專利名稱：一種沙丁胺醇的免疫學(xué)檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及動物性食品安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)中興奮劑殘留檢測的試劑盒，特別是一種用于檢測動物性食品和飼料原材料中沙丁胺醇的免疫學(xué)檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
隨著畜牧業(yè)的快速、集約化發(fā)展，促進(jìn)生長等非治療用獸用藥物在畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中的應(yīng)用顯著增加，由此導(dǎo)致的動物源性食品藥物殘留對消費者的健康和環(huán)境的潛在危害也日趨嚴(yán)重。從上世紀(jì)80年代起，歐盟等西方發(fā)達(dá)國家就明令禁止在動物飼養(yǎng)中使用合成激素和限制使用獸藥，我國在新頒布的《飼料和飼料添加劑管理條例》中也明確指出“生產(chǎn)飼料和飼料添加劑不得添加激素類藥物”。但近年來，“瘦肉精”鹽酸克倫特羅常被發(fā)現(xiàn)非法添加在動物飼料中以增加飼料報酬，導(dǎo)致嚴(yán)重的瘦肉精中毒事件時有發(fā)生，政府監(jiān)管力度也因此不斷加強。為逃避監(jiān)管，不法者不斷尋找新的“瘦肉精”替代品。沙丁胺醇(Salbutamol，SAL),又名舒喘寧、索布氨、阿布叔醇等，化學(xué)名稱I- (4-羥基-3-羥甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇，與鹽酸克羅特侖、萊克多巴胺一樣是一種苯酚胺類β_腎上腺素激動劑，有松弛支氣管平滑肌等作用，在醫(yī)學(xué)上廣泛用于防治支氣管哮喘以及哮喘型慢性支氣管炎、肺氣腫等呼吸系統(tǒng)疾病。沙丁胺醇具有營養(yǎng)再分配作用，通過刺激蛋白質(zhì)的合成而引起纖維細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)增多，體積增大，以及蛋白質(zhì)降解減緩，脂肪形成減少，進(jìn)而提高瘦肉率。沙丁胺醇由于生產(chǎn)成本低廉，作為一種新型促生長添加劑在畜產(chǎn)品生產(chǎn)中使用，尤其是當(dāng)“瘦肉精”鹽酸克倫特羅全面禁止使用后，沙丁胺醇便成為畜產(chǎn)品生產(chǎn)中獸藥添加劑的常用藥品。但人體沙丁胺醇攝入量過大時對心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)會產(chǎn)生明顯的刺激作用，引發(fā)肌肉顫抖、心悸、心慌、頭疼、目眩，嚴(yán)重者有惡心、嘔吐等癥狀，甚至危及生命。2002年我國農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部公布沙丁胺醇、西馬特羅、特步他林、克倫特羅、萊克多巴胺、多巴胺等6種禁用獸藥興奮劑，并且要求在肉制品中不得檢出，即含量小于或等于O. I μ g/kg，因此，建立科學(xué)、高效、簡便的沙丁胺醇?xì)埩舯O(jiān)控方法十分必要。目前，檢測沙丁胺醇的方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。GC-MS、HPLC和LC-MS雖然檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但成本高、操作復(fù)雜，而且樣品的前處理涉及到有機(jī)溶劑提取、液液萃取和固相萃取等多種操作步驟，過程十分復(fù)雜、耗時。ELISA檢測是一種基于抗原抗體反應(yīng)和酶化學(xué)反應(yīng)的檢測方法，具有特異性強、靈敏度高、易操作、方便快捷、成本低、安全可靠等優(yōu)點，而且不需要復(fù)雜昂貴的的儀器設(shè)備，對操作者的專業(yè)要求也比較低，是目前快速檢測此類藥物較普遍的篩選方法。但我國目前國產(chǎn)沙丁胺醇酶聯(lián)免疫試劑盒不多，且檢測靈敏度和穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高，因此研制高靈敏、穩(wěn)定性好的沙丁胺醇?xì)埩魴z測ELISA試劑盒對于促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展、維護(hù)群眾健康具有積極意義。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的是提供了一種小巧輕便的沙丁胺醇免疫學(xué)檢測試劑盒，使用該試劑盒操作簡便，檢測快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，可進(jìn)行一次連續(xù)多個樣品中沙丁胺醇含量的測定，減少了檢驗樣本所需要的時間。本實用新型的技術(shù)方案是一種沙丁胺醇的免疫學(xué)檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于盒體內(nèi)包含有酶標(biāo)板、蓋板膜、14瓶試劑和具有下凹瓶位的模具，所述的酶標(biāo)板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，酶標(biāo)板采用96孔試劑板作為固相載體，微孔條上預(yù)包被沙丁胺醇偶聯(lián)抗原后固定于酶標(biāo)板的外框支撐架上，每個可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔；所述的蓋板膜大小與酶標(biāo)板一致；所述的模具上的下凹瓶位分別為標(biāo)準(zhǔn)液瓶位、高濃度標(biāo)準(zhǔn)液瓶位、酶標(biāo)二抗工作液瓶位、沙丁胺醇抗體瓶位、顯色液A液瓶位、顯色液B液瓶位、終止液瓶位、濃縮洗滌液瓶位、濃縮樣品稀釋液瓶位。所述的盒體是硬紙盒；所述的酶標(biāo)板由聚苯乙烯制成，放于真空鋁鉬袋內(nèi)；所述的蓋板膜是透明塑料硬膜，放于鋁鉬袋內(nèi)；所述的14瓶試劑分別為6瓶標(biāo)準(zhǔn)液、I瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn)液、I瓶酶標(biāo)二抗工作液、I瓶沙丁胺醇抗體、I瓶顯色液A液、I瓶顯色液B液、I瓶終止液、I瓶濃縮洗滌液、I瓶濃縮樣品稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)液均用白色瓶帽的乳白色塑料瓶盛裝，酶標(biāo)二抗工作液用紅色瓶 帽的白色塑料瓶盛裝，沙丁胺醇抗體用黃色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，顯色劑A液用黑色瓶帽的黑色塑料瓶盛裝，顯色劑B液用綠色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，終止液用綠色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，濃縮洗滌液和樣品稀釋液用白色瓶帽的半透明塑料瓶盛裝；所述的模具由塑料泡沫制成，具有14個下凹瓶位，14個試劑瓶依次放入對應(yīng)下凹瓶位內(nèi)。所述的6瓶標(biāo)準(zhǔn)液，均為 Iml/ 瓶，濃度分別為 Ong/ml,O. 02ng/ml,O. 06ng/ml,O. lng/ml,0. 3ng/ml,0. 8ng/ml ;高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液I瓶，lml/瓶；酶標(biāo)二抗工作液I瓶，6ml/瓶；沙丁胺醇抗體工作液I瓶，6ml/瓶；顯色液A液I瓶，7ml/瓶；顯色液B液I瓶，7ml/瓶；終止液I瓶，7ml/瓶；濃縮洗滌液(IOX) I瓶，40 ml/瓶；濃縮樣品稀釋液(2X) I瓶，40 ml/瓶。本實用新型用不同大小、不同顏色的塑料瓶盛裝并固定在泡沫塑料模具中與酶標(biāo)板、蓋板膜、自封袋、說明書和質(zhì)控報告一同封裝在硬紙盒內(nèi)，以便于攜帶和運輸。每一個試劑盒中的試劑足夠進(jìn)行96份測定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔)，即可進(jìn)行一次連續(xù)多個樣品的檢測，也可將酶標(biāo)板微孔條拆開進(jìn)行多次使用。此時，將剩下的微孔條放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。檢測時，樣本中的殘留物沙丁胺醇將和微孔條上預(yù)包被的沙丁胺醇偶聯(lián)抗原竟?fàn)幙股扯“反伎贵w，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物沙丁胺醇的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物沙丁胺醇的含量，其操作簡便易行。經(jīng)實驗表明本試劑盒具有很聞的靈敏度檢測緩沖液中最低檢測限為O. 2ng/ml,動物組織中最低檢測限為O. 6ng/ml，尿樣樣品中最低檢測限為O. 2ng/ml，飼料樣品中最低檢測限為20ng/ml ;回收率組織樣品中為80± 10%、尿樣樣品中為80±10%、飼料樣品中80± 10%，且試劑盒的變異系數(shù)均小于10%。相對于其他興奮劑殘留檢測，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標(biāo)儀、勻質(zhì)器、振蕩機(jī)和微量加樣器，同類實驗室一般均有配備，操作簡單易行，所需成本較低。本實用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確地用于動物源性食品中沙丁胺醇?xì)埩舻亩?、定性檢測。

圖I是本實用新型中酶標(biāo)板的主視圖；[0010]圖2是圖I中沿A-A的縱向剖視圖；圖3是本實用新型蓋板膜的主視圖；圖4是本實用新型中試劑瓶的主視圖；圖5是本實用新型中具有下凹瓶位模具的結(jié)構(gòu)示意圖；圖6是本實用新型中盒體與具有下凹瓶位模具的結(jié)構(gòu)示意圖。圖面說明1、支撐架；2、微孔條；3、沙丁胺醇偶聯(lián)抗原；4、蓋板膜；5、洗滌液或樣品稀釋液白色瓶蓋；6、半透明塑料試劑瓶；7、黃色瓶蓋或紅色瓶帽；8、黑色瓶蓋；9、黑色塑料試劑瓶；10、綠色瓶蓋；11、白色塑料試劑瓶；12、標(biāo)準(zhǔn)品溶液白色瓶蓋；13、6ml沙丁胺醇抗體工作液瓶位；14、6ml酶標(biāo)二抗工作液瓶位；15、7ml底物顯色劑A液瓶位；16、lml高濃度沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位；17、7ml底物顯色劑B液和7ml終止液瓶位；18、6種lml/瓶各·種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液瓶位；19、40ml濃縮洗滌液瓶位；20、40ml濃縮樣品稀釋液瓶位；21、具有下凹瓶位的模具；22、盒體。
具體實施方式
結(jié)合附圖詳細(xì)描述實施例。酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被沙丁胺醇偶聯(lián)抗原(3)后固定于酶標(biāo)板的外框支撐架(I)上，且酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標(biāo)板置水浴或恒溫箱內(nèi)反應(yīng)時封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2);白色瓶帽(5)的半透明塑料試劑瓶(6)用于封裝40ml濃縮洗滌液或40ml濃縮樣品稀釋液；黃色瓶帽(7)的白色塑料試劑瓶用于封裝6ml沙丁胺醇抗體工作液，紅色瓶帽(7)的白色塑料試劑瓶用于封裝6ml酶標(biāo)二抗工作液；黑色瓶帽(8)的黑色塑料試劑瓶(9)用于封裝7ml底物顯色劑A液，綠色瓶帽
(10)的白色塑料試劑瓶(11)用于封裝7ml底物顯色劑B液或7ml終止液；白色瓶帽(12)的半透明塑料試劑瓶用于封裝lml/瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；實用新型盒體(22)內(nèi)置新型具有下凹瓶位的固定泡沫模具(21),上有14個瓶位,放置位置依次為6ml沙丁胺醇抗體工作液瓶位(13)，6ml酶標(biāo)二抗工作液瓶位(14)，7ml底物顯色劑A液瓶位(15)，Iml高濃度沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位(16)，7ml底物顯色劑B液或7ml終止液瓶位(17)，6種lml/瓶各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液瓶位(18)，40ml濃縮洗滌液瓶位(19)，40ml濃縮樣品稀釋液瓶位(20)。飼料樣品中沙丁胺醇含量測定I)樣本前處理稱取I. 0±0. 05g樣品于50ml離心管中；加入O. IM的HCl溶液IOml,用潤旋儀潤動6 8min ；4000r/min離心IOmin ;取Iml上清液,用IM NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7. O 8. O (大約20ml) ；4000r/min離心5min ;取上清IOOml力口入至丨J 900ml稀釋后的樣品稀釋液中并混勻；取30ml用于樣品分析。2)使用試劑盒的操作步驟①將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20 25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻取出需要數(shù)量的微孔條，將不用的微孔條放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2 8°C 洗滌工作液在使用前也需回溫編號將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置； 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μ I到對應(yīng)的微孔中，隨即加入酶標(biāo)二抗工作液50 μ I /孔，再加入沙丁胺醇抗體工作液50 μ I /孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min 洗板小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液300 μ I/孔，充分洗滌5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)顯色加入底物顯色劑A液50 μ I/孔，再加底物顯色劑B液50 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光環(huán)境反應(yīng)15 20min ·Μ測定加入終止液50 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測法可進(jìn)行判定)。3)結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第I種方法，而定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含沙丁胺醇成負(fù)相關(guān)。①用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本I的吸光度值為O. 659，樣本2的吸光度值為I. 725，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是0ng/ml為2. 523 ；0. 2ng/ml 為 2. 217 ；0. 6ng/ml 為 I. 566 ；1. 8ng/ml 為 O. 842 ；5. 4ng/ml 為 O. 387 ；16. 2ng/ml為O. 145。則樣品I的濃度范圍是I. 8ng/ml 5. 4ng/ml ;樣品2的濃度范圍是
O.2ng/ml O. 6ng/ml，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣品中沙丁胺醇的濃度范圍。②準(zhǔn)確定量計算分兩個步驟第一步，百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值(％) = B/ B0 X 100%式中，B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值；Btl —O (ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。第二步，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中沙丁胺醇實
際含量。4)注意事項①室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(20 25°C)會導(dǎo)致所有OD值偏低；②在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作；③每加一種試劑前需將其搖勻；④反應(yīng)終止液為濃度2 mol/1的硫酸,避免接觸皮膚；⑤不使用過有效日期的試劑盒；不使用過有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑；⑥保存試劑盒于2 8°C，不可冷凍，將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑(底物液)對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；⑦試劑變質(zhì)的跡象底物液有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。O標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于O. 5 (A450nm<0. 5)時，表示試劑可能變質(zhì)；⑧在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時間為15 20min即可。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到30min (或更長)。反之，則減短反應(yīng)時間；⑨該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為37°C，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
權(quán)利要求1.一種沙丁胺醇的免疫學(xué)檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于盒體內(nèi)包含有酶標(biāo)板、蓋板膜、14瓶試劑和具有下凹瓶位的模具，所述的酶標(biāo)板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，酶標(biāo)板采用96孔試劑板作為固相載體，微孔條上預(yù)包被沙丁胺醇偶聯(lián)抗原后固定于酶標(biāo)板的外框支撐架上，每個可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔；所述的蓋板膜大小與酶標(biāo)板一致；所述的模具上的下凹瓶位分別為標(biāo)準(zhǔn)液瓶位、高濃度標(biāo)準(zhǔn)液瓶位、酶標(biāo)二抗工作液瓶位、沙丁胺醇抗體瓶位、顯色液A液瓶位、顯色液B液瓶位、終止液瓶位、濃縮洗滌液瓶位、濃縮樣品稀釋液瓶位。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的沙丁胺醇的免疫學(xué)檢測試劑盒，其特征在于所述的盒體是硬紙盒；所述的酶標(biāo)板由聚苯乙烯制成，放于真空鋁鉬袋內(nèi)；所述的蓋板膜是透明塑料硬膜，放于鋁鉬袋內(nèi)；所述的14瓶試劑分別為6瓶標(biāo)準(zhǔn)液、I瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn)液、I瓶酶標(biāo)二抗工作液、I瓶沙丁胺醇抗體、I瓶顯色液A液、I瓶顯色液B液、I瓶終止液、I瓶濃縮洗滌液、I瓶濃縮樣品稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)液均用白色瓶帽的乳白色塑料瓶盛裝，酶標(biāo)二抗工作液用紅色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，沙丁胺醇抗體用黃色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，顯色劑A液用黑色瓶帽的黑色塑料瓶盛裝，顯色劑B液用綠色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，終止液用綠色瓶帽的白色塑料瓶盛裝，濃縮洗滌液和樣品稀釋液用白色瓶帽的半透明塑料瓶盛裝；所述的模具由塑料泡沫制成，具有14個下凹瓶位，14個試劑瓶依次放入對應(yīng)下凹瓶位內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的沙丁胺醇的免疫學(xué)檢測試劑盒，其特征在于所述的6瓶標(biāo)準(zhǔn)液，均為 Iml/ 瓶，濃度分別為 Ong/ml, O. 2ng/ml, O. 6ng/ml, I. 8ng/ml, 5. 4ng/ml,，16. 2ng/ml ;高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液I瓶，lml/瓶；酶標(biāo)二抗工作液I瓶，6ml/瓶；沙丁胺醇抗體工作液I瓶，6ml/瓶；顯色液A液I瓶，7ml/瓶；顯色液B液I瓶，7ml/瓶；終止液I瓶，7ml/瓶；濃縮洗滌液(IOX) I瓶，40 ml/瓶；濃縮樣品稀釋液(2X) I瓶，40 ml/瓶。
專利摘要本實用新型涉及一種沙丁胺醇的免疫學(xué)檢測試劑盒。本實用新型的技術(shù)方案要點為一種沙丁胺醇的免疫學(xué)檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于盒體內(nèi)包含有酶標(biāo)板、蓋板膜、14瓶試劑和具有下凹瓶位的模具，所述的酶標(biāo)板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，酶標(biāo)板采用96孔試劑板作為固相載體，微孔條上預(yù)包被沙丁胺醇偶聯(lián)抗原后固定于酶標(biāo)板的外框支撐架上，每個可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔；所述的模具上具有14個下凹瓶位，14瓶試劑依次放入對應(yīng)下凹瓶位內(nèi)。本實用新型能實現(xiàn)快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確地進(jìn)行一次連續(xù)多個樣品中沙丁胺醇含量的測定。
文檔編號G01N33/543GK202614762SQ20122025242
公開日2012年12月19日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者姜金慶, 齊永華, 劉俊偉, 李任峰, 常新耀, 李桂平, 楊志, 郭芳, 鄧云娟, 趙莉 申請人:河南知微生物工程有限公司