專利名稱：一種檢測(cè)水產(chǎn)品中呋喃妥因代謝物的膠體金試劑板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)水產(chǎn)品中呋喃妥因代謝物的膠體金試劑板，具體涉及一種檢測(cè)呋喃妥因代謝物的免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板。
背景技術(shù)：
呋喃妥因是硝基呋喃類(lèi)藥物的一種，硝基呋喃類(lèi)藥物是一種廣譜抗生素，它有非常好的抗菌作用和藥動(dòng)力的特性，因價(jià)格較低且效果好，而被廣泛應(yīng)用，作為豬、禽類(lèi)和水產(chǎn)促生長(zhǎng)的添加劑。它主要用來(lái)治療由大腸桿菌或沙門(mén)氏菌所引起的腸炎、癤瘡、赤鰭病、潰瘍病等，藥效穩(wěn)定，能抑制或殺滅多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌，并對(duì)某些原蟲(chóng)、真菌有一定作用。硝基呋喃類(lèi)藥物被動(dòng)物服用之后，原藥分子在動(dòng)物體內(nèi)迅速代謝，其在體內(nèi)的穩(wěn)定性不超過(guò)幾小時(shí)，代謝的部分化合物分子與細(xì)胞膜蛋白結(jié)合成為結(jié)合態(tài)，結(jié)合態(tài)可長(zhǎng)期保持穩(wěn)定，從而延緩原藥在體內(nèi)的清除速度。而普通的食品加工方法難以使蛋白結(jié)合態(tài)殘留物大量降解。硝基呋喃類(lèi)藥物具有較強(qiáng)的細(xì)胞誘變性和動(dòng)物致癌毒性，食用含有該殘留物的肉制品會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的毒副作用。世界上許多國(guó)家限制甚至禁止使用此類(lèi)藥生產(chǎn)動(dòng)物源性食品，并規(guī)定了其在動(dòng)物源性食品中的檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)。歐盟已于1995年禁止在食用動(dòng)物中使用硝基呋喃類(lèi)抗生素，在動(dòng)物源性食品中呋喃類(lèi)殘留物的檢出限為不得檢出。我國(guó)也于2002頒布了禁止使用硝基呋喃類(lèi)抗生素的禁令。2004年底我國(guó)進(jìn)出口食品檢驗(yàn)檢疫局對(duì)出口歐盟的腸衣及肉類(lèi)產(chǎn)品增加了硝基呋喃(呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃妥因)代謝物項(xiàng)目的檢測(cè)。盡管我國(guó)政府和相關(guān)組織對(duì)該類(lèi)藥物的殘留給予了高度重視，但硝基呋喃類(lèi)藥物在水產(chǎn)動(dòng)物源性食品中的殘留仍時(shí)有發(fā)生。因此，為了保障人民身體健康，保證進(jìn)出口水產(chǎn)品的質(zhì)量，有必要尋求一種快速靈敏方便的篩選檢測(cè)方法。隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活水平質(zhì)量不斷提高，因而人們對(duì)食品質(zhì)量安全問(wèn)題也越來(lái)越重視。為確保進(jìn)出口及國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上動(dòng)物性食品禽肉、魚(yú)、蝦等的食用安全，需要快速準(zhǔn)確的殘留量分析方法。呋喃妥因在動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)定性較差，在體內(nèi)很快就能被代謝，呋喃妥因代謝物為I 一氨基乙內(nèi)酰脲(AHD)。代謝物與組織蛋白結(jié)合可以形成穩(wěn)定的化合物，因而在組織中結(jié)合的代謝產(chǎn)物(AHD)則能存留較長(zhǎng)的一段時(shí)間，所以藥殘監(jiān)測(cè)部門(mén)經(jīng)常以檢測(cè)其代謝產(chǎn)物一 AHD為手段達(dá)到檢測(cè)呋喃妥因殘留的目的。目前文獻(xiàn)報(bào)道的呋喃類(lèi)藥物殘留的分析方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)和酶聯(lián)免疫法。HPLC、LC-MS應(yīng)用較普遍，精確度和靈敏度高，但因其流程繁瑣、設(shè)備昂貴、檢測(cè)速度慢等原因，很難實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和普及推廣。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)，該法精確、靈敏，檢測(cè)時(shí)間大大縮短，但是ELISA法中酶的活性易受反應(yīng)條件影響，由此易造成測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較差。此外ELISA試劑壽命短，因此需要低溫保藏?；诳乖贵w特異性反應(yīng)建立起來(lái)的免疫學(xué)測(cè)定方法靈敏度較高，特異性強(qiáng)，試樣預(yù)處理簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，使用方便。因此，在現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和基層的大規(guī)模篩選檢測(cè)中，免疫學(xué)檢測(cè)方法更實(shí)際。[0006]膠體金免疫層析法是在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡(jiǎn)易快速的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，除了具備酶聯(lián)免疫法的諸多優(yōu)點(diǎn)外，還克服了酶聯(lián)免疫法的一些不足。該方法將反應(yīng)所需要的原料的全部或大部分均已整合到試劑中，反應(yīng)通常只需數(shù)分鐘，測(cè)試結(jié)果以肉眼可見(jiàn)的顯色條帶來(lái)判斷。具有簡(jiǎn)便快速、操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、不需要額外設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型針對(duì)檢測(cè)需求，研制開(kāi)發(fā)一種檢測(cè)限符合要求，重現(xiàn)性好，檢測(cè)時(shí)間短，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，技術(shù)產(chǎn)品或儀器設(shè)備成本較低，運(yùn)行費(fèi)用低的快速檢測(cè)試劑。本實(shí)用新型試劑板應(yīng)用層析式抗體免疫競(jìng)爭(zhēng)原理，通過(guò)抗原和金標(biāo)抗體反應(yīng)顯色，特異性檢測(cè)水產(chǎn)樣品中的呋喃妥因代謝物殘留水平。檢測(cè)樣品包括魚(yú)、蝦等水產(chǎn)品。如果樣品溶液中含有呋喃妥因代謝物殘留，呋喃妥因代謝物先和膠體金顆粒上的抗體反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨樣品溶液擴(kuò)散至檢測(cè)線時(shí)，膠體金顆粒上抗體的活性位點(diǎn)因被樣品溶液中的呋喃妥因代謝物藥物占據(jù)而無(wú)法與檢測(cè)線上呋喃妥因代謝物特異性抗原結(jié)合；當(dāng)樣品中的呋喃妥因代謝物含量超過(guò)試劑板檢出限時(shí)，試劑板上的檢測(cè)線顯色較控制線淺甚至無(wú)顯色，判定為陽(yáng)性。反之，當(dāng)樣品中呋喃妥因代謝物含量在試劑板檢出限以下或無(wú)殘留時(shí)，試劑板上的檢測(cè)線顯色與控制線相近或偏深，判定為陰性。本實(shí)用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。相鄰各部分間有1_2_的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行。膠體金結(jié)合墊上包被有抗呋喃妥因代謝物單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有呋喃妥因代謝物-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測(cè)線和控制線。偶聯(lián)呋喃妥因代謝物的載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血監(jiān)蛋白等。本實(shí)用新型試劑板的各部分組成成分和功能如下塑料模板，起固定背襯和標(biāo)示各功能區(qū)(加樣孔、檢測(cè)區(qū)、控制區(qū))的作用。背襯，由一面涂有不干膠的不吸水韌性材料制成，起固定支撐試劑板其他組成部分的作用。樣品墊，由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液和緩沖樣品溶液pH值的作用。膠體金結(jié)合墊，由聚酯膜制成，其上有抗呋喃妥因代謝物單克隆抗體與膠體金顆粒的結(jié)合物，為樣品溶液中有效成分和金標(biāo)抗體反應(yīng)提供場(chǎng)所。硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測(cè)線和控制線，將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見(jiàn)的顏色表征出來(lái)。吸水墊，由濾紙制成，將反應(yīng)過(guò)程中多余的溶液吸收。本實(shí)用新型試劑板具有如下有益效果(I)特異性好。本實(shí)用新型試劑板對(duì)呋喃妥因代謝物的交叉反應(yīng)率為100%，對(duì)如呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物等抗生素的交叉反應(yīng)率均低于I %?？梢?jiàn)，本實(shí)用新型試劑板對(duì)呋喃妥因代謝物反應(yīng)具有高度專一性。(2)靈敏度高。本實(shí)用新型試劑板對(duì)水產(chǎn)品中呋喃妥因代謝物的檢出限為I. ομ g/kg，在水產(chǎn)品中對(duì)呋喃妥因代謝物的檢測(cè)達(dá)到了較優(yōu)水平，適用于各類(lèi)企業(yè)及檢測(cè)機(jī)構(gòu)。(3)操作簡(jiǎn)單快捷。本實(shí)用新型試劑板將反應(yīng)所需的大部分原料整合到PVC背襯中，滴樣后，抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，大大縮短檢樣時(shí)間，且樣品無(wú)需特殊處理，滴樣后5-10分鐘即可用肉眼通過(guò)判斷硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線和控制線的顏色深淺讀取結(jié)果。檢測(cè)實(shí)施過(guò)程不依賴任何實(shí)驗(yàn)設(shè)備，普通人員均可操作，不需專業(yè)培訓(xùn)。(4)成本低，易推廣。本實(shí)用新型試劑板生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單,流程成熟。生產(chǎn)成本低廉,投資少，收效快。

圖I為呋喃妥因代謝物免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板背襯結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為樣品墊，2為膠體金結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測(cè)線，5為控制線，6為吸水墊，7為不干膠，8為PVC底板。圖2為呋喃妥因代謝物免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控制區(qū)，T為檢測(cè)區(qū)。圖3a是呋喃妥因代謝物免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板結(jié)果判定陰性示意圖；圖3b是呋喃妥因代謝物免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板結(jié)果判定陽(yáng)性示意圖；圖3c是呋喃妥因代謝物免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板結(jié)果判定無(wú)效示意圖，其中C為控制區(qū)，T為檢測(cè)區(qū)。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型試劑板的制備包括載體蛋白偶聯(lián)物的制備，抗呋喃妥因代謝物單克隆抗體的制備，膠體金溶液的制備，膠體金標(biāo)記抗呋喃妥因代謝物單克隆抗體的制備和呋喃妥因代謝物免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的組裝。1.半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)呋喃妥因代謝物對(duì)醛基苯甲酸衍生物合成稱取3g對(duì)醛基苯甲酸于IOmL蒸餾水中，滴加二甲基甲酰胺(DMF)至對(duì)醛基苯甲酸完全溶解，攪拌中加入I. Og呋喃妥因代謝物，室溫反應(yīng)2h，過(guò)濾水洗得白色固體即為呋喃妥因代謝物對(duì)醛基苯甲酸衍生物。呋喃妥因代謝物對(duì)醛基苯甲酸衍生物-牛血清蛋白(BSA)的合成稱取23. 4mg呋喃妥因代謝物對(duì)醛基苯甲酸衍生物溶于2mLDMF，攪拌加入27. 5mg的DCC，14. 4mg的NHS, 4 °C反應(yīng)過(guò)夜,5000r/min離心IOmin,取上清液標(biāo)記為A液。取170mg的BSA溶于IOmLO. lmol/L的PBS (pH8. O)緩沖溶液，加入ImL的DMF溶解，標(biāo)記為B液。將A液逐滴加入到B液中，同時(shí)攪拌。4°C下密封反應(yīng)4h。5000r/min下離心IOmin,取上清液，4°C下PBS (pH 7. 4)透析3d，每天換液2次。反應(yīng)產(chǎn)物_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。用卵清蛋?OVA)替代BSA，采用同樣方法制備呋喃妥因代謝物對(duì)醛基苯甲酸衍生物-卵清蛋白偶聯(lián)物。2.抗呋喃妥因代謝物單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的BSA偶聯(lián)物與等體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強(qiáng)免疫I次，用不完全佐劑腹腔注射。融合前3d強(qiáng)化免疫I次，不用佐劑，劑量加倍。細(xì)胞融合按常規(guī)方法進(jìn)行將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按I : 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初篩選擇10mg/L BSA包被酶聯(lián)板，被測(cè)孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRPd 1000)，oro顯色。篩選出的陽(yáng)性孔再用卵清蛋白偶聯(lián)物包被的酶聯(lián)板進(jìn)行阻斷間接ELISA。將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2X 10-3mol/L呋喃妥因代謝物溶液等量混合，37°C感作·lh，加入已包被的酶標(biāo)板中。另外用PBS (O. 01mol/L、pH7. 4)替代呋喃妥因代謝物溶液作對(duì)照，其余步驟同上。若呋喃妥因代謝物阻斷后的OD值降至對(duì)照孔的50%以下，則判為陽(yáng)性孔。經(jīng)2 3次檢測(cè)都呈陽(yáng)性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。體外培養(yǎng)將克隆化的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)5 X 105/mL時(shí)停止換液，細(xì)胞全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內(nèi)誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細(xì)胞株107個(gè)細(xì)胞，7天后抽取腹水。3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在IOOmL去離子水中加入ImL 1%檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImL 1%氯金酸，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，4°C下保存?zhèn)溆谩?.膠體金標(biāo)記抗呋喃妥因代謝物單克隆抗體的制備取已制備好的IOOmL膠體金溶液，用O. lmol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8.0。邊攪拌邊加入I. 5mg抗呋喃妥因代謝物單抗,攪拌20min,再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20，OOOrpm 離心 15min,棄上清液，加入 IOmLpH 7. 4PBS 緩沖液(含O. 4mol/L PEG)清洗2次。將沉淀用5mL含2% BSA的PBS緩沖液(pH 7. 4)溶解，用O. 22 μ m無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?.呋喃妥因代謝物免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板的組裝參照?qǐng)D1，用點(diǎn)膜機(jī)把適當(dāng)濃度的載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測(cè)線和控制線，37°C烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標(biāo)記呋喃妥因代謝物單克隆抗體包被在膠體金結(jié)合墊上。檢測(cè)試劑組成為PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用切割機(jī)將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測(cè)試劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲(chǔ)存。6.呋喃妥因代謝物免疫膠體金快速檢測(cè)試劑板檢測(cè)實(shí)施操作方法6. I樣品制備取一定量的去脂肪組織樣本，用剪刀剪碎，稱取2g剪碎樣本于50mL離心管中，并加入4mL去離子水,O. 5mL lmol/L的鹽酸,0. ImL樣本衍生化試劑,充分混合3min ;60°C水浴條件下孵育lh，取出后加入5mL O. lmol/L的磷酸氫二鉀，O. 4mL lmol/L的氫氧化鈉，6mL提取劑，充分混合lmin,4000r/min,離心5min,移取上層溶液3mL于5mL離心管中，60°C下空氣吹干，向吹干的試管中加入ImL凈化劑，加蓋振蕩lmin，然后加入0. 3mL復(fù)溶液，充分混勻，4000r/min,離心Imin (或靜置至明顯分層)，吸取0. I μ L下層溶液,待檢。6. 2檢測(cè)步驟從包裝袋中取出試劑板，吸取待檢樣品溶液100 μ L滴加到加樣孔中，加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)；結(jié)果應(yīng)在3 5min讀取，其他時(shí)間判讀無(wú)效。觀察時(shí)，試劑板水平放置于觀察者正面。[0047]6. 3結(jié)果判讀讀取結(jié)果時(shí)，將試劑板水平置于觀察者正面，如圖2右側(cè)所示。陰性㈠T線顯色比C線深或一樣深，表示樣品中呋喃妥因代謝物殘留含量低于
I.O μ g/kg或不含呋喃妥因代謝物殘留。如圖3. a所示。陽(yáng)性⑴T線顯色比C線淺，或T線無(wú)顯色，表示樣品中呋喃妥因代謝物殘留含量聞?dòng)贗. O μ g/kg ；T線顯色比C線越淺,表不樣品中咲喃妥因代謝物殘留含量越聞。如圖3. b所示。無(wú)效未出現(xiàn)C線，可能是操作不當(dāng)或試劑板已失效。應(yīng)再次閱讀說(shuō)明書(shū)，并用新的試劑板重新測(cè)試。如圖3. c所示。
權(quán)利要求1.一種檢測(cè)水產(chǎn)品中呋喃妥因代謝物的膠體金試劑板，其特征在于試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，試劑板背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，相鄰各部分間有l(wèi)-2mm的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求I所說(shuō)的試劑板，其特征在于試劑板的硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測(cè)線和控制線，將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見(jiàn)的顏色表征出來(lái)。
3.如權(quán)利要求I所說(shuō)的試劑板，其特征在于，樣品墊由玻璃纖維制成，膠體金結(jié)合墊由聚酯膜制成，吸水墊為濾紙。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)水產(chǎn)品中呋喃妥因代謝物的膠體金試劑板，可用于檢測(cè)水產(chǎn)品中的呋妥因代謝物殘留。本實(shí)用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測(cè)線和控制線，可將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見(jiàn)的顏色表征出來(lái)。該試劑板可進(jìn)行半定量直觀檢測(cè)，整個(gè)操作過(guò)程僅需2小時(shí)左右，且無(wú)需任何昂貴實(shí)驗(yàn)設(shè)備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)、海洋與漁業(yè)局、水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)部門(mén)等對(duì)水產(chǎn)品中非法使用呋喃妥因藥物進(jìn)行大規(guī)?？焖贆z測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK202735349SQ201220302060
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者吳光紅, 張美琴, 張素青, 邵偉 申請(qǐng)人:杭州南開(kāi)日新生物技術(shù)有限公司