專利名稱：硝基咪唑類藥物elisa檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及檢測硝基咪唑類藥物殘留量的試劑盒，特別是檢測蜂蜜中硝基咪唑類藥物殘留量的酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)試劑盒，ELISA (Enzyme LinkedImmunosorbnent Assay)是酶聯(lián)免疫吸附劑測定的簡稱,它是繼免疫突光和放射免疫技術之后發(fā)展起來的一種酶免技術。背景技術：
硝基咪唑類藥物是畜禽蜂蜜中常用的抗原蟲感染及抗菌藥，主要用于防治家禽組織滴蟲和寄生蟲、牛的滴蟲，豬的出血性腸炎、魚的寄生蟲感染、蜂的微孢子蟲病等，并具有促生長作用，但是該類藥物及其某些代謝物對哺乳動物具有致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性，因此硝基咪唑類藥物的不合理使用造成可食性動物組織中藥物殘留問題危害到人類的食品安全，我國已經禁止甲硝唑、地美硝唑、洛硝唑在肉食食品中使用，替硝唑禁止在獸藥中使用，因此，需要一種既靈敏又精確的方法測定硝基咪唑類藥物。目前檢測硝基咪唑類藥物的方法主要有高效液相色譜-紫外色譜、高效液相色譜二極管陳列檢測器法，氣相色譜氮磷檢測器法、高效液相色譜-電噴霧質譜法，氣相色譜 法等，儀器檢測方法操作繁瑣且費用較高，推廣應用受到限制。(三)實用新型內容本實用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的硝基咪唑類藥物殘留量檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的技術含量不高，可進行一次連續(xù)多個樣品中硝基咪唑類藥物殘留量的測定，減少了檢測樣本所需要的時間。本實用新型的技術方案是一種硝基咪唑類藥物殘留量檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的15個下凹瓶位，其特征在于采用96孔聚苯乙烯酶標板作為固相載體，酶標板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔，在試劑盒酶標板微孔條上預包被硝基咪唑類藥物偶聯(lián)抗原制成檢測板，放入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，下凹瓶位由塑料泡沫制成，以塑料硬膜為蓋板膜，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致，將14瓶試劑用不同大小、不同顏色的塑料瓶盛裝并固定在下凹瓶位中與酶標板、蓋板膜、自封袋、說明書、質控報告一同封裝在硬紙盒內，以便于攜帶和運輸。14瓶試劑分別為7瓶Iml標準品溶液、Iml酶標二抗工作液、7ml硝基咪唑類藥物抗體工作液、7ml顯色液A液、7ml顯色液B液、7ml終止液、40ml濃縮洗滌液、50ml濃縮復溶液。每一個試劑盒中的試劑足夠進行96次測定(包括標準分析孔)，既可進行一次連續(xù)多個樣品的檢測，也可以將板孔拆開多次檢測。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結果的準確性。檢測時，樣本中的硝基咪唑類藥物將和酶標板微孔條上預包被的硝基咪唑類藥物偶聯(lián)抗原競爭抗硝基咪唑類藥物抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與樣本中所含硝基咪唑類藥物的殘留量成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中硝基咪唑類藥物殘留量，其操作簡便易行。經實驗表明本試劑盒具有很高的靈敏度檢測靈敏度為為0. 05 U g/kg ;相對于其他硝基咪唑類藥物檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標儀、離心機、振蕩機、渦旋儀和微量加樣器等，同類實驗室一般均有配備，所需成本較低。[0007]本實用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準確地用于硝基咪唑類藥物殘留量的檢測。


圖I為本實用新型酶聯(lián)板的側面縱剖面圖(長為8. 55cm)；圖2為本實用新型酶聯(lián)板的側面橫剖面圖(長為12. 8cm)；圖3為本實用新型酶聯(lián)板的俯視圖；圖4為本實用新型蓋板膜平面圖；圖5為本實用新型試劑瓶縱剖面平面·[0013]圖6為本實用新型固定泡沫模具的俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定泡沫模具的側視圖。
具體實施方式
參見附圖酶標反應微孔條(2)預包被硝基咪唑類藥物偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標板的外框支撐架(I)上，酶標反應微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標板置水浴或恒溫箱內反應時封蓋酶標反應微孔條(2)，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；透明帽的半透明PE塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍色帽的半透明PE塑料試劑瓶(5 )用于封裝50ml濃縮復溶液；白色帽(6 )的白色PE塑料試劑瓶(7 )用于封裝7ml顯色液A液，紅色帽(6)的黑色PE塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml顯色液B液，黃色帽(6)的白色PE塑料試劑瓶(7 )用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色PE塑料試劑瓶(8 )用于封裝7ml酶標二抗工作液，綠色帽的白色PE塑料試劑瓶(8)用于封裝7ml硝基咪唑類藥物抗體工作液，黑色帽的半透明PE塑料試劑瓶(9)用于封裝Iml/瓶的標準品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個下凹瓶位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位(18)，50ml濃縮復溶液(11)，7ml顯色液A液瓶位(14)，7ml顯色液B液瓶位(13)，7ml終止液瓶位(12)，7ml硝基咪唑類藥物抗體工作液瓶位(16)，7ml酶標二抗工作液瓶位(15)，7瓶Iml/瓶各種濃度的標準品溶液，盒體為(19)是硬紙盒。(一)使用試劑盒檢測硝基咪唑類藥物的操作步驟(I)取出需要數量的微孔板。(2)編號將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。(3)加標準品/樣本和抗體工作液加標準品/樣本50 U I到對應的微孔中，加入抗體工作液50 u I/孔(注抗體工作液置于4°C冰箱保存，點樣時取出立即點樣)，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置0-4°C避光環(huán)境中反應60min。(4)洗板小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液250 Ul/孔，充分洗滌4 一 5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干。(5)加酶標二抗加入酶標二抗IOOiU/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25 °C避光環(huán)境中反應30min。(6)顯色加入底物液A液50 ii I/孔，再加底物液B液50 ii I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境反應30min。[0023](7)測定加入終止液50 U I/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處，測定每孔OD值。(二)結果判定(I)百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值，再乘以100%，即 B
百分吸光度值(％) =- X100%
Bo·B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0-Ol^g/L標準溶液的平均吸光度值(2)標準曲線的繪制與計算以標準品百分吸光率為縱坐標，以甲硝唑標準品濃度(呢/L)的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中硝基咪唑類藥物實際殘留量。
權利要求1.一種硝基咪唑類藥物ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位，其特征在于酶標板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預包被硝基咪唑類藥物偶聯(lián)抗原制成的檢測板，14瓶試劑分別7瓶標準品溶液、酶標二抗工作液、抗體工作液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液，下凹瓶位共15個。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒，96孔的聚苯乙烯酶標板，放于真空鋁箔袋內，蓋板膜是塑料硬膜；標準品溶液均用黑色帽的半透明PE塑料瓶，酶標二抗工作液用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，顯色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復溶液用藍色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于酶標板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔，每個反應孔預包被硝基咪唑類藥物偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；標準品溶液7瓶，Iml/瓶；酶標二抗工作液I瓶，7ml ;抗體工作液I瓶，7ml ;顯色液A液I瓶，7ml ;顯色液B液I瓶，7ml ;終止液I瓶，7ml ;濃縮洗滌液I瓶，40ml ;濃縮復溶液I瓶，50ml。
專利摘要本實用新型涉及一種硝基咪唑類藥物殘留量檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標板、酶標二抗工作液、硝基咪唑類藥物抗體工作液、硝基咪唑類藥物7個濃度的標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液。采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中含有的硝基咪唑類藥物將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗硝基咪唑類藥物抗體，加入酶標二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中硝基咪唑類藥物的殘留量。與儀器分析技術相比具有使用方便、高靈敏度等特點，可在硝基咪唑類藥物的殘留量檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/543GK202794173SQ20122052067
公開日2013年3月13日 申請日期2012年10月11日 優(yōu)先權日2012年10月11日
發(fā)明者萬宇平, 吳鵬, 羅曉琴, 孫震, 馮靜, 余厚美, 趙正苗, 段盈盈, 何麗霞, 李曉芳 申請人:北京勤邦生物技術有限公司