專利名稱：皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型屬于涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。
背景技術(shù)：
皮質(zhì)醇，也可稱為“可的松”，是腎上腺在應(yīng)激反應(yīng)里產(chǎn)生的一種類激素。也是最主要的糖皮質(zhì)激素。它的含量占血中17-羥類固醇總量的4/5。人每日分泌量約為200mg，且此分泌呈明顯的時辰節(jié)律變化。一般于午夜或清晨I點左右分泌最少，血漿含量最低，凌 晨4時分泌開始增加，至早6 8時分泌最多。8時以后逐漸分泌減少，下午5時左右分泌量較清晨最高值比下降50%或50%以上。半衰期為80 120分鐘。分泌入血后，絕大部分與類固醇激素結(jié)合球蛋白(CBG)結(jié)合。血中游離皮質(zhì)醇只占總皮質(zhì)醇的1% 3%，但只有游離的才有生物學活性。通常游離與結(jié)合的皮質(zhì)醇保持相對平衡。皮質(zhì)醇通過糖異生途徑，在抗炎反應(yīng)以及穩(wěn)定血壓等方面起作用。皮質(zhì)醇還通過細胞內(nèi)受體影響許多生理系統(tǒng)，如免疫反應(yīng)、血糖調(diào)節(jié)、血管緊張度調(diào)節(jié)、酶促反應(yīng)、骨骼新陳代謝等，在當前臨床醫(yī)學和藥物學的研究中，測定皮質(zhì)醇的水平是一項重要的指標。病理學改變1.增高見于柯興氏綜合征、胰島炎、妊娠中毒、甲狀腺機能減退、肝病、哮喘病危象、高山病早期、意外的體溫過低、男子女性化、某些精神病患者，不平衡性糖尿病。濃度升高但有節(jié)律性見于發(fā)熱、劇烈疼痛。夜間不減少，且無晝夜節(jié)律，見于急性感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤及炎癥，并有顱內(nèi)壓升高，肢端肥大癥，癌癥，充血性心力衰竭(特別是右側(cè)心衰)、肝損傷、腎血管性高血壓、垂體機能亢進。2.降低見于阿狄森(Addison)氏病，兼有原發(fā)性腎上腺皮質(zhì)衰竭；垂體機能減退，合并繼發(fā)性腎上腺皮質(zhì)衰竭；腎小腺切除術(shù)后及嚴重感染的低血壓癥患者。由血中皮質(zhì)醇測定，同時進行尿中17-0HCS的測定，可以引起出垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)功能異常的診斷步驟。目前國際上對血清中皮質(zhì)醇的檢測方法主要分為色譜技術(shù)和免疫分析技術(shù)。色譜分析法包括氣象色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用和液質(zhì)聯(lián)用法等，雖然色譜法具有靈敏度高、準確性和重復性好等優(yōu)勢，但需要昂貴的儀器設(shè)備，而且檢測過程繁瑣、樣本前處理的技術(shù)要求很高，難于操作。檢測人員需要具備專業(yè)的檢測技能和豐富的實驗經(jīng)驗。常用的免疫分析技術(shù)包括放射免疫分析法(Radioimmunoas say, RIA)、化學發(fā)光免疫分析法(Chemiluminescent immunoassay, CLIA)和酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)。放射免疫分析法(Radioimmunoassay, RIA)是一種應(yīng)用放射性同位素的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合而成的體外微量分析方法。雖然該技術(shù)特異性較高，靈敏度也較高，但其局限性也很顯著，主要有以下幾點I)原料來源必須使用放射性核素，需要防護和防止污染。2)穩(wěn)定性差放射性同位素易衰減，標記抗原有效使用時間短。3)難以實現(xiàn)操作和測量的自動化。[0011 ] 化學發(fā)光免疫分析法(Chemiluminescent immunoas say, CLIA)包含兩個部分，即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學發(fā)光系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)，其基本原理同酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),常采用雙抗體夾心法、競爭法、間接法等反應(yīng)模式，化學發(fā)光系統(tǒng)的原理在于免疫反應(yīng)中的酶作用于發(fā)光底物。發(fā)光底物在酶的作用下，底物發(fā)生化學反應(yīng)并釋放出大量的能量，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體。這種激發(fā)態(tài)中間體，當其回到穩(wěn)定的基態(tài)時，可同時發(fā)射出光子。利用發(fā)光信號測量儀器即可測量光量子產(chǎn)額，該光量子產(chǎn)額與樣品中的待測物質(zhì)的量成正比。由此可以建立標準曲線并計算樣品中待測物質(zhì)的含量?；瘜W發(fā)光法雖具有高靈敏度、高準確度、高精密度、寬線性、反應(yīng)快速，影響因素少，結(jié)果準確等優(yōu)點，但化學發(fā)光法的缺點是儀器、試劑成本高。因此，有必要選用一種快速、簡便能夠定量且靈敏度、準確度和特異性高的方法來進行皮質(zhì)醇的檢測
實用新型內(nèi)容
本實用新型目的是皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其操作簡便，成本低，穩(wěn)定性好，可以滿足普通實驗室的要求。為了實現(xiàn)本實用新型的目的，擬采用如下技術(shù)方案本實用新型一方面涉及一種皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包括酶標板，所述酶標板包括固相載體和包被層，其特征在于所述固相載體上設(shè)置有多個微孔，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述包被層是由皮質(zhì)醇抗體和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相載體的微孔表面上形成的復合層。在本實用新型的一個優(yōu)選實施方式中，所述的多個微孔是指96個微孔。在本實用新型的一個優(yōu)選實施方式中，所述的固相載體是聚苯乙烯酶標板。本專利通過高效的偶聯(lián)方法的得到穩(wěn)定性好的皮質(zhì)醇-3-肟-BSA，并通過免疫動物得到特異性高及親和力強的抗皮質(zhì)醇抗體，用來制備皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。通過與RIA和CLIA試劑盒的比較，其靈敏度、精密度、準確性和試劑盒有效期等方面均優(yōu)于放射免疫法，與CLIA試劑盒差異性不大，但由于其所需儀器及試劑費用低，更適用于基層試驗室。同時由于ELISA試劑盒采用TMB作為顯色底物，所以其試劑盒具有穩(wěn)定性高和低毒性的優(yōu)點，且實驗操作較RIA試劑盒及質(zhì)譜法簡單、不需特殊防護、周期短，可以滿足普通實驗室的要求。

圖I為本實用新型一具體實施例酶標板結(jié)構(gòu)示意圖。I固相載體，2微孔,3包被層。
具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施例對本實用新型作進一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本實用新型并能予以實施，但所舉實施例不作為對本實用新型的限定。如圖I所示，本實用新型試劑盒的酶標板，其包括固相載體I和包被層3，固相載體I采用96孔聚苯乙烯酶標板。固相載體I上有多個微孔2，包被層3附著在固相載體上的微孔2上。包被層3是包括抗皮質(zhì)醇抗體和牛血清白蛋白的復合層。皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的研制[0024]本試劑盒應(yīng)用競爭抑制酶聯(lián)免疫分析法測定血清或血漿樣本中皮質(zhì)醇的水平。制備過程如下使用96孔聚苯乙烯酶標板作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2小時，使酶標板活化。在酶標板微孔條上預先包被一定濃度的抗體，4°C過夜，經(jīng)洗板及牛血清白蛋白封閉處理后制成包被好的酶標板。檢測時，依次加入待測標本及生物素化的，形成待測標本中的皮質(zhì)醇和生物素化的皮質(zhì)醇競爭結(jié)合酶標板上包被的抗體的局面，再通過親和素化辣根過氧化物酶(HRP)放大信號，以3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及硫酸分別作為底物及終止液，完成皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制備。2、經(jīng)過對試劑盒一系列的質(zhì)量指標檢測，包括靈敏度、重復性、特異性、回收率及線性測定，表明該檢測體系成熟，本試劑盒各項指標檢測結(jié)果a.標準曲線
權(quán)利要求1.皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包括酶標板，所述酶標板包括固相載體和包被層，其特征在于所述固相載體上設(shè)置有多個微孔，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述包被層是由抗皮質(zhì)醇抗體和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相載體的微孔表面上形成的復合層。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征是所述的多個微孔是指96個微孔。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征是所述的固相載體是聚苯乙烯酶標板。
專利摘要本實用新型公開了皮質(zhì)醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，包括酶標板，所述酶標板包括固相載體和包被層，其特征在于所述固相載體上設(shè)置有多個微孔，所述包被層附著在所述固相載體的微孔表面，所述包被層是由抗皮質(zhì)醇抗體和牛血清白蛋白依次涂布在所述固相載體的微孔表面上形成的復合層。本實用新型的試劑盒操作簡便，成本低，穩(wěn)定性好，可以滿足普通實驗室的要求。
文檔編號G01N33/74GK202710571SQ20122005909
公開日2013年1月30日 申請日期2012年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月11日
發(fā)明者楊娟, 李華淵, 童曉玲, 從旭霞, 李慶, 何峰容 申請人:武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司