸分子雜交形成締合體的狀態(tài)下不產(chǎn)生FRET的方式，在當(dāng)為單鏈核酸分子的狀態(tài)時(shí)形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)體的寡核苷酸上結(jié)合。本實(shí)施方式中優(yōu)選的是:3’末端側(cè)結(jié)合有成為能量供體的熒光物質(zhì)或成為能量受體的物質(zhì)、5’末端側(cè)結(jié)合有剩余的另一者并且3’末端側(cè)區(qū)域和5’末端側(cè)具有彼此互補(bǔ)的堿基序列，這些堿基序列形成堿基對(duì)由此形成分子內(nèi)結(jié)構(gòu)(所謂的莖-環(huán)結(jié)構(gòu))的物質(zhì)。需要說(shuō)明的是，分子信標(biāo)探針的形成分子內(nèi)堿基對(duì)的彼此互補(bǔ)的區(qū)域，可以?shī)A著與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域而存在；3’末端側(cè)的區(qū)域和5’末端側(cè)的區(qū)域既可以為分別包含3’末端或5’末端的區(qū)域，也可以為不包含3’末端或5’末端的區(qū)域。此外，就形成堿基對(duì)的區(qū)域的堿基數(shù)或堿基序列而言，為所形成的堿基對(duì)的穩(wěn)定性低于與目標(biāo)粒子的締合體的穩(wěn)定性、且在檢測(cè)條件下能夠形成堿基對(duì)的程度即可。
[0143]另外，使用與雙鏈結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合的熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)，即便前述熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)與標(biāo)記了熒光探針的熒光物質(zhì)之間產(chǎn)生FRET，也能夠區(qū)別單獨(dú)存在的熒光探針和與目標(biāo)粒子結(jié)合的熒光探針。即，熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)和標(biāo)記了熒光探針的熒光物質(zhì)中的任一者成為FRET的能量供體，另一者成為前述FRET的能量受體。由單獨(dú)存在的熒光探針，檢測(cè)到由標(biāo)記前述熒光探針的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光。與此相對(duì)，與目標(biāo)粒子結(jié)合的熒光探針和熒光性雙鏈核酸結(jié)合物質(zhì)結(jié)合，所以由結(jié)合體能夠檢測(cè)到由FRET發(fā)出的熒光，結(jié)果能夠與單獨(dú)存在的熒光探針區(qū)別而檢測(cè)。
[0144]此外，當(dāng)進(jìn)入熒光探針與目標(biāo)粒子的締合體的堿基對(duì)之間的熒光性嵌入劑的量過(guò)多時(shí)，檢測(cè)自FRET發(fā)出的熒光時(shí)的背景變得過(guò)高，存在影響檢測(cè)精度的擔(dān)心。因此，優(yōu)選將發(fā)光探針設(shè)計(jì)成在熒光探針與目標(biāo)粒子的締合體中形成雙鏈的區(qū)域?yàn)?00bp以下。
[0145]其他的，本實(shí)施方式中，也可以使用兩種熒光探針。例如，在目標(biāo)粒子為核酸或核酸類似物質(zhì)的情況下，將兩種熒光探針設(shè)計(jì)成相對(duì)于目標(biāo)粒子相互鄰接而雜交，將一種熒光探針用在FRET中成為能量供體的熒光物質(zhì)標(biāo)記，將另一種熒光探針用在前述FRET中成為能量受體的物質(zhì)標(biāo)記。該情況下，單獨(dú)存在的熒光探針不產(chǎn)生FRET，而通過(guò)與目標(biāo)粒子結(jié)合，前述兩種熒光探針相互接近而產(chǎn)生FRET。因此，通過(guò)檢測(cè)由于前述FRET而發(fā)出的熒光，能夠檢測(cè)出與熒光探針結(jié)合的目標(biāo)粒子。
[0146]首先，作為工序(a)，調(diào)制包含熒光粒子、和與前述熒光粒子的三重激發(fā)態(tài)猝滅劑進(jìn)行結(jié)合的熒光探針的試樣溶液。具體而言，向適當(dāng)溶劑中添加熒光粒子和三重激發(fā)態(tài)猝滅劑而調(diào)制試樣溶液。該溶劑，只要是不阻礙由熒光粒子發(fā)出的光的檢測(cè)、以及不阻礙利用掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)熒光粒子的溶劑，就沒(méi)有特別的限定；可以從前述【技術(shù)領(lǐng)域】中通常使用的緩沖液中適宜選擇而使用。作為該緩沖液，有例如:PBS(磷酸緩沖生理鹽水、pH7.4)等磷酸緩沖液、Tris緩沖液等。
[0147]三重激發(fā)態(tài)猝滅劑可以以用于起到使三重激發(fā)態(tài)恢復(fù)至基態(tài)的作用(以下，猝滅作用)所需的充分濃度添加至試樣溶液中。起到猝滅作用的濃度可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)求出。具體而言，向包含規(guī)定量的熒光粒子(可以為包含與作為檢測(cè)對(duì)象的熒光粒子同種的熒光物質(zhì)的粒子。)的測(cè)定溶液中，以各種各樣的濃度添加三重激發(fā)態(tài)猝滅劑，檢測(cè)各測(cè)定溶液中的熒光探針中的處于三重激發(fā)態(tài)的分子的比例。處于三重激發(fā)態(tài)的分子的比例相比于沒(méi)有添加三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的測(cè)定溶液顯著地降低的濃度為通過(guò)前述三重激發(fā)態(tài)猝滅劑起到猝滅作用的濃度。處于三重激發(fā)態(tài)的分子的比例通過(guò)FCS測(cè)定而求出。
[0148]具體而言，使用碘化鉀或半胱胺作為三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的情況下，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的試樣溶液的三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的濃度優(yōu)選為0.1mM?20禮，更優(yōu)選為0.3mM?10mM，進(jìn)而優(yōu)選為0.5mM?5mM。組合使用碘化鉀和半胱胺的情況下，優(yōu)選兩者的合計(jì)濃度在上述范圍內(nèi)。
[0149]將非熒光性的目標(biāo)粒子與熒光探針的結(jié)合體制成為熒光粒子作為檢測(cè)對(duì)象的情況下，可以向包含預(yù)先使目標(biāo)粒子與熒光探針結(jié)合的熒光粒子的溶液中添加三重激發(fā)態(tài)猝滅劑而調(diào)制試樣溶液。另外，也可以在調(diào)制了添加了目標(biāo)粒子、熒光探針和三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的試樣溶液之后，在前述試樣溶液中使目標(biāo)粒子和熒光探針結(jié)合而形成熒光粒子。
[0150]只是使目標(biāo)粒子與熒光探針共存于相同的溶液中就能夠使兩者結(jié)合的情況下，調(diào)制試樣溶液之后，只需根據(jù)需要以規(guī)定時(shí)間孵育前述試樣溶液，就能使目標(biāo)粒子與熒光探針在前述試樣溶液中結(jié)合。
[0151]另一方面，目標(biāo)粒子、熒光探針為雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸或者核酸類似物質(zhì)的情況下，優(yōu)選使試樣溶液中的核酸等變性之后使兩者締合。需要說(shuō)明的是，“使核酸或核酸類似物質(zhì)變性”是指使堿基對(duì)解離。例如，使分子信標(biāo)探針中彼此互補(bǔ)的堿基序列所形成的堿基對(duì)解離，解開(kāi)分子內(nèi)結(jié)構(gòu)成為單鏈結(jié)構(gòu)，或使雙鏈核酸分子成為單鏈核酸分子。當(dāng)熒光探針是包含PNA等核酸類似物質(zhì)的寡核苷酸時(shí)，即使目標(biāo)粒子是雙鏈核酸分子，有時(shí)不進(jìn)行特別的變性處理也可以形成包含前述熒光探針和目標(biāo)粒子的締合體。
[0152]作為變性處理，可列舉出:利用高溫處理的變性(熱變性)或利用低鹽濃度處理的變性等。其中，由于對(duì)于熒光物質(zhì)的影響比較小且操作簡(jiǎn)便而優(yōu)選進(jìn)行熱變性。具體而言，熱變性通過(guò)將前述試樣溶液進(jìn)行高溫處理而使前述試樣溶液中的核酸等變性。通常地，DNA在90°C下、RNA在70°C下保溫?cái)?shù)秒至2分鐘左右即可以變性；但根據(jù)目標(biāo)粒子的堿基的長(zhǎng)度等進(jìn)行變性的溫度千差萬(wàn)別，只要能夠變性，就對(duì)其溫度沒(méi)有限定。另一方面，通過(guò)低鹽濃度處理進(jìn)行變性可以是例如利用純水等稀釋，將前述試樣溶液的鹽濃度調(diào)整至足夠低，從而進(jìn)行。
[0153]根據(jù)需要使之變性之后，使前述試樣溶液中的目標(biāo)粒子與熒光探針締合。
[0154]當(dāng)進(jìn)行熱變性時(shí)，在高溫處理后，使前述試樣溶液的溫度降至目標(biāo)粒子能夠與發(fā)光探針特異地雜交的溫度，由此能夠使前述試樣溶液中的兩者適當(dāng)締合。另外，當(dāng)通過(guò)低鹽濃度處理進(jìn)行變性時(shí)，通過(guò)添加鹽溶液等，使前述試樣溶液的鹽濃度升高至目標(biāo)粒子能夠與熒光探針特異地雜交的濃度，能夠使前述試樣溶液中的兩者適當(dāng)締合。[0155]需要說(shuō)明的是，可以根據(jù)兩者的締合體的熔解曲線，求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如可以使僅含有兩者的溶液的溫度從高溫向低溫變化，測(cè)定前述溶液的吸光度或熒光強(qiáng)度來(lái)求出熔解曲線。根據(jù)所獲得的熔解曲線，從變性的兩條單鏈核酸分子開(kāi)始形成締合體的溫度，至幾乎全部成為締合體的溫度這一范圍內(nèi)的溫度，都可以作為兩者能夠特異地雜交的溫度。也可以用使溶液中的鹽濃度自低濃度向高濃度變化來(lái)代替溫度，同樣地確定熔解曲線，能夠求出兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的濃度。
[0156]通?？梢杂肨m值(熔解溫度)，代替兩條單鏈核酸分子能夠特異地雜交的溫度。例如，利用普遍使用的引物/探針設(shè)計(jì)軟件等，根據(jù)熒光探針的堿基序列信息，能夠計(jì)算與目標(biāo)粒子雜交的區(qū)域的Tm值(雙鏈DNA的50%解離為單鏈DNA的溫度)。
[0157]此外，為了抑制非特異雜交，在形成締合體時(shí)，優(yōu)選使試樣溶液的溫度較緩慢地下降。例如，使試樣溶液溫度為70°C以上而使核酸分子變性后，可以按0.05°C /秒以上的降溫速度，降低前述試樣溶液的液溫。
[0158]此外，為了抑制非特異地雜交，優(yōu)選預(yù)先在試樣溶液中添加表面活性劑、甲酰胺、二甲亞砜或尿素等。這些化合物可以只添加一種，也可以組合添加2種以上。通過(guò)添加這些化合物，在較低溫度環(huán)境下也能夠使非特異的雜交難以發(fā)生。
[0159]之后，作為工序(b)，算出調(diào)制的試樣溶液中存在的熒光粒子的分子數(shù)。具體而言，將包含熒光粒子和三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的試樣溶液設(shè)置于前述用于掃描分子計(jì)數(shù)法的光分析裝置，通過(guò)前述的手法檢測(cè)由熒光粒子發(fā)出的光并解析，由此計(jì)數(shù)熒光粒子的個(gè)數(shù)。計(jì)數(shù)的粒子數(shù)為測(cè)定試樣中所含的熒光粒子的個(gè)數(shù)。
[0160]實(shí)施例
[0161]接著，以下示出實(shí)施例等，進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的方式，但本發(fā)明的方式不限于下列實(shí)施例。
[0162][參考例I]
[0163]通過(guò)FCS檢測(cè)確認(rèn)碘化鉀(KI)具有猝滅作用。
[0164]< Rhodamine Green (注冊(cè)商標(biāo))的情況>
[0165]通過(guò)FCS檢測(cè)確認(rèn)碘化鉀(KI)對(duì)于Rhodamine Green(注冊(cè)商標(biāo))具有粹滅作用。
[0166]具體而言，調(diào)制試樣溶液，在InM Rhodamine Green (注冊(cè)商標(biāo))(AnaSpec公司制)中添加KI以終濃度計(jì)成為0mM、0.03mM、0.3mM、3mM、30mM。對(duì)于各試樣溶液，使用能夠測(cè)定每一分子的熒光強(qiáng)度和三重激發(fā)態(tài)的比例的單分子熒光測(cè)定裝置MF20(01ympUSCorporation)進(jìn)行FCS檢測(cè)。FCS檢測(cè)條件中，將激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為488nm，激光強(qiáng)度設(shè)為lmW，檢測(cè)時(shí)間設(shè)為10秒鐘。測(cè)定對(duì)于各試樣進(jìn)行5次，算出其平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0167]將測(cè)定結(jié)果不于圖8A和圖8B。圖8A為表不各試樣溶液中的Rhodamine Green分子的三重激發(fā)態(tài)的比例(Frac.Triplet (%))的圖。圖8B為表示各試樣溶液中的RhodamineGreen分子的每一分子的明亮度CPP (Countrate Per Particle)的圖。如圖8A所示,KI濃度為3mM的試樣溶液中，三重激發(fā)態(tài)的比例為最低。由該結(jié)果可以確認(rèn),KI對(duì)于RhodamineGreen起到三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的作用。另外，KI濃度為3mM的試樣溶液中，與不添加KI的試樣溶液相比較CPP變明亮1.3倍左右(參照?qǐng)D8B。)。由此，可以確認(rèn)通過(guò)三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的添加，熒光亮度提高。另一方面，KI濃度為30mM的試樣溶液中，三重激發(fā)態(tài)的比例低于沒(méi)有添加KI的試樣溶液但CPP幾乎沒(méi)有變化。推測(cè)由于以高濃度添加KI，KI與熒光色素接近的頻率提高，所以甚至單重激發(fā)狀態(tài)的Rhodamine Green也恢復(fù)至基態(tài)。
[0168]< Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488 的情況>
[0169]通過(guò)FCS檢測(cè)確認(rèn)碘化鉀(KI)對(duì)于Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488具有猝滅作用。
[0170]具體而言，使用Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488 (Invitrogen公司制)代替RhodamineGreen (注冊(cè)商標(biāo))(AnaSpec公司制)，除此以外，與Rhodamine Green (注冊(cè)商標(biāo))的情況同樣地,對(duì)于添加了 KI以終濃度計(jì)為0mM、0.03mM、0.3mM、3mM、30mM的包含Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488的試樣溶液，進(jìn)行FCS檢測(cè)。
[0171]將測(cè)定結(jié)果示于圖9A和圖9B。圖9A為表示各試樣溶液中的Alexa Fluor488分子的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。圖9B為表示各試樣溶液中的Alexa Fluor488分子的每一分子的明亮度的圖。如圖9A所示，KI濃度為0.3mM和3mM的試樣溶液中，三重激發(fā)態(tài)的比例與沒(méi)有添加KI的試樣溶液相比較明顯降低。由該結(jié)果可以確認(rèn)，KI對(duì)于Alexa Fluor488起到三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的作用。另外，三重激發(fā)態(tài)的比例最低的KI濃度為3mM的試樣溶液中，與沒(méi)有添加KI的試樣溶液相比較CPP成為1.8倍左右，產(chǎn)生非常大的效果(參照?qǐng)D9B ο )。
[0172]由這些結(jié)果可以確認(rèn)，KI對(duì)于各種各樣的熒光物質(zhì)具有猝滅作用，具有熒光亮度提聞效果。
[0173][參考例2]
[0174]通過(guò)FCS檢測(cè)確認(rèn)半胱胺具有猝滅作用。
[0175]< Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488 的情況>
[0176]通過(guò)FCS檢測(cè)確認(rèn)半胱胺對(duì)于Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488具有粹滅作用。
[0177]具體而言，調(diào)制試樣溶液，向InM Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488 (Invitrogen公司制)中添加半胱胺(Sigma Corporation制)以終濃度計(jì)為0mM、0.3mM、3mM、30mM。對(duì)于各試樣溶液，使用單分子熒光測(cè)定裝置MF20 (Olympus Corporation)進(jìn)行FCS檢測(cè)。FCS檢測(cè)條件中，將激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為488nm，激光強(qiáng)度設(shè)為lmW，檢測(cè)時(shí)間設(shè)為10秒鐘。測(cè)定對(duì)于各試樣進(jìn)行5次，算出其平均。
[0178]將測(cè)定結(jié)果示于圖1OA和圖10B。圖1OA為表示各試樣溶液中的Alexa Fluor488分子的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。圖1OB為表示各試樣溶液中的Alexa Fluor488分子的每一分子的明亮度的圖。如圖1OA所示，半胱胺濃度為3mM的試樣溶液中，三重激發(fā)態(tài)的比例最低。由該結(jié)果可知，半胱胺對(duì)于Alexa Fluor488起到三重激發(fā)態(tài)粹滅劑的作用。另外，半胱胺濃度為3mM的試樣溶液中，與沒(méi)有添加半胱胺的試樣溶液相比較，CPP變明亮1.5倍左右(參照?qǐng)D10B。)。由此可以確認(rèn)，通過(guò)半胱胺的添加熒光亮度提高。
[0179]< TAMRA (注冊(cè)商標(biāo))的情況>
[0180]通過(guò)FCS檢測(cè)確認(rèn)半胱胺對(duì)于TAMRA (注冊(cè)商標(biāo))具有猝滅作用。
[0181]具體而言，調(diào)制試樣溶液，向InM TAMRA (注冊(cè)商標(biāo))(AnaSpec公司制)中添加半胱胺(Sigma Corporation制)以終濃度計(jì)為0mM、0.3mM、3mM、30mM。對(duì)于各試樣溶液，使用單分子熒光測(cè)定裝置MF20 (Olympus Corporation)進(jìn)行FCS檢測(cè)。FCS檢測(cè)條件中，將激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為543nm，激光強(qiáng)度設(shè)為0.5mW，檢測(cè)時(shí)間設(shè)為10秒鐘。測(cè)定對(duì)于各試樣進(jìn)行5次，算出其平均。
[0182]將測(cè)定結(jié)果示于圖1lA和圖11B。圖1lA為表示各試樣溶液中的TAMRA分子的三重激發(fā)態(tài)的比例的圖。圖1lB為表示各試樣溶液中的TAMRA分子的每一分子的明亮度的圖。如圖1lA所示，半胱胺濃度為3mM的試樣溶液中，三重激發(fā)態(tài)的比例最低。由該結(jié)果可確認(rèn)，半胱胺對(duì)于TAMRA起到三重激發(fā)態(tài)猝滅劑的作用。另外，半胱胺濃度為3mM的試樣溶液中，與沒(méi)有添加半胱胺的試樣溶液相比較，CPP變明亮1.4倍左右(參照?qǐng)D11B。)。由此可以確認(rèn)，通過(guò)半胱胺的添加，熒光亮度提高。
[0183]由這些結(jié)果可以確認(rèn)，半胱胺對(duì)于各種熒光物質(zhì)具有猝滅作用，具有熒光亮度的提聞效果。
[0184][實(shí)施例1]
[0185]使用KI作為三重激發(fā)態(tài)猝滅劑，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)熒光粒子。
[0186]首先，調(diào)制試樣溶液，向IOpM Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488 (Invitrogen公司制)中添加KI以終濃度計(jì)為0mM、0.lmM、0.3mM、lmM、3mM、10mM、30mM。對(duì)于各試樣溶液，使用具備共聚焦熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)和光子計(jì)數(shù)系統(tǒng)的單分子熒光測(cè)定裝置MF20 (OlympusCorporation)，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)，獲得按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。此時(shí)，激發(fā)光使用488nm的激光以ImW進(jìn)行照射，檢測(cè)光波長(zhǎng)使用帶通濾波器，設(shè)為510nm~560nm。將試樣溶液中的光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)速度設(shè)為15mm/秒，BIN --ΜΕ設(shè)為IOy秒，測(cè)定時(shí)間設(shè)為2秒鐘。另外，測(cè)定對(duì)于各試樣進(jìn)行5次，算出其平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差。光強(qiáng)度測(cè)定后，對(duì)于各試樣溶液，由獲得的按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)按照時(shí)間順序的數(shù)據(jù)中檢測(cè)到的光信號(hào)。在數(shù)據(jù)的利用移動(dòng)平均法的平滑化中，將一次平均的數(shù)據(jù)點(diǎn)設(shè)為9個(gè)，重復(fù)5次移動(dòng)平均處理。另外，在擬合中，對(duì)于按照時(shí)間順序的數(shù)據(jù)通過(guò)最小二乘法擬合出高斯函數(shù)，確定(高斯函數(shù)中的)峰強(qiáng)度、峰寬(半高全寬)、相關(guān)系數(shù)。進(jìn)而，峰的判定處理中，只將滿足下述的條件:[0187]20 μ 秒<峰寬< 400 μ 秒、
[0188]峰強(qiáng)度> I (光子/10 μ秒)、
[0189]相關(guān)系數(shù)>0.95、
[0190]的峰信號(hào)判定為與觀測(cè)對(duì)象分子對(duì)應(yīng)的光信號(hào)。另一方面，不滿足上述的條件的峰信號(hào)作為噪音而無(wú)視，將判定為與觀測(cè)對(duì)象分子對(duì)應(yīng)的光信號(hào)的信號(hào)的個(gè)數(shù)作為“峰數(shù)”而計(jì)數(shù)。
[0191]圖12為表示將各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。結(jié)果確認(rèn)，KI濃度為
0.1mM~IOmM時(shí)，相比于沒(méi)有添加KI的試樣溶液峰數(shù)增大，熒光粒子的檢測(cè)能力提高。更詳細(xì)而言，KI濃度為0.1mM~3mM時(shí)，伴隨著KI的添加量變多，計(jì)數(shù)到的峰數(shù)也變多。峰數(shù)最多的KI濃度為3mM的試樣溶液中，與沒(méi)有添加KI的試樣溶液相比較，增加30%以上?？梢哉J(rèn)為這是因?yàn)椋蒏I導(dǎo)致熒光亮度變高的Alexa Fluor488被重新檢測(cè)到。
[0192]由這些結(jié)果可知，通過(guò)在KI存在下進(jìn)行利用掃描分子計(jì)數(shù)法的熒光粒子的計(jì)數(shù)，能夠提高熒光粒子的檢測(cè)能力、更高靈敏度地檢測(cè)熒光粒子。
[0193][實(shí)施例2]
[0194]使用半胱胺作為三重激發(fā)態(tài)猝滅劑，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)熒光粒子。
[0195]< Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488 的情況>
[0196]首先，調(diào)制試樣溶液，向IOpM Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488 (Invitrogen公司制)中添加半胱胺(Sigma Corporation 制)以終濃度計(jì)為 0mM、0.lmM、0.3mM、lmM、3mM、10mM、30mM。對(duì)于各試樣溶液，與實(shí)施例1同樣地，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)，獲得按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)熒光粒子的個(gè)數(shù)。[0197]圖13為表示將各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。結(jié)果，半胱胺濃度為
0.3mM~3mM時(shí)，伴隨著半胱胺的添加量變多，計(jì)數(shù)到的峰數(shù)也變多。峰數(shù)最多的半胱胺濃度為3mM的試樣溶液中，與沒(méi)有添加半胱胺的試樣溶液相比較增加20%以上。
[0198]< TAMRA (注冊(cè)商標(biāo))的情況>
[0199]首先，調(diào)制試樣溶液，向IOpM TAMRA(注冊(cè)商標(biāo))(AnaSpec公司制)中添加半胱胺(Sigma Corporation 制)以終濃度計(jì)為 0mM、0.lmM、0.3mM、3mM、10mM、30mM。對(duì)于各試樣溶液，激發(fā)光使用543nm的激光以0.5mff進(jìn)行照射，檢測(cè)光波長(zhǎng)使用帶通濾波器設(shè)為560nm~620nm，除此以外，與實(shí)施例1同樣地，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)，獲得按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)熒光粒子的個(gè)數(shù)。
[0200]圖14為表示將各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。結(jié)果，半胱胺濃度為
0.3mM~3mM時(shí)，伴隨著半胱胺的添加量變多，計(jì)數(shù)到的峰數(shù)也變多。峰數(shù)最多的半胱胺濃度為3mM的試樣溶液中，與沒(méi)有添加半胱胺的試樣溶液相比較增加10%以上。
[0201]由這些結(jié)果可知，通過(guò)在半胱胺存在下進(jìn)行利用掃描分子計(jì)數(shù)法的熒光粒子的計(jì)數(shù)，能夠提高熒光粒子的檢測(cè)能力、更高靈敏度地檢測(cè)熒光粒子。
[0202][實(shí)施例3]
[0203]調(diào)查熒光粒子的濃度與三重激發(fā)態(tài)猝滅劑具有猝滅作用的濃度的關(guān)系。具體而言，在熒光粒子的濃度為IpM的情況下和IOOpM的情況下，對(duì)于三重激發(fā)態(tài)猝滅劑起到猝滅作用的濃度進(jìn)行了調(diào)查。
[0204]首先，調(diào)制試樣溶液，向IpM或IOOpM Alexa Fluor (注冊(cè)商標(biāo))488 (Invitrogen公司制)中添加KI以終濃度計(jì)為0mM、0.lmM、0.3mM、lmM、3mM、10mM、30mM。對(duì)各試樣溶液，對(duì)于Alexa Fluor488的濃度為IpM的試樣溶液將測(cè)定時(shí)間設(shè)為20秒鐘，對(duì)于IOOpM的試樣溶液設(shè)為2秒鐘，除此以外，與實(shí)施例1同樣地，通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)，獲得按照時(shí)間順序的光子計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)熒光粒子的個(gè)數(shù)。
[0205]圖15是表示將Alexa Fluor488的濃度為IpM的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖；圖16是表示將Alexa Fluor488的濃度為IOOpM的各試樣溶液的峰數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)的結(jié)果的圖。Alexa Fluor488的濃度為IpM的試樣溶液和IOOpM的試樣溶液中，均與實(shí)施例1 (Alexa Fluor488的濃度為IOpM的試樣溶液的情況)同樣地，通過(guò)添加KI，利用掃描分子計(jì)數(shù)法檢測(cè)時(shí)的峰檢測(cè)能力(熒光粒子的檢測(cè)能力)提高。另外可知，KI濃度為ImM~3mM時(shí)檢測(cè)到的峰數(shù)均最多，所以KI具有猝滅作用的濃度不怎么受熒光粒子的濃度影響，向試樣溶液中添加KI以使終濃度成為0.1mM~20mM，能夠更高靈敏度地檢測(cè)熒光粒子。
[0206]產(chǎn)業(yè)h的可利用件
[0207]通過(guò)本發(fā)明的方式的熒光粒子的檢測(cè)方法，能夠通過(guò)掃描分子計(jì)數(shù)法非常高靈敏度地檢測(cè)試樣溶液中的僅以非常低的濃度存在的目標(biāo)粒子的濃度。因此，本發(fā)明的方式中的熒光粒子的檢測(cè)方法能夠利用于臨床被檢體等解析對(duì)象物質(zhì)的濃度為微量的試樣的解析、檢查等領(lǐng)域中。
[0208]附圖標(biāo)記說(shuō)明
[0209]I…光分析裝置(共聚焦顯微鏡)[0210]2…光源
[0211]3…單模光纖
[0212]4…準(zhǔn)直儀透鏡
[0213]5…分色鏡
[0214]6、7、11…反射鏡
[0215]8…物鏡
[0216]9…微孔板
[0217]10…孔(試樣溶液容器)
[0218]12…聚光鏡
[0219]13…小孔
[0220]14…二次濾片
[0221]15…多模光纖
[0222]16…光檢測(cè) 器
[0223]17…鏡轉(zhuǎn)向器
[0224]17a…平臺(tái)位置變化裝置
[0225]18…計(jì)算機(jī)
【權(quán)利要求】
1.一種在試樣溶液中分散并隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的熒光粒子的檢測(cè)方法，其包括: (a)調(diào)制包含熒光粒子和促進(jìn)所述熒光粒子從三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的試樣溶液的工序；和 (b)計(jì)算出所述工序(a)中調(diào)制的試樣溶液中存在的熒光粒子的分子數(shù)的工序，其中， 所述工序(b)中的熒光粒子的分子數(shù)的計(jì)算包括: 使用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)所述光學(xué)系統(tǒng)的光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序； 在所述試樣溶液內(nèi)移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)由所述光檢測(cè)區(qū)域中存在的所述熒光粒子發(fā)出的光信號(hào)，逐個(gè)檢測(cè)所述熒光粒子的工序；和 通過(guò)將所述逐個(gè)檢測(cè)到的熒光粒子的個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)而計(jì)數(shù)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置的移動(dòng)期間檢測(cè)到的所述熒光粒子的個(gè)數(shù)的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，其中，所述試樣溶液中的所述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的濃度為0.1mM?20mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，其中，所述試樣溶液中的所述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的濃度為0.3mM?10mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，其中，所述試樣溶液中的所述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)的濃度為0.5mM?5mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，其中，所述促進(jìn)由三重激發(fā)態(tài)向單重基態(tài)躍遷的物質(zhì)為選自碘化鉀和半胱胺的一種以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1?5的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，其中，所述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序包括以規(guī)定的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置。
7.根據(jù)權(quán)利要求1?6的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，其中，所述移動(dòng)光檢測(cè)區(qū)域的位置的工序包括以比所述熒光粒子的擴(kuò)散移動(dòng)速度更快的速度移動(dòng)所述光檢測(cè)區(qū)域的位置。
8.根據(jù)權(quán)利要求1?7的任一項(xiàng)所述的熒光粒子的檢測(cè)方法，其中，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自每個(gè)所述熒光粒子的光信號(hào)來(lái)逐個(gè)檢測(cè)所述熒光粒子的工序包括根據(jù)檢測(cè)到的按照時(shí)間順序的光信號(hào)的形狀來(lái)檢測(cè)單個(gè)所述熒光粒子向所述光檢測(cè)區(qū)域中的進(jìn)入。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103718023SQ201280038085
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月12日
【發(fā)明者】中田秀孝, 田邊哲也 申請(qǐng)人:奧林巴斯株式會(huì)社