專利名稱：微量白蛋白免疫層析檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
微量白蛋白免疫層析檢測(cè)試劑盒技術(shù)領(lǐng)域[0001]本實(shí)用新型涉及臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種基于上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)免疫層析快速、定量檢測(cè)微量白蛋白試劑盒。
背景技術(shù)：
[0002]上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒(Up-Converting Phosphor, UCP)是一種可對(duì)能量進(jìn)行上轉(zhuǎn)的稀土金屬合成物，即UCP可吸收低能量的(長(zhǎng)波長(zhǎng))紅外光，但卻發(fā)出高能量的(短波長(zhǎng))可見(jiàn)光。UCP是由幾種稀土金屬元素參雜于某些晶體的晶格中構(gòu)成的。在這種材料中有三種主要的成分主基質(zhì)、吸收子和發(fā)射子。作為主基質(zhì)的晶體材料有氧硫化物(如Y202S、Gd02S、 La2O2S等)、氟化物(如YF3、GdF3、LaF3等)、鎵酸鹽(如YGaO3'Y3Ga5O12等)以及硅酸鹽(YSi205、 YSi3O7等)等；常用作吸收子的稀土金屬離子有鐿離子(Yb3+)、鉺離子(Er3+)、釤離子(Sm3+) 等；常用作發(fā)射子的稀土金屬離子有鉺離子(Er3+)、欽離子(Ho3+)、銩離子(Tm3+)、鋱離子 (Tb3+)等。吸收子和發(fā)射子這一離子對(duì)在主基質(zhì)晶格內(nèi)適宜的空間取向和距離，是產(chǎn)生上轉(zhuǎn)發(fā)光的基礎(chǔ)。[0003]上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒UCP所具有的這種獨(dú)特光學(xué)特性，使其在床邊快速診斷領(lǐng)域發(fā)揮巨大的潛能[0004](I)高度的靈敏性獨(dú)有的上轉(zhuǎn)發(fā)光現(xiàn)象確保了 UCP在檢測(cè)過(guò)程中不存在來(lái)自外界的背景干擾；[0005](2)高度的穩(wěn)定性UCP的發(fā)光現(xiàn)象是產(chǎn)生于結(jié)構(gòu)內(nèi)部的純粹物理過(guò)程，因而完全避免了來(lái)自檢測(cè)樣品腐蝕及自身衰變導(dǎo)致的發(fā)光淬滅；[0006](3)高度靈活性UCP具有的可自由組合的多樣化特征光譜，使其適用于多重分析；[0007](4)高度的安全性無(wú)機(jī)惰性、紅外光激發(fā)、可見(jiàn)光發(fā)射使得基于UCP檢測(cè)對(duì)于檢測(cè)者、被檢測(cè)樣品、環(huán)境均無(wú)危害。[0008]微量白蛋白(又名微量尿白蛋白，Micoralbuminuria, MAU)是指尿中出現(xiàn)的微量白蛋白。白蛋白是一種血液中的正常蛋白，在正常生理?xiàng)l件下尿液中也會(huì)出現(xiàn)極少微量白蛋白，排泄量一般在30mg/天(或20mg/L)之內(nèi)。人尿液中的白蛋白達(dá)到在30_300mg/天或 20-200mg/L濃度稱為微量白蛋白，白蛋白濃度大于300mg/天或200mg/L時(shí)稱大量白蛋白。[0009]微量白蛋白(MAU)的非正常出現(xiàn)，通常被認(rèn)為是腎功能衰竭、糖尿病和心血管疾病并發(fā)癥等重要臨床標(biāo)志之一。因此，尿液中白蛋白存在水平的檢測(cè)對(duì)腎病、糖尿病和心血管病的早期診斷、早期治療和減小風(fēng)險(xiǎn)由重要的參考價(jià)值和臨床意義。[0010]目前，臨床檢測(cè)微量白蛋白診斷早期腎損害的方法有放射免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法(ELISA)等，這些檢查較為繁瑣、歷時(shí)較長(zhǎng)、費(fèi)用較高，不利于臨床醫(yī)生的及時(shí)診斷和療效觀察。[0011]中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00810305085. 9公開(kāi)了一種半定量檢測(cè)尿微量白蛋白膠體硒試紙，該試紙條能夠檢測(cè)含量不低于20μ g/ml尿液中白蛋白。此法雖然簡(jiǎn)單，但是準(zhǔn)確度不高、且不能定量檢測(cè)。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01110458548. 6公開(kāi)了微量尿白蛋白膠體金檢測(cè)試劑盒及其制備工藝，具體描述了該試劑盒的制備，還說(shuō)明了試劑盒檢測(cè)靈敏度15 μ g/ml。但是膠體金免疫層析存在以下缺陷[0012]⑴膠體金標(biāo)記過(guò)程是靜電吸附過(guò)程，是一種物理過(guò)程，故在液相中穩(wěn)定性較差， 往往造成已標(biāo)記上的蛋白分子又再次脫落；[0013](2)只有當(dāng)金顆粒集聚到一定量時(shí)，人肉眼才能觀察到紫紅色的條帶，且該顏色與背景對(duì)比度不大，從而限制了檢測(cè)靈敏度。[0014]因此，應(yīng)用上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析技術(shù)開(kāi)發(fā)微量白蛋白快速檢測(cè)試劑應(yīng)用于床邊快速診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。發(fā)明內(nèi)容[0015]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本實(shí)用新型提供一種基于上轉(zhuǎn)發(fā)光法的測(cè)定微量白蛋白免疫層析試劑盒，具有準(zhǔn)確、快速、定量檢測(cè)等特點(diǎn)。[0016]本實(shí)用新型的試紙條檢測(cè)原理是通過(guò)一系列表面修飾與活化，上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒UCP 可與生物活性分子相結(jié)合，利用UPT生物傳感器，對(duì)在層析過(guò)程中通過(guò)特異免疫反應(yīng)結(jié)合于檢測(cè)區(qū)與質(zhì)控區(qū)上的UCP顆粒進(jìn)行掃描分析，從而利用由UPT快速定量檢驗(yàn)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)精確定量或定性。[0017]本實(shí)用新型的提供的技術(shù)方案是[0018]一種微量白蛋白免疫層析檢測(cè)試劑盒，包括在底襯上依次粘貼的樣品墊、結(jié)合墊、 分析膜和吸水紙，所述結(jié)合墊上包被有上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒標(biāo)記的微量白蛋白抗體I，所述分析膜上設(shè)有平行的檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)包被有微量白蛋白抗體II或微量白蛋白抗原，所述質(zhì)控區(qū)包被有羊抗鼠IgG。[0019]所述上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒的直徑為50_350nm。[0020]所述微量白蛋白抗體I和微量白蛋白抗體II為配對(duì)單抗或單抗-多抗配對(duì)。[0021]所述微量白蛋白抗原為人微量白蛋白。[0022]本實(shí)用新型微量白蛋白免疫層析檢測(cè)試劑盒的制備方法為[0023](I)結(jié)合墊制備將UCP-微量白蛋白抗體I用ρΗ7· 2的O. 03Μ PBS緩沖液(含有 2%BSA和2%海藻糖)稀釋至終濃度為2mg/ml，充分混勻后噴于結(jié)合墊上，37°C烘干備用；[0024](2)分析膜制備用點(diǎn)樣儀在分析膜上不同位置分別噴點(diǎn)微量白蛋白抗體II (或微量白蛋白抗原)和羊抗鼠IgG抗體，作為檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，37°C烘干備用；[0025](3)樣品墊制備將纖維素膜放入pH 7. 2的O. 03M PBS緩沖液(含5mg/mlBSA和 O. l%TritonX-100)中浸泡30min，然后37°C烘干備用；[0026]⑷試劑盒組裝將樣品墊、結(jié)合墊、分析膜和吸水紙依次粘貼在底襯上，切割成指定寬度試紙條即可。[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型具有以下有益技術(shù)效果[0028]本實(shí)用新型檢測(cè)試劑盒基于轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)與免疫層析技術(shù)結(jié)合在定量檢測(cè)微量白蛋白的應(yīng)用，使得微量白蛋白檢測(cè)無(wú)本底干擾、檢測(cè)結(jié)果更加靈敏；與現(xiàn)有技術(shù)相比，該試劑盒穩(wěn)定性更高。


[0029]圖I微量白蛋白免疫層析檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。[0030]其中，I、底襯；2、樣品墊；3、結(jié)合墊；4、分析膜；5、吸水墊；6、檢測(cè)區(qū)；7、質(zhì)控區(qū)。
具體實(shí)施方式
[0031]
以下結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)一步詳細(xì)描述，所述是對(duì)本實(shí)用新型的解釋而不是限定。[0032]如圖I所示，一種微量白蛋白免疫層析檢測(cè)試劑盒，包括在底襯I上依次粘貼的樣品墊2、結(jié)合墊3、分析膜4和吸水紙5，所述結(jié)合墊3上包被有上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒標(biāo)記的微量白蛋白抗體I，所述分析膜4上設(shè)有平行的檢測(cè)區(qū)6和質(zhì)控區(qū)7，所述檢測(cè)區(qū)6包被有微量白蛋白抗體II或微量白蛋白抗原，所述質(zhì)控區(qū)7包被有羊抗鼠IgG。[0033]所述上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒的直徑為50_350nm。[0034]所述微量白蛋白抗體I和微量白蛋白抗體II為配對(duì)單抗或單抗-多抗配對(duì)。[0035]所述微量白蛋白抗原為人微量白蛋白。[0036]實(shí)施例I本實(shí)用新型微量白蛋白免疫層析檢測(cè)試劑盒的制備[0037]方法I :[0038]⑴結(jié)合墊3制備將50nmUCP顆粒與微量白蛋白單克隆抗體I共價(jià)偶聯(lián)得到 UCP-微量白蛋白單克隆抗體I，然后用PH7. 2的O. 03M PBS緩沖液(含有2%BSA和2%海藻糖)稀釋至終濃度為2mg/ml，充分混勻后噴于結(jié)合墊上，37°C烘干備用；[0039](2)分析膜4制備以pH 7. 8的PBS緩沖液將微量白蛋白單克隆抗體II或微量白蛋白多克隆抗體和兔抗鼠IgG抗體分別配置成O. 2mg/ml和O. 3mg/ml的溶液,再用噴膜儀在硝酸纖維素膜上以I μ 1/cm的量分別劃線作為檢測(cè)區(qū)6和質(zhì)控區(qū)7，37°C烘干備用；[0040](3)樣品墊2制備將纖維素膜放入pH 7. 2的O. 03M PBS緩沖液(含5mg/mlBSA和 O. l%TritonX-100)中浸泡30min，然后37°C烘干備用；[0041]⑷試劑盒組裝將樣品墊2、結(jié)合墊3、分析膜4和吸水紙5依次粘貼在底襯I上， 切割成指定寬度試紙條即可。[0042]方法2:[0043](I)結(jié)合墊3制備將350nmUCP顆粒與微量白蛋白單克隆抗體I共價(jià)偶聯(lián)得到 UCP-微量白蛋白單克隆抗體I，然后用PH7. 2的O. 03M PBS緩沖液(含有2%BSA和2%海藻糖)稀釋至終濃度為2mg/ml，充分混勻后噴于結(jié)合墊上，37°C烘干備用；[0044]⑵分析膜4制備以pH 7. 8的PBS緩沖液將人微量白蛋白和兔抗鼠IgG抗體分別配置成O. 2mg/ml和O. 3mg/ml的溶液，再用噴膜儀在硝酸纖維素膜上以I μ 1/cm的量分別劃線作為檢測(cè)區(qū)6和質(zhì)控區(qū)7，37°C烘干備用；[0045](3)樣品墊2制備將纖維素膜放入pH 7. 2的O. 03M PBS緩沖液(含5mg/mlBSA和 O. l%TritonX-100)中浸泡30min，然后37°C烘干備用；[0046](4)試劑盒組裝將樣品墊2、結(jié)合墊3、分析膜4和吸水紙5依次粘貼在底襯I上， 切割成指定寬度試紙條即可。[0047]實(shí)施例2樣品檢測(cè)[0048]將被檢測(cè)尿液滴加100-120 μ I于樣品墊2上，溶液將溶解結(jié)合墊3上標(biāo)記好的UCP顆粒，并在硝酸纖維素膜4上發(fā)生層析，然后在5-10min內(nèi)用上UPT生物傳感器對(duì)試紙條進(jìn)行掃描，根據(jù)信號(hào)得出待測(cè)樣品中的微量白蛋白的含量進(jìn)行定量或定性檢測(cè)。
權(quán)利要求1.一種微量白蛋白免疫層析檢測(cè)試劑盒，包括在底襯(I)上依次粘貼的樣品墊(2)、結(jié)合墊(3 )、分析膜(4 )和吸水紙(5 )，其特征在于所述結(jié)合墊(3 )上包被有上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒標(biāo)記的微量白蛋白抗體I，所述分析膜(4)上設(shè)有平行的檢測(cè)區(qū)(6)和質(zhì)控區(qū)(7)，所述檢測(cè)區(qū)(6)包被有微量白蛋白抗體II或微量白蛋白抗原，所述質(zhì)控區(qū)(7)包被有羊抗鼠IgG。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述微量白蛋白免疫層析檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒的直徑為50-350nm。
專利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了一種微量白蛋白免疫層析檢測(cè)試劑盒，屬于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。該試劑盒包括在底襯(1)上依次粘貼的樣品墊(2)、結(jié)合墊(3)、分析膜(4)和吸水紙(5)，所述結(jié)合墊(3)上包被有上轉(zhuǎn)發(fā)光UCP顆粒標(biāo)記的微量白蛋白抗體I，所述分析膜(4)上設(shè)有平行的檢測(cè)區(qū)(6)和質(zhì)控區(qū)(7)，所述檢測(cè)區(qū)(6)包被有微量白蛋白抗體II或微量白蛋白抗原，所述質(zhì)控區(qū)(7)包被有羊抗鼠IgG。本試劑盒采用上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù)與免疫技術(shù)結(jié)合，具有準(zhǔn)確、快速、定量檢測(cè)等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK202814992SQ201220495168
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者蘇恩本, 顏彬, 周超, 王勇 申請(qǐng)人:南京基蛋生物科技有限公司