專利名稱：雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微納操作技術(shù)領(lǐng)域、光電技術(shù)領(lǐng)域和生物化學(xué)傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置及檢測方法。
背景技術(shù)：
光鑷即單光束梯度力光阱，是基于散射力和輻射壓梯度力相互作用而形成的能夠捕獲整個(gè)米氏和瑞利散射范圍粒子的勢阱。對(duì)粒子起捕獲作用的是梯度力，要想將粒子穩(wěn)定地束縛在光場勢阱中，軸向梯度力必須要克服散射力。所以通常需要使用高數(shù)值孔徑的顯微物鏡將激光束高度會(huì)聚，從而產(chǎn)生足夠強(qiáng)的梯度力來實(shí)現(xiàn)粒子的捕獲。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，光鑷技術(shù)往往和光學(xué)顯微鏡技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)單個(gè)微粒的觀察、捕獲和操縱，尚未應(yīng)用于高靈敏定量檢測。
和常規(guī)的單光子激發(fā)熒光不同，雙光子熒光采用近紅外激光來激發(fā)，因此可以避免自發(fā)突光的干擾。但目前雙光子突光技術(shù)的應(yīng)用主要局限于雙光子突光顯微鏡在生物組織成像方面的研究，尚未實(shí)現(xiàn)對(duì)液體樣品中重要的生物分子和尺寸極小的病毒粒子Γιοο 納米)的定量檢測。此外，雙光子熒光顯微鏡需要采用價(jià)格昂貴的飛秒脈沖激光器為激發(fā)光源，也限制了該儀器的推廣使用。
因此，本發(fā)明將光鑷技術(shù)和雙光子熒光技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微球捕獲的金屬離子、生物分子和病毒粒子的定量檢測，擴(kuò)展了光鑷技術(shù)和雙光子激發(fā)熒光技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是將光鑷技術(shù)和雙光子熒光技術(shù)相結(jié)合，提出一種可實(shí)時(shí)定量檢測金屬離子、生物分子和病毒粒子等的雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置及檢測方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置，包括近紅外激光器發(fā)出的近紅外激光束經(jīng)分束器分成兩束，一束經(jīng)雙色分光鏡、二維掃描系統(tǒng)射入物鏡，經(jīng)物鏡聚集在樣品池形成光鑷；來自光鑷的近紅外散射光經(jīng)雙色分光鏡、分束器反射，并由第一聚焦鏡聚集后射入近紅外光檢測器；透過雙色分光鏡的熒光經(jīng)第二聚集鏡聚集后進(jìn)入分光系統(tǒng)分光后，由熒光檢測器檢測。
上述近紅外激光器和分束器之間依次設(shè)有中性密度濾光片、擴(kuò)束器、和用以調(diào)整激光束方向的平面鏡組。
為了實(shí)現(xiàn)更精確的光鑷捕獲，可采用感應(yīng)電機(jī)與物鏡耦合來驅(qū)動(dòng)物鏡沿光軸方向精準(zhǔn)移動(dòng)，所述的感應(yīng)電機(jī)可為步進(jìn)電機(jī)或壓電傳感器。
上述二維掃描系統(tǒng)為二維掃描檢流計(jì)振鏡。
上述第一聚焦鏡的焦平面處設(shè)置一帶有針孔的擋板，所述的針孔位于第一聚焦鏡的焦點(diǎn)處，以排除微球返回近紅外散射光以外的其他光的干擾。
上述近紅外激光器為近紅外調(diào)Q納秒脈沖激光器，也可以使用皮秒脈沖激光器或飛秒脈沖激光器。
上述分光系統(tǒng)為光柵、棱鏡或干涉濾光片分光系統(tǒng)。分光系統(tǒng)可米用多色儀。
上述近紅外光檢測器為點(diǎn)式、線陣或面陣型近紅外光檢測器，如InGaAs檢測器。 若采用光柵或棱鏡分光系統(tǒng)，則光電檢測器為一個(gè)線陣或者面陣近紅外光檢測器；若采用干涉濾光片分光系統(tǒng)，則每通道配置點(diǎn)式近紅外光檢測器，也可配置線陣或面陣近紅外光檢測器。近紅外光檢測器具有將光信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào)輸出的能力。
上述熒光檢測器為線陣CCD(電荷耦合器件)、線陣CMOS (互補(bǔ)性金屬氧化物半導(dǎo)體器件)、以線陣模式工作的面陣CCD或CMOS、或其他衍生的陣列式感光元器件。
上述樣品池為無機(jī)高分子材料的透明容器，其體積為10(Γ500微升。
使用上述雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置的檢測方法，包括步驟步驟一，利用物鏡聚焦近紅外激光器產(chǎn)生的滿足雙光子熒光 激發(fā)條件的近紅外激光束并于樣品池中形成光鑷；步驟二，利用感應(yīng)電機(jī)和二維掃描系統(tǒng)操控光鑷捕獲樣品池內(nèi)微球，同時(shí)近紅外光檢測器檢測來自光鑷的近紅外散射光，所述的微球?yàn)椴捎脽晒馓结槝?biāo)記的富集待測物的微球；步驟三，當(dāng)近紅外光檢測器檢測到的散射光強(qiáng)度達(dá)到預(yù)設(shè)閾值時(shí)，證明光鑷已捕獲到微球，此時(shí)二維掃描系統(tǒng)和感應(yīng)電機(jī)停止動(dòng)作，突光檢測器開始檢測來自微球的突光； 步驟四，根據(jù)熒光檢測器檢測到的熒光強(qiáng)度對(duì)待測物進(jìn)行定量分析。
上述待測物為金屬離子、生物分子或病毒粒子。
上述微球?yàn)橥该鞯臒o機(jī)微球或透明的高分子微球，無機(jī)微球可以是二氧化硅等材料制備的微球，高分子微球可以是聚苯乙烯等材料制備的微球。
上述富集待測物的微球采用如下方法獲取利用微球特異性捕獲待測物，并用熒光探針對(duì)富集于微球表面的待測物進(jìn)行標(biāo)記，形成微球-待測物-熒光探針復(fù)合物，即富集待測物的微球。具體可采用雙抗夾心免疫反應(yīng)法來獲取富集待測物的微球。所述的熒光探針為熒光染料或納米量子點(diǎn)。
可采用不同波長的熒光探針分別標(biāo)記不同的待測物，并將富集不同待測物的微球置于樣品池中，來自不同待測物的不同波段熒光經(jīng)分光儀分光，熒光檢測器即可同時(shí)檢測不同波段的熒光強(qiáng)度，根據(jù)不同波段的熒光強(qiáng)度可定量分析不同待測物，從而實(shí)現(xiàn)不同待測物的多通道定量檢測。
本發(fā)明裝置無需使用顯微鏡，僅用顯微鏡的物鏡聚焦近紅外激光形成光阱以捕獲富集待測物的微球，同時(shí)采用不同熒光探針來標(biāo)記用微球富集的不同待測物，采用分光系統(tǒng)對(duì)不同的熒光信號(hào)進(jìn)行分光，并采用多通道熒光檢測器同時(shí)檢測不同熒光信號(hào)的強(qiáng)度， 實(shí)現(xiàn)多色熒光信號(hào)的多通道檢測。為提高定量檢測的準(zhǔn)確度，本裝置采用激光光鑷掃描方式，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)同類微球的捕獲和信號(hào)檢測。
本發(fā)明檢測方法首先通過雙抗夾心免疫反應(yīng)法，利用微球和熒光探針特異性識(shí)別并捕獲待測物，形成微球一待測物一熒光探針復(fù)合物；然后通過聚焦近紅外激光的三維自動(dòng)掃描系統(tǒng)和采用近紅外光檢測器定量監(jiān)測微球表面散射光以捕獲復(fù)合物微球，同時(shí)利用熒光檢測器對(duì)復(fù)合物微球進(jìn)行雙光子熒光探測以實(shí)現(xiàn)待測物的定量分析。本發(fā)明只探測 位于光阱處的復(fù)合物微球所產(chǎn)生的雙光子熒光，因而溶液中的其他共存物質(zhì)不產(chǎn)生信號(hào)干 擾；并且由于探測體積極小，僅為IfL左右，因此本發(fā)明可用于超高靈敏定量檢測。另外，本 發(fā)明裝置可采用陣列式感光元器件作為熒光檢測器，利用量子點(diǎn)的一元激發(fā)多元發(fā)射的特 點(diǎn)，容易實(shí)現(xiàn)不同量子點(diǎn)標(biāo)記的多種不同待測物的同時(shí)檢測，即可實(shí)現(xiàn)多通道檢測。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)和有益效果1、本發(fā)明將光鑷技術(shù)和雙光子熒光技術(shù)結(jié)合，提出一種新型的多通道定量檢測裝置， 該裝置可對(duì)金屬離子、生物分子和病毒粒子等進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測。
2、本發(fā)明易實(shí)現(xiàn)小型化，具有靈敏度高、選擇性好、速度快、樣品用量少且無需預(yù) 處理，可實(shí)現(xiàn)不同熒光探針標(biāo)記的不同待測物的同時(shí)實(shí)時(shí)檢測，檢測效率高。
3、本發(fā)明裝置可采用成本低廉的近紅外調(diào)Q納秒脈沖激光器作為激光光源，這樣 還可降低成本。


圖1為本發(fā)明裝置光路及結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為工作曲線示意圖；圖3為在微球表面富集待測物的示意圖。
圖中，1-近紅外激光器；2_中性密度濾光片；3_擴(kuò)束器；4，5_平面鏡組；6-分束 器；7_雙色分光鏡；8_ 二維掃描檢流計(jì)振鏡；9、10_透鏡；11-近紅外光檢測器；12_熒光檢 測器；13_多色儀；14_物鏡；15_樣品池；16_微球；17_抗-HA單克隆抗體；18_生物素化 的單克隆抗體；19_禽流感病毒；20_量子點(diǎn)-鏈霉親和素復(fù)合物。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明裝置包括近紅外激光系統(tǒng)、分光系統(tǒng)、光電檢測系統(tǒng)、三維掃描系統(tǒng)四大部 分。近紅外激光系統(tǒng)用來產(chǎn)生滿足雙光子熒光的激發(fā)條件的近紅外激光束，并形成近紅外 光鑷。分光系統(tǒng)用來對(duì)不同待測物的不同熒光信號(hào)進(jìn)行分光，本發(fā)明中的分光系統(tǒng)為光柵、 棱鏡或干涉濾光片分光系統(tǒng)，即光兀件為光柵、棱鏡、或干涉濾光片，并輔以透鏡、反射鏡和 機(jī)械固定結(jié)構(gòu)。光電檢測系統(tǒng)可以將光信號(hào)轉(zhuǎn)化成電信號(hào)，從而可用來檢測來自微球的近 紅外散射光和熒光信號(hào)，本發(fā)明中的光檢測系統(tǒng)包括近紅外光檢測器和熒光檢測器，近紅 外光檢測器為點(diǎn)式、線陣或面陣型近紅外光檢測器，熒光檢測器為線陣CCD(電荷耦合器 件)、線陣CMOS (互補(bǔ)性金屬氧化物半導(dǎo)體器件)、以線陣模式工作的面陣CCD或CMOS、或其 他衍生的陣列式感光元器件，可實(shí)現(xiàn)多通道光檢測。若采用光柵或棱鏡分光系統(tǒng)，則近紅外 光檢測器為一個(gè)線陣或者面陣近紅外光檢測器；若采用干涉濾光片分光系統(tǒng)，則每通道配 置點(diǎn)式近紅外光檢測器，也可配置線陣或面陣近紅外光檢測器。三維掃描系統(tǒng)用來實(shí)現(xiàn)多 微球的逐一,決速捕獲和突光測定，由與物鏡稱合的感應(yīng)電機(jī)和二維掃描系統(tǒng)構(gòu)成。圖1為 本發(fā)明裝置的一種具體實(shí)施，下面將結(jié)合圖1對(duì)本發(fā)明裝置做進(jìn)一步說明。
本發(fā)明的近紅外激光系統(tǒng)發(fā)射近紅外激光并產(chǎn)生光鑷，由近紅外激光器(I)產(chǎn)生 的激光束經(jīng)中性密度濾光片(2)調(diào)節(jié)激光能量使所得激光束能滿足雙光子熒光的激發(fā)條 件，經(jīng)擴(kuò)束器(3)擴(kuò)束并準(zhǔn)直為平行光，擴(kuò)束后的激光束應(yīng)能充滿物鏡(14)的后瞳，經(jīng)擴(kuò)束器(3)的激光束再經(jīng)平面鏡組(4、5)精確調(diào)整方向后射入分束器(6)。
分束器(6)將入射激光束分成能量比為90 10的兩束激光，其中能量為90%的一 束激光經(jīng)雙色分光鏡(7)反射進(jìn)入二維掃描檢流計(jì)振鏡(8)，經(jīng)二維掃描檢流計(jì)振鏡(8)的 嚴(yán)格調(diào)整后進(jìn)入合適數(shù)值孔徑的物鏡(14)，經(jīng)物鏡(14)聚焦在樣品池(15)底部樣品溶液 內(nèi)部形成橫向尺寸約Imm (束腰)的光講，即光鑷；其中能量為10%的另一束激光并未利用。 參見圖1，能量為90%的一束激光束向右傳輸射入雙色分光鏡(7)，能量為10%的一束激光 束向下傳輸(圖中未標(biāo)出)。采用分束器的目的是在導(dǎo)入近紅外激光以形成光阱的同時(shí)還反 射來自微球的近紅外散射光進(jìn)入近紅外光檢測器。
來自光鑷的近紅外散射光經(jīng)透鏡(9)聚焦后進(jìn)入近紅外光檢測器(11)，透鏡(9) 的焦平面處設(shè)置一帶有針孔的擋板，所述的針孔位于透鏡(9)的焦點(diǎn)處，以排除散射光以外 的其他光的干擾。
本發(fā)明中的物鏡采用顯微鏡用的普通物鏡即可，物鏡的數(shù)值孔徑一般不小于O. 5。 本發(fā)明中的樣品池為材質(zhì)為無機(jī)高分子透明材料的微小容器，如96孔培養(yǎng)板中的單個(gè)孔。
雙色分光鏡(7)為短通濾光片，其可透過可見光，可反射短波近紅外光。因此近紅 外激光束將由雙色分光鏡(7)反射至物鏡(14)聚焦形成光鑷；由樣品池(15)中微球表面 返回的近紅外散射光信號(hào)也由雙色分光鏡(7)反射，經(jīng)分束器(6)、透鏡(9)后進(jìn)入近紅外 光檢測器(11)。同時(shí)，來自微球表面的位于可見光區(qū)的熒光信號(hào)則透過雙色分光鏡(7 )，經(jīng) 透鏡(10)聚焦后進(jìn)入多色儀(13)進(jìn)行分光。由于采用近紅外光激發(fā)，因此雙色分光鏡(7) 只需將熒光信號(hào)透過即可，而無須像常規(guī)的單光子激發(fā)那樣需要對(duì)短波長激發(fā)光進(jìn)行分離 以排除干擾。
本裝置采用二維掃描檢流計(jì)振鏡(8)來實(shí)現(xiàn)多微球的逐一快速捕獲和熒光測定， 且捕獲和熒光檢測可以同時(shí)進(jìn)行，但二維掃描檢流計(jì)振鏡(8)僅能實(shí)現(xiàn)水平二維方向的掃 描，為實(shí)現(xiàn)光鑷在光軸方向(Z方向)移動(dòng)，本具體實(shí)施中將物鏡(14)和步進(jìn)電機(jī)耦合，步進(jìn) 電機(jī)驅(qū)動(dòng)物鏡(14)軸向精密移動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)光鑷的軸向精密移動(dòng)。也可采用壓電傳感器代 替步進(jìn)電機(jī)。因此，本發(fā)明通過二維掃描檢流計(jì)振鏡(8)和步進(jìn)電機(jī)實(shí)現(xiàn)三維掃描，從而可 更精確的進(jìn)行光懾捕獲。
本發(fā)明的掃描系統(tǒng)和雙光子熒光顯微鏡的掃描系統(tǒng)有很大區(qū)別，后者為實(shí)現(xiàn)高分 辨成像，在三個(gè)方向都需要快速精密移動(dòng)，并進(jìn)行高速率信號(hào)采集。由于本裝置僅僅采集數(shù) 量有限(一般50 100個(gè))的微球的熒光信號(hào)，因此通過二維自動(dòng)掃描系統(tǒng)即可實(shí)現(xiàn)微球的 快速捕獲和熒光測定，且捕獲和檢測同步進(jìn)行。
當(dāng)樣品池內(nèi)溶液中存在一定濃度的微球一待測物一熒光探針復(fù)合物微球，且光阱 力足夠大時(shí)，一旦移動(dòng)的光講和某一微球相互靠近，則微球被光講捕獲；可通過近紅外光檢 測器(11)檢測到的近紅外散射光強(qiáng)度來判斷是否捕獲微球，當(dāng)檢測到的近紅外散射光強(qiáng)度 達(dá)到預(yù)先預(yù)先設(shè)定閾值時(shí)，證明微球被光鑷捕獲，此時(shí)，為保證穩(wěn)定可靠的熒光測定，掃描 系統(tǒng)停止掃描，突光檢測器(12)檢測來自微球的突光強(qiáng)度。當(dāng)完成一個(gè)微球的測定后，掃 描系統(tǒng)繼續(xù)掃描，光鑷?yán)^續(xù)捕獲并探測下一個(gè)微球，直至完成一定數(shù)量微球的熒光檢測。
可采用不同波長的熒光探針分別標(biāo)記不同的待測物，并將富集不同待測物的微球 置于樣品池中，來自不同待測物的不同波段熒光經(jīng)分光儀分光，熒光檢測器即可同時(shí)檢測 不同波段的熒光強(qiáng)度，根據(jù)不同波段的熒光強(qiáng)度可定量分析不同待測物，從而實(shí)現(xiàn)不同待測物的多通道定量檢測。
本發(fā)明可通過測定來自微球的熒光強(qiáng)度對(duì)微球表面富集的待測物進(jìn)行定量分析， 具體可采用工作曲線法，工作曲線法是熒光定量檢測領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)方法，過程及原理如 下首先，制備某待測物的免疫微球。然后，按照設(shè)定的濃度梯度配制至少6份待測物標(biāo) 準(zhǔn)溶液(包括空白溶液)，分別采用相同的微球免疫夾心法(所用熒光探針也相同)對(duì)該系列 待測物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，對(duì)每份標(biāo)樣均測定至少50個(gè)微球的雙光子熒光強(qiáng)度，取其平均 值，繪制工作曲線，即待測物濃度和熒光強(qiáng)度曲線，該曲線在一定范圍內(nèi)為直線。最后，按照 相同方法測定未知樣所含相同待測物的熒光強(qiáng)度，根據(jù)以上工作曲線計(jì)算待測物含量。
圖2為工作曲線法定量的示意圖,共配制7份待測物標(biāo)準(zhǔn)溶液(含空白溶液),每個(gè) 標(biāo)準(zhǔn)樣品均至少平行測定50個(gè)微球熒光，取平均值，同時(shí)計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差并將其在圖中每 點(diǎn)上標(biāo)識(shí)出來。該曲線的橫坐標(biāo)為待測物標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度，若未知樣品中 待測物返回的熒光強(qiáng)度在圖1的熒光強(qiáng)度范圍內(nèi)，則可根據(jù)測定的熒光強(qiáng)度獲得其濃度， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測物的定量分析。
下面將實(shí)施例1 2對(duì)本發(fā)明檢測方法做進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1同一試樣中5種甲型流感病毒的多通道定量分析以聚苯乙烯微球作為載體，采用雙抗免疫夾心法對(duì)不同甲型流感病毒分別進(jìn)行富集， 具體是以單克隆抗體修飾微球表面，以熒光量子點(diǎn)標(biāo)記單克隆抗體，具體參見圖3。
首先，制備免疫微球。取表面羧基修飾的聚苯乙烯微球(16)，采用化學(xué)偶聯(lián)法在其 表面偶聯(lián)H9N2病毒的抗-HA單克隆抗體(17)得到免疫微球，備用。
I)對(duì)H9N2禽流感病毒進(jìn)行定量檢測在免疫微球上富集H9N2禽流感病毒:在含H9N2禽流感病毒(19)的樣品溶液中加入一定濃 度(IO4-1O6個(gè)/mL)的免疫微球中，并加入生物素化的單克隆抗體(18)和量子點(diǎn)-鏈霉親和素復(fù) 合物(20)于37 ° C下孵育Ih得到富集待測物的微球，所采用的量子點(diǎn)的熒光波長為625nm。
采用本裝置測定50-100個(gè)微球的雙光子熒光信號(hào)強(qiáng)度，并用平均值定量；依據(jù)所 測定的雙光子熒光信號(hào)強(qiáng)度，采用工作曲線法獲取待測物的濃度，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測。
2 )同時(shí)對(duì)HlNl、H3N2、H5N1、H7N1和H9N2禽流感病毒進(jìn)行定量檢測使用波長分別為545nm、565nm、585nm、605nm和625nm的CdSe/ZnS核殼型量子點(diǎn)來分 別標(biāo)記最有代表性的五種甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H7N1和H9N2，采用上述方法實(shí)現(xiàn) 五種病毒的多通道定量檢測。
實(shí)施例2同一血清樣品中5種胃癌標(biāo)志物的聯(lián)合檢測采用和實(shí)施例1相同的方法制備富集胃癌標(biāo)志物的聚苯乙烯微球，并分別使用波長為 545nm、565nm、585nm、605nm和625nm的CdSe/ZnS核殼型量子點(diǎn)，分別標(biāo)記同一血清樣品 中5種胃癌標(biāo)志物癌胚抗原(CEA)、胃癌抗原MG7_Ag、細(xì)胞角蛋白(CK)、血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF)和凝血酶(Thrombin)，采用實(shí)施例1實(shí)現(xiàn)五種病毒的多通道定量檢測。
微球?qū)Ω魑赴?biāo)志物蛋白的富集，不局限于雙抗體免疫夾心方法，還可以采用核 酸適配體等多種特異性好、捕獲效率高的其他方案。
權(quán)利要求
1.一種雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置，其特征在于，包括 近紅外激光器發(fā)出的近紅外激光束經(jīng)分束器分成兩束，一束經(jīng)雙色分光鏡、二維掃描系統(tǒng)射入物鏡，經(jīng)物鏡聚集在樣品池形成光鑷；來自光鑷的近紅外散射光經(jīng)雙色分光鏡、分束器反射，并由第一聚焦鏡聚集后射入近紅外光檢測器；透過雙色分光鏡的熒光經(jīng)第二聚集鏡聚集后進(jìn)入分光系統(tǒng)分光后，由熒光檢測器檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置，其特征在于 所述的近紅外激光器和分束器之間依次設(shè)有中性密度濾光片、擴(kuò)束器、和用以調(diào)整激光束方向的平面鏡組。
3.如權(quán)利要求1所述的雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置，其特征在于 所述的物鏡與感應(yīng)電機(jī)耦合，以驅(qū)動(dòng)物鏡沿光軸方向精準(zhǔn)移動(dòng)。
4.如權(quán)利要求1所述的雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置，其特征在于 所述的第一聚焦鏡的焦平面處設(shè)置有一帶有針孔的擋板，所述的針孔位于第一遨竟的焦點(diǎn)處。
5.如權(quán)利要求1所述的雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置，其特征在于 所述的近紅外激光器為近紅外調(diào)Q納秒脈沖激光器、皮秒脈沖激光器或飛秒脈沖激光器。
6.如權(quán)利要求1所述的雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置，其特征在于 所述的近紅外光檢測器為點(diǎn)式、線陣或面陣型近紅外光檢測器。
7.如權(quán)利要求1所述的雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置，其特征在于 所述的熒光檢測器為線陣CCD、線陣CMOS、以線陣模式工作的面陣CCD或CMOS、或其他衍生的陣列式感光元器件。
8.使用上述權(quán)利要求f7中任一項(xiàng)所述的基于雙光子熒光光鑷的多通道定量檢測裝置的檢測方法，其特征在于，包括步驟 步驟一，利用物鏡聚焦近紅外激光器產(chǎn)生的滿足雙光子熒光激發(fā)條件的近紅外激光束并于樣品池中形成光鑷； 步驟二，利用感應(yīng)電機(jī)和二維掃描系統(tǒng)操控光鑷捕獲樣品池內(nèi)微球，同時(shí)近紅外光檢測器檢測來自光鑷的近紅外散射光，所述的微球?yàn)椴捎脽晒馓结槝?biāo)記的富集待測物的微球；步驟三，當(dāng)近紅外光檢測器檢測到的散射光強(qiáng)度達(dá)到預(yù)設(shè)閾值時(shí)，證明光鑷已捕獲到微球，此時(shí)二維掃描系統(tǒng)和感應(yīng)電機(jī)停止動(dòng)作，突光檢測器開始檢測來自微球的突光；步驟四，根據(jù)熒光檢測器檢測到的熒光強(qiáng)度對(duì)待測物進(jìn)行定量分析。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于 所述的待測物為金屬離子、生物分子或病毒粒子。
10.如權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于 所述的微球?yàn)橥该鞯臒o機(jī)微球或透明的高分子微球。
11.如權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于 所述的微球采用如下方法獲取 利用微球特異性捕獲待測物，并用熒光探針對(duì)富集于微球表面的待測物進(jìn)行標(biāo)記，形成微球-待測物-熒光探針復(fù)合物。
12.如權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于 所述的樣品池中的微球?yàn)楦患硕喾N待測物的微球，且不同種待測物分別采用不同波長的熒光探針進(jìn)行標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雙光子熒光光鑷多通道定量檢測裝置及檢測方法，該檢測裝置包括近紅外激光器發(fā)出的近紅外激光束經(jīng)擴(kuò)束器、分束器、雙色分光鏡、二維掃描系統(tǒng)射入物鏡，經(jīng)物鏡聚集在樣品池內(nèi)形成光鑷；來自光鑷的近紅外散射光經(jīng)雙色分光鏡、分束器反射，并由第一聚焦鏡聚集后射入近紅外光檢測器；透過雙色分光鏡的熒光經(jīng)第二聚集鏡聚集并經(jīng)分光系統(tǒng)分光后，由熒光檢測器檢測。本裝置可對(duì)金屬離子、生物分子和病毒粒子等進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測，可實(shí)現(xiàn)不同量子點(diǎn)標(biāo)記的多種不同待測物的同時(shí)檢測。本裝置易實(shí)現(xiàn)小型化，樣品檢測方法具有靈敏度高、選擇性好、速度快、樣品用量少且無需預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102998293SQ20121055723
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者唐宏武, 龐代文 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)