專利名稱：林可霉素殘留快速檢測試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種林可霉素殘留的檢測器具，特別是涉及一種林可霉素殘留快速檢測的試紙條。
背景技術(shù)：
林可霉素(lincomycin，LIN)又稱潔霉素，是由林肯鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的林可酰胺類抗生素，分子式C18H34N206S，分子量406. 53，具有較強的抑菌活性，主要作用于革蘭氏陽性細(xì)菌，是RNA依賴的乙酰膽堿酯酶抑制劑。LIN不具備突出的毒性，但是它在食品及藥 物中的殘留通過食物鏈進(jìn)入人體后易累積，可導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性，導(dǎo)致對疾病缺乏治療效率。因此，各國都對林可霉素有限量要求。中國農(nóng)業(yè)部規(guī)定了 LIN在牛、羊、豬、禽中的最高殘留限量，其中肌肉lOOyg/kg、脂肪lOOyg/kg、肝臟SOOyg/kg、腎臟MOOyg/kg。目前國內(nèi)外對LIN殘留限量常用的檢測方法主要有微生物法、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法、高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法(UPLC-MS/MS)、液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、薄層色譜法(TLC)等。上述方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜繁瑣的操作過程，并且對檢驗人員的技能要求較高,不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。因此,急切需要一種快速簡便的LIN檢測技術(shù)。

實用新型內(nèi)容本實用新型要解決的技術(shù)問題提供了一種特異性強、敏感性高、快速簡便檢測林可霉素的試紙條。本實用新型的技術(shù)方案—種林可霉素殘留快速檢測試紙條，底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)林可霉素載體蛋白溶液印制的檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗體溶液印制的對照印跡；所述金標(biāo)抗體纖維層用吸附林可霉素的金標(biāo)抗體玻璃纖維棉制成，金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗林可霉素單克隆抗體。所述支撐層用硬質(zhì)塑膠片條或不吸水的硬紙條制成；所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；所述吸水材料層用吸水紙制成。所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。所述載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。所述外層保護(hù)層為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋的保護(hù)膜，在吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層的交界處對應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向吸附纖維層一側(cè)0. 3 0. 7cm。所述檢測印跡和對照印跡為平行排列的“ Il ”直線式印跡，或為“十十”字型排列印跡，或為“T T”字型排列印跡，或為“丄丄”字型排列印跡，或為“卜P，字型排列印跡，或為“_| ”字型排列印跡。本實用新型的試紙條具有以下優(yōu)點(I)特異性強，敏感性高。LIN快速檢測試紙條以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)對單克隆抗體特異性及親和力影響較小，且具有較高的標(biāo)記率。(2)操作簡便快速。使用本實用新型試紙條時無需任何其它試劑，只要將其插入待檢樣品中10秒左右，2分鐘內(nèi)即可判定檢測結(jié)果。(3)結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。本實用新型試紙條以顯示紅棕色“ I ”(或“十”、“τ”、“ι”、“ Ρ’、“·Ι ”)印跡作為檢測的陽性和陰性標(biāo)記，即在纖維素膜上顯示一條棕紅色“ I ”印跡表示在被檢測樣品中含有LIN，顯示兩條棕紅色“ I I ”印跡表示在被檢樣品中不 含LIN。結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽性等人為誤判。(4)成本低，投資少。使用該試紙條不需另配儀器設(shè)備及其它試劑，可隨時隨地進(jìn)行檢測，檢測費用低廉。采用通常的儀器分析費用為300元每頭/份，采用進(jìn)口 ELISA試劑盒的檢測費用為50元每頭/份，本實用新型試紙條的檢測費用為8 10元每頭/份，檢測費用大幅下降，可節(jié)省大量儀器和設(shè)備費用。(5)應(yīng)用范圍廣，便于推廣。本實用新型試紙條操作簡單，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖及個體養(yǎng)殖等方面。本實用新型在保障食品安全和保護(hù)消費者健康方面具有極其重要的意義，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

圖I為本實用新型試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本實用新型試紙條的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施方式
以下實施例是為了進(jìn)一步說明本實用新型的內(nèi)容，并不表示對本實用新型的限制。文中如沒有特別說明，其中的百分含量均為質(zhì)量百分含量。實施例一參見圖I、圖2。圖中I為支撐層，用塑膠薄片條制成，2為吸附纖維層(測試端)，用玻璃纖維棉制成，金標(biāo)抗體纖維層3用吸附林可霉素的金標(biāo)抗體玻璃纖維棉制成，金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗林可霉素的單克隆抗體。纖維素膜層4采用硝酸纖維素膜制成，吸水材料層5采用吸水濾紙制成，將吸附纖維層2、金標(biāo)抗體纖維層3、纖維素膜層4、吸水材料層5從右至左依次粘貼在支撐層I上，彼此交界處的纖維互相交叉滲透。在纖維素膜層4上設(shè)有用偶聯(lián)LIN的載體蛋白BSA (牛血清白蛋白)溶液印制的檢測印跡6和用羊抗小鼠IgG溶液印制的對照印跡7，兩條印跡帶平行排列，形成組合印跡帶“ I I”。8-1為覆蓋在吸附纖維層2和金標(biāo)抗體纖維層3上面的樣品端白色保護(hù)膜，在吸附纖維層2和金標(biāo)抗體纖維層3交界處對應(yīng)的保護(hù)膜8-1上，偏向于吸附纖維層2 —側(cè)O. 5cm處印有標(biāo)記線9，標(biāo)記線9的右端印有箭頭及max字樣，吸水材料層5 (手柄端)上覆蓋有黃色保護(hù)膜8-2。用于檢測印跡的偶聯(lián)LIN載體蛋白和金標(biāo)抗體的制備，以及用于對照印跡的羊抗或兔抗小鼠IgG抗體的制備方法如下(I) LIN與載體蛋白的偶聯(lián)采用高碘酸鈉法，將LIN與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，制備免疫抗原。稱取12. 6mg LIN置于IOmL反應(yīng)瓶中，用500 μ L PBS溶解；稱取6. 7mg NaI04置于IOmL反應(yīng)瓶中，用500 μ L雙蒸水溶解；然后將NaI04溶液在攪拌條件下逐滴加入到LIN溶液中，室溫攪拌反應(yīng)2h ;稱取載體蛋白BSA(或0VA、KLH)15mg置于IOmL反應(yīng)瓶中，用5mLPBS溶解，然后置于4°C冰箱中2h，備用；之后將LIN與NaI04的反應(yīng)混合液逐滴攪拌加入到BSA溶液中，4°C攪拌反應(yīng)2h ;再次向混合液中加入2mg/mL的NaI04 50 μ L，室溫攪拌反應(yīng)2h ;將反應(yīng)混合液裝入透析袋，用pH=7. 4的PBS溶液透析3d，每8h換透析液一次，收集得到LIN與載體蛋白的偶聯(lián)物。(2)抗LIN單克隆抗體的制備用制備的LIN載體蛋白偶聯(lián)物以2(^g 5(^g/只的用量免疫BALB/c系小鼠，采用背部皮下多點注射，共免疫四次，每次間隔15 30天。第四次加強免疫后3 4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，用75%的酒精浸泡5 lOmin，無菌取其脾細(xì)胞，剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過濾，1000r/min離心IOmin,收集脾細(xì)胞;將IX IO8個脾細(xì)胞與2 X IO7 5 X IO7個的NSO瘤細(xì)胞混合，1000r/min離心lOmin，棄上清，將細(xì)胞沉淀于37°C水浴中緩緩加入40 50%的PEG4000 (pH 8. 5 9. O) O. 7 I. OmL,作用Imin ;然后緩慢加入無血清1640培養(yǎng)基15mL，以終止PEG的作用，37°C水浴5 lOmin，1000r/min離心lOmin，棄上清；將得到的細(xì)胞沉淀重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，加入4塊96孔培養(yǎng)板(ΙΟΟμ 200μ 7孔)中，置于37°C、5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 10天后，以5 lOPg/mL偶聯(lián)LIN的載體蛋白包被酶標(biāo)板(96孔/塊)，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測雜交瘤的培養(yǎng)上清。融合后得到陽性細(xì)胞克隆(0D492=0. 6以上)325孔，陽性率為83% ;挑取強陽性細(xì)胞克隆(0D492=1. 8以上)，進(jìn)行連續(xù)三次的有限稀釋克隆化，所生產(chǎn)的雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)為92 98。再次連續(xù)三次的有限稀釋克隆化，選取強陽性細(xì)胞克隆，繼續(xù)有限稀釋克隆化。經(jīng)鑒定，其分泌的單克隆抗體特異地與LIN反應(yīng)，而不與其它蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，親和力常數(shù)達(dá)IO9 1CI，輕鏈亞型為K或λ，重鏈亞型為IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3，針對LIN特異抗原決定簇的單克隆抗體，用于制備金標(biāo)抗體。(3) LIN金標(biāo)抗體和金標(biāo)抗體玻璃纖維棉的制備以檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶膠。在50 IOOmL沸騰的O. 01 O. 05%氯金酸水溶液中加入2 4mL O. 5 2%的檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng)后獲得粒徑15nm左右的膠體金。以O(shè). lmol/L的K2C03調(diào)節(jié)膠體金pH至8. 5 9. 5，以1:1000 1300的標(biāo)記比將待標(biāo)記的LIN單克隆抗體加入到上述金溶膠中，標(biāo)記IOmin后，加20%的PEG 10000至終濃度為O. 05%, 4°C、1500 3000rpm離心20min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、15000rpm離心Ih,棄上清；獲初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標(biāo)蛋白，獲得LIN膠體金標(biāo)記抗體。將I : (100 500)稀釋的膠體金標(biāo)記抗體吸附于精制玻璃纖維棉中，4°C低溫真空干燥，制備LIN金標(biāo)抗體玻璃纖維棉。(4)羊抗或兔抗小鼠IgG抗體的制備[0035]以飽和硫酸銨提取小鼠血清IgG。取I份小鼠血清加2份PBS(pH=7. 4)混勻，加等體積飽和硫酸銨混勻，置4°C冰箱2h，4°C、1200r/min離心15min，棄上清；以適量PBS(pH=7. 4)溶解沉淀，加飽和硫酸銨至終濃度33%，置4°C冰箱內(nèi)用PBS (pH=7. 4)過夜透析，換液2 3次，40C、12000r/min離心15min，收集上清，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度，以5(^g 100 μ g/kg體重(小鼠血清IgG)經(jīng)皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3 4次，末次免疫10天后，靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在I :2000以上，心臟采血或頸動脈放血，收集其血清，用于試紙條對照印跡的制備。以飽和硫酸銨提取羊抗或兔抗小鼠IgG，方法與提取小鼠血清IgG相同，不再重述。(5)試紙條的檢測反應(yīng)原理當(dāng)LIN檢測試紙條樣品端插入待檢測樣品溶液后，待測溶液通過虹吸作用帶動待檢LIN及金標(biāo)抗體棉中的金標(biāo)抗體一起向纖維素膜層擴散，并最終滲入手柄端的吸水材料層中，擴散過程中待檢LIN與金標(biāo)抗體相結(jié)合，進(jìn)而封閉金標(biāo)抗體上LIN的抗原結(jié)合點，阻 止金標(biāo)抗體與纖維素膜上偶聯(lián)LIN載體蛋白的檢測印跡結(jié)合，不能顯示檢測印跡，而羊抗或兔抗小鼠IgG則可與金標(biāo)抗體結(jié)合，形成紅棕色對照印跡“ I ”，即一條紅棕色“ I ”印跡為陽性標(biāo)記；若樣品溶液中無LIN，則不能阻止金標(biāo)抗體與纖維素膜上偶聯(lián)LIN的載體蛋白檢測印跡結(jié)合，顯示紅棕色檢測印跡“ I ”，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG也與金標(biāo)抗體結(jié)合，顯示紅棕色對照印跡“ I ”，形成兩條紅棕色“ I I ”，為陰性標(biāo)記；如果纖維素膜上沒有紅棕色標(biāo)記顯示，則表明試紙條已失效。(6)檢測方法a.樣品液制備檢測雞肉時，將雞肉樣品絞碎后加入少許鹽酸，反應(yīng)5 10min，之后加入緩沖液，振蕩I 2min，倒出提取液進(jìn)行檢測。其他肉類樣品液的制備與此相似。b.操作方法將試紙條樣品端插入樣品液中，插入深度不超過標(biāo)記線，約10秒取出試紙條，水平放置約2分鐘，觀察結(jié)果。c.結(jié)果判斷如果在纖維素膜上有一條紅棕色標(biāo)記“ I ”顯示，測檢結(jié)果呈陽性，說明在被檢測樣品液中含有LIN ;如果檢測試紙條上的纖維素膜出現(xiàn)兩條紅棕色標(biāo)記“ I
I ”，檢測結(jié)果呈陰性，待檢樣品中不含LIN。實施例二 試紙條結(jié)構(gòu)和實施例一基本相同，不同之處在于支撐層I用不吸水的硬紙條制成，吸附纖維層2用尼龍膜，金標(biāo)抗體纖維層3吸附有膠體金標(biāo)記的抗林可霉素的多克隆抗體，纖維素膜層4采用純纖維素膜，檢測印跡6中偶聯(lián)LIN的載體蛋白為雞卵清白蛋白(OVA)，對照印跡7用兔抗小鼠IgG溶液在纖維素膜上制成。實施例三試紙條結(jié)構(gòu)和實施例一基本相同，不同之處在于吸附纖維層2用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜，檢測印跡6中偶聯(lián)LIN的載體蛋白為雞卵清白蛋白(0VA)，對照印跡7用羊抗小鼠IgG溶液在纖維素膜上制成。實施例四試紙條結(jié)構(gòu)和實施例一基本相同，不同之處在于吸附纖維層2用聚酯膜，檢測印跡6中偶聯(lián)LIN的載體蛋白為血藍(lán)蛋白。實施例五試紙條結(jié)構(gòu)和實施例一基本相同，不同之處在于纖維素膜層4上設(shè)有用偶聯(lián)LIN的血藍(lán)蛋白溶液印制的檢測印跡6，用羊抗小鼠IgG溶液印制的對照印跡7，檢測印跡和對照印跡形成的組合印跡為“十十”、“I ι”、“ι丄”、“ I- P，和“H H，，中的任KLH 一種。實施例二 五中，檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定，均同實施例一。實施例六試紙條的敏感性、特異性檢測以實施例一的試紙條進(jìn)行檢測，其他例子中的試紙條試驗結(jié)果和此相似。(I)用實施例一的試紙條分別檢測添加LIN濃度為0ng/g、100ng/g、200ng/g、400ng/g和800ng/g的雞肉樣品20份；室溫條件下操作,用肉眼觀測判定；結(jié)果顯示，Ong/mL的樣品全部為陰性；100ng/mL及其以上濃度的添加樣品全部為陽性。取試紙條分別檢測添加LIN濃度為Ong/g和100ng/g的雞肉樣品500份；室溫條件下操作，肉眼觀測判定；用Ong/g濃度的添加樣品計算假陽性率，假陽性率=假陽性樣品數(shù)/500。用100ng/g濃度的添加樣品計算假陰性率，假陰性率=假陰性樣品數(shù)/500。結(jié)果顯示，假陽性為3條，假陽性率為< 1% ;假陰性率為0%。(2)用已知陰性雞肉樣品配制林可霉素類藥物的標(biāo)準(zhǔn)樣，使其終濃度分別為1000ng/g，用實施例一的試紙條進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示除含LIN的樣品呈陽性、含克林霉素的樣品呈弱陽性外，與其它多種藥物均無交叉反應(yīng)，說明試紙條的反應(yīng)特異性較強。
權(quán)利要求1.一種林可霉素殘留快速檢測試紙條，底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護(hù)層固定在吸附層上，其特征是吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)林可霉素載體蛋白溶液印制的檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗體溶液印制的對照印跡；所述金標(biāo)抗體纖維層用吸附林可霉素的金標(biāo)抗體玻璃纖維棉制成，金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗林可霉素單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征是所述支撐層用硬質(zhì)塑膠片條或不吸水的硬紙條制成；吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水紙制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征是所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征是所述載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4任一項所述的試紙條，其特征是所述外層保護(hù)層為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋的保護(hù)膜，在吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層的交界處對應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該樣品標(biāo)記線偏向吸附纖維層一側(cè)O. 3 O. 7cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 4任一項所述的試紙條，其特征是所述檢測印跡和對照印跡為平行排列的“ Il ”直線式印跡，或為“十十”字型排列印跡，或為“Τ ~?！弊中团帕杏≯E，或為“丄丄”字型排列印跡，或為“ h卜”字型排列印跡，或為H，，字型排列印跡。
專利摘要本實用新型涉及一種林可霉素殘留快速檢測試紙條。試紙條底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測試樣品端依次為吸附纖維層、吸附偶聯(lián)林可霉素的金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上有用林可霉素載體蛋白溶液印制的檢測印跡以及用羊抗或兔抗小鼠IgG抗體溶液印制的對照印跡。該試紙條檢測的特異性強、敏感性高，操作簡便快速；檢測結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確，檢測時不需專用儀器設(shè)備和專業(yè)人員，成本低，投資少，容易推廣實施。
文檔編號G01N33/558GK202814982SQ20122039292
公開日2013年3月20日 申請日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者胡驍飛, 張改平, 邢廣旭, 職愛民, 王方雨, 張小輝, 楊繼飛 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院