專利名稱：一種從玉米細菌性枯萎病菌中分離的內(nèi)切葡聚糖酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋微生物基因克隆技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種內(nèi)切葡聚糖酶，即一種從玉米細菌性枯萎病菌中分離的內(nèi)切葡聚糖酶基因。
背景技術(shù)：
玉米細菌性枯萎病(Pantoea stewartii subsp. stewartii)最早發(fā)生于美國，后來擴散到歐洲、大洋洲等地。目前已知發(fā)生地區(qū)有北美、中美、秘魯、前蘇聯(lián)等。病菌通過病種子進行遠距離傳播，病區(qū)通過玉米葉甲和雜草寄主傳播并越冬。玉米細菌性枯萎病是維管束型病害，受害后植株矮縮或枯萎，對玉米特別是甜玉米能造成極大危害。研究發(fā)現(xiàn)宿主內(nèi)切葡聚糖酶在玉米細菌性枯萎病菌的毒力及吸附上起著重要的作用。由玉米細菌性枯萎病菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因編碼的胞壁降解酶首先通過消化宿主木質(zhì)的基膜來幫助其吸附 到宿主中，然后通過消化宿主中木質(zhì)部分的豐富碳源等營養(yǎng)物質(zhì)來提高自身的運動能力，因此內(nèi)切葡聚糖酶對于玉米細菌性枯萎病菌的毒力是十分重要的。有必要獲得玉米細菌性枯萎病菌的內(nèi)切葡聚糖酶的不同的等位基因，從而對其序列和功能進行更詳細的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種內(nèi)切葡聚糖酶，即從玉米細菌性枯萎病菌中分離的內(nèi)切葡聚糖酶基因，從而彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明篩選的內(nèi)切葡聚糖酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶，是從玉米細菌性枯萎病菌中分離的。用于編碼上述內(nèi)切葡聚糖酶的基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明篩選的內(nèi)切葡聚糖酶用于制備單克隆抗體。本發(fā)明克隆得到了玉米細菌性枯萎病菌內(nèi)切葡聚糖酶基因及其編碼的氨基酸序列，對明確該病的病理生理學(xué)特征及致病機理提供了重要理論依據(jù)，將該基因序列克隆到大腸埃希菌中表達，表達的蛋白則可以快速地用于制備特異性單克隆抗體，可作為口岸檢疫過程中快速檢測玉米細菌性枯萎病菌的一種高效手段。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明篩選的內(nèi)切葡聚糖酶進行詳細描述。一、玉米細菌性枯萎病菌內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆1、玉米細菌性枯萎病菌內(nèi)切葡聚糖酶基因基因組DNA的提取方法參照Adams等的方法(Adams et al. , 1998)。所述玉米細菌性枯萎病菌作為內(nèi)切葡聚糖酶基因的供體。菌株玉米細菌性枯萎病菌購自于美國典型菌種保藏中心(ATCC)，保藏號為81992、簡并引物的設(shè)計根據(jù)不同種屬內(nèi)切葡聚糖酶基因的保守序列以及玉米細菌性枯萎病菌偏好性設(shè)計簡并引物Fl，Rl Fl 5， - GGNTGGTAYGAYGCNGG-3’Rl 5’ - AANGTNGGRTCDATRTT-3’上述簡并引物F1，R1是在克隆玉米細菌性枯萎病菌的基因序列時采用的。結(jié)合細菌密碼子的使用頻率，去除使用頻率較低的密碼子，最終確定引物Fl，Rl03、內(nèi)切葡聚糖酶基因片段的PCR擴增
反應(yīng)體系(50μ L)
IOx緩沖液5.0 μ—L
dNTPs (2.5 mM)4.0 |iL
F1 (SOmM)1,0 μ[
Rl (50mM)1.0 nL
丁aq DNA 聚合痛—1.0 μ 基因組DNA2.0 iih
H2O36.0 \ih反應(yīng)條件預(yù)變性94 °C，5min ;變性溫度94 °C, Imin ;退火溫度49°C, Imin ;延伸溫度72 ° C，I min ;30個循環(huán)后，72 0C延伸IOmin0其中所述基因組DNA為內(nèi)切葡聚糖酶基因組DNA。將設(shè)計好的簡并引物按上述的方法進行PCR擴增，獲得了大小為381bp的一條目的片段。4、PCR產(chǎn)物的回收將上述的PCR產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠上樣孔中，電壓50V，電泳20min，在紫外燈下切下目標(biāo)帶，用凝膠回收試劑盒(購自TaKaRa, Japan)回收。5、PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體連接將回收PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接。連接體系(ΙΟμυ:
冋收PCR hi的產(chǎn)物I 3μ[
溶液〖(.含連接酶)5 |iL
PMD19-T載體(購于丁aKaRa公爾，大連)I |iL H2O補至 I OpL
160C迮接丨 2h =6、陽性克隆的篩選根據(jù)α互補現(xiàn)象，用X-gal對克隆進行初步篩選。藍色菌落為陰性菌落，白色菌落為陽性菌落。用無菌牙簽挑取白斑克隆轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基溶液中，提取質(zhì)粒并測序；
所述LB液體培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10. 0，酵母粉5. 0，氯化鈉10. 0，pH7. 2到7. 5，121°C，20min 滅菌。將擴增得到的片段切膠回收，回收片段與克隆載體PMD19-T連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(DH5ci )感受態(tài)細胞中，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進行測序，最終確認得到了 381bp的核苷酸序列(SEQ ID NO: 3)。根據(jù)所獲得堿基序列利用分子生物學(xué)軟件(primer 5. O)直接推測得到該基因片段所編碼的氨基酸序列(SEQ ID N0:4)。7、cDNA末端快速擴增(RACE)方法擴增脂肪酶基因全長I)根據(jù)上述6測序結(jié)果設(shè)計合成寡聚核苷酸引物GSPl和GSP2。
Gsp2 5， - AGGTAGGATCAATATTTTTAAACAT -3，Gspl 5’ - GGTATGATGCAGGTGATAAAGGAAA -3’2)根據(jù)已知上述6測序結(jié)果在合成的引物GSPl和引物GSP2內(nèi)側(cè)分別設(shè)計巢試引物NGSPl和引物NGSP2。Ngsp2 5， - TGCTAATATAGCTGCGGCACATGCA -3，Ngspl 5， - ATAAATAACGGTGCCTTAGCTGTAT -3，3) 5，-CDS引物與3’-CDS引物為試劑盒自帶。反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA
5,-RACE- cDNAS'-RACE- cDNA
3.0pL RNA 樣品3 μ RNA Wm
-1.0pL5’-CDS 引物lpL3MDS 引物
1.0pL寡聚TΙμ—L雙蒸水輕微離心并混合均勻，70 ° C孵育2min，置冰上冷卻2 min,混合均勻。上述首先按照RACE方法引物設(shè)計要求，根據(jù)已經(jīng)擴增出的內(nèi)切葡聚糖酶基因片段，分別設(shè)計上下游引物Gsp I，Gsp2。以玉米細菌性枯萎病菌RNA為模板，合成cDNA第一鏈，然后反轉(zhuǎn)錄合成第二鏈，接下來分別以Gspl，Gsp2作為引物進行首輪PCR。再選取靠近GSP引物并且位于其內(nèi)側(cè)的的堿基序列作為模板設(shè)計巢試引物NGSP。將首輪擴增的5’-RACE與3’-RACE產(chǎn)物稀釋50倍，分別作為第二輪巢試引物擴增的模板進行PCR擴增。使用巢試引物進行PCR擴增后，分別得到了大小為1468bp (5’RACE產(chǎn)物)與 840bp (3’RACE產(chǎn)物)左右的兩組產(chǎn)物，將得到的核酸序列進行DNA序列測定并進行序列拼接。拼接后最終得到一條大小為1977bp的內(nèi)切葡聚糖酶LYega的核苷酸序列(SEQ ID N0:2),編碼658個氨基酸(SEQ ID NO:1),即為玉米細菌性枯萎病菌內(nèi)切葡聚糖酶基因序列。通過在獲得的SEQ ID NO: 2的兩端設(shè)計引物進行全長擴增，結(jié)果表明沒有發(fā)生拼接的錯誤。二、玉米細菌性枯萎病菌內(nèi)切葡聚糖酶基因在大腸中的表達①pET-LYega 表達載體的構(gòu)建根據(jù)已述已克隆的內(nèi)切葡聚糖酶序列，添加酶切位點，設(shè)計表達引物如下F3 5， -GACGAATTC ATGAAAAACAA -3，
F4 5’ -AACGCGGCCGC GAAGCTATTA3’下劃線標(biāo)注的為EcoRI與NotI酶切位點②內(nèi)切葡聚糖酶基因的PCR擴增反應(yīng)體系(50μ L)
10>ExTaq 緩沖液5.0 μ+L
dNTPs (2,5 mM)4.0 pL
F3 (50 mM)1.0 pL
F4 (SOmM)1. )μ .
ExTaq DNA 聚合酶 0.5 μ*_DNAIJpL
H2O37.5 |iL反應(yīng)條件預(yù)變性94 °C，5min ;變性溫度94 ° C，Imin ;退火溫度54° C，Imin ;延伸溫度72 ° C，I min ;30個循環(huán)后，72 0C延伸IOmin0以內(nèi)切葡聚糖酶為模板，F(xiàn)3和F4為引物，PCR產(chǎn)物為一條2000bp左右的片段。③內(nèi)切葡聚糖酶基因的連接、轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取
PCR產(chǎn)物與T載體連接將回收PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接。連接體系(ΙΟμυ:
剛^PCRH的產(chǎn)物1-3 μ
溶液I (含連接酶)5 pL
PMD19-T載體I pL
H2O補至 10 μ
16 0C迮接I 2h。④陽性克隆的篩選根據(jù)α互補現(xiàn)象，用X-gal對克隆進行初步篩選。藍色菌落為陰性菌落，白色菌落為陽性菌落。用無菌牙簽挑取白斑克隆轉(zhuǎn)接于LB液體溶液中，提取質(zhì)粒并測序。將PCR產(chǎn)物回收，連接pMD19-T simple,命名為pMD19_T- LYega，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒pMD19-T_LYega。同時用限制件內(nèi)切酶EcoRI與NotI酶切質(zhì)粒dMD19_T_ LYega和載體pET_2Ia (+)酶切體系(40μυ pMD 19-T- LipY simple/pET-21 a(+)20 μ
I OxM buffer4 |iL
Ik'aR I2 μ
Not!2 ill
雙蒸水12 pL37° C酶切4 5 h ,加入4μ 10 X loading buffer終止反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳，并回收酶切片斷將回收的目的片斷及質(zhì)粒進行連接。連接反應(yīng)體系(10 μι):
pET-21a(+)2 pL
LYega柏R片斷2pL
T4 DNA HgaseI pL
10xT4 DNA ligase bufferI μ
雙蒸水4 pL16°C過夜，將構(gòu)建好的表達載體命名為pET_21a(+) -LipY0⑤大腸桿菌(BL-21)的內(nèi)切葡聚糖酶基因的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化步驟如下1、制備好的感受態(tài)細胞懸液中每管加入待轉(zhuǎn)化的DNA (包括陰性和陽性對照樣品，體積不超過ΙΟμ ，DNA含量小于50ng)，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰上放置30min。2、將管放入預(yù)加溫至42°C的水浴中，放置90秒，不要搖動離心管。3、快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻l_2min。4、每管加800μ LB培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫至37° C，然后將管轉(zhuǎn)移到搖床上，振蕩培養(yǎng)45min，使細菌復(fù)蘇并表達質(zhì)粒編碼的Amp抗性標(biāo)記基因。5、在配制好的LA平板上，加入40μ 20mg/mL X_gal溶液和7μ 20% IPTG溶液，涂布均勻，37° C培養(yǎng)箱中放置Ih，將有機溶劑揮發(fā)干凈。6、將培養(yǎng)后的大腸桿菌離心，去除培養(yǎng)液800μ ，將細胞重新懸起，取180μ 細胞懸浮液涂于有X-gal和IPTG的LB/Amp平板上，取剩余的20μ 細胞懸浮液加入180μ 無菌水混勻，涂于有X-gal和IPTG的LB/Amp平板上。7、將平板朝上置于37° C培養(yǎng)箱中，液體被吸收后，倒置平板，繼續(xù)培養(yǎng)，12-16h后可觀察到菌落。取測序鑒定的陽性重組菌BL21(DE3)/pET_21a(+)-LYega菌液100 μ L， 接種于5. OmL含氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基，37° C培養(yǎng)過夜，次日取50. O μ L，接種50. OmL含氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3-4 h (OD600nm約O. 4^0. 6)后，加IPTG誘導(dǎo)，終濃度為O. 5mM,16°C過夜培養(yǎng)，6000g離心5min，收集菌體。以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pET_21a(+)的重組菌BL21(DH5 a)/pET-2 Ia (+)作為對照。
⑥重組內(nèi)切葡聚糖酶的純化菌體用O.1M磷酸緩沖液(pH 7.6)洗兩次，然后用15mL O.1M磷酸緩沖液(pH7. O)重懸，利用超聲波破碎細胞，12000g離心lOmin，收集上清即為重組內(nèi)切葡聚糖酶粗酶液。將發(fā)酵粗酶液濃縮離心后，取O. 5 ml濃縮酶液以lmin/ml的流速通過預(yù)先平衡好的Ni離子親和柱(平衡液50 mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，500 mM氯化鈉，20 mM咪唑)，隨即用洗脫液進行洗脫(洗脫液50 mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，500 mM氯化鈉，300 mM咪唑)。內(nèi)切葡聚糖酶洗脫過程采用快速蛋白液相色譜(FPLC)在線檢測。將經(jīng)Ni離子柱純化后的內(nèi)切葡聚糖酶樣品進行不連續(xù)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠電泳，重組內(nèi)切葡聚糖酶濃縮液經(jīng)Ni離子親和柱親和層析純化后，純度已經(jīng)很高，為單一的內(nèi)切葡聚糖酶。經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測為一條電泳帶根據(jù)已知分子量的標(biāo)準蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖譜，重組內(nèi)切葡聚糖酶分子量約為73kD，該酶應(yīng)為單體蛋白。三、玉米細菌性枯萎病菌內(nèi)切葡聚糖酶單克隆抗體的制備 ①取50 μ L純化的內(nèi)切葡聚糖酶(約I mg/mL)與等體積的弗氏完全佐劑混合,用注射器充分乳化，腹腔及皮下多點注射6 8周齡BALB/c小鼠，每只大約50yg，第14天、28天分別用弗氏不完全佐劑充分乳化的抗原進行第二次、第三次免疫，劑量同第一次。將免疫好的小鼠拉頸脫白處死后放入75 %酒精中浸泡5分鐘，無菌手術(shù)取脾臟，放入裝有20 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)不完全培養(yǎng)液的平皿中沖洗，去除紅細胞和脂肪組織，再移到另一個帶有200目銅網(wǎng)的平皿中，用20 mL注射器吸取培養(yǎng)液反復(fù)吹打脾臟，使細胞釋放出來，收集細胞懸液，1500 r/min離心10 min，沉淀即為制備好的脾細胞。②將SP2/0細胞及脾細胞用DMEM不完全培養(yǎng)液做適當(dāng)稀釋后計數(shù)，兩種細胞按5:1 10:1的比例混合于離心管中。700 r/min離心10 min，棄上清，吸干管壁殘留液，手指輕彈離心管底部使得兩種細胞混合均勻，I min內(nèi)勻速加入I mL 37°C預(yù)熱的融合劑50 %聚乙二醇(PEG) -1500，邊加邊旋轉(zhuǎn)離心管，使得細胞與融合劑充分接觸，37°C水條件下作用I min，再于每分鐘內(nèi)分別加入I mL、2 mL、3 mL、5 mL 37°C預(yù)熱的DMEM不完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，然后再逐漸加快滴加終止液的速度。700 r/min離心10 min，棄上清，加入2XHAT培養(yǎng)液重懸細胞。在準備有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板上每孔加入IOOyL融合細胞懸液，最后將細胞培養(yǎng)板放置37°C，5 %C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。③取10 12周齡BALB/c小鼠，腹腔注射O. 5 mL滅菌石蠟油，一周后腹腔注射雜交瘤細胞5X IO5 5X IO6個。7 d 14 d后鼠腹圍明顯增大，每隔兩天用注射器收集腹水一次。將腹水于37 °C靜置2小時 4小時，再置于4°C過夜。次日將腹水3000 r/min離心10 min，由上至下呈現(xiàn)脂肪、腹水和細胞沉淀三層，用玻璃纖維吸附去除上層脂質(zhì)，吸取中間層，12000 r/min離心10 min，進一步除去細胞及其殘渣、小顆粒物質(zhì)、以及脂肪滴等沉淀，上清即為玉米細菌性枯萎病菌內(nèi)切葡聚糖酶單抗制品。四、玉米細菌性枯萎病菌內(nèi)切葡聚糖酶的效果檢測及應(yīng)用本發(fā)明篩選的內(nèi)切葡聚糖酶屬于糖苷水解酶家族8，是一種O型糖基水解酶，實驗表明能夠水解兩個碳水化合物之間、或一個碳水化合物與另外一個非碳水化合物之間的糖苷鍵成分。證明本發(fā)明篩選的酶具有糖苷水解酶的特性。用本發(fā)明的內(nèi)切葡聚糖酶侵染玉米組織，可有效的引起細胞壁表面單個葡聚糖鏈的溶解，快速導(dǎo)致細胞壁的破壞，繼而引起原生質(zhì)解體，它是導(dǎo)致玉米死亡的重要致病物質(zhì)之一。本發(fā)明篩選的內(nèi)切葡聚糖酶重組表達純化后，免疫小鼠來制備單克隆抗體。將制備的單克隆抗體來檢測玉米細菌性枯萎病菌的陽性樣品。結(jié)果表明，制備的單克隆抗體可以有效的檢測出感染了玉米細菌性枯萎病菌的陽性樣品，而對于作為對照的陰性樣品則沒有信號出現(xiàn)，從而證明具有特異性。而后續(xù)的細菌分離鑒定也證明了檢測結(jié)果。本發(fā)明克隆得到了玉米細菌性枯萎病菌內(nèi)切葡聚糖酶基因及其編碼的氨基酸序列，對明確該病的病理生理學(xué)特征及致病機理提供了重要理論依據(jù)，將該基因序列克隆到大腸埃希菌中表達，表達的蛋白則可以快速地用于制備特異性單克隆抗體，作為口岸檢疫過程中快速檢測玉米細菌性枯萎病菌的一種高效手段，同時重組表達的玉米細菌性枯萎病菌內(nèi)切葡聚糖酶的重組蛋白可以用于研究玉米細菌性枯萎病菌的致病機理，為玉米細菌性枯萎病菌的理學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)?！?br> 權(quán)利要求
1.一種內(nèi)切葡聚糖酶，所述的內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
2.權(quán)利要求1所述的內(nèi)切葡聚糖酶，其特征在于，所述的內(nèi)切葡聚糖酶是從玉米細菌性枯萎病菌中分離的。
3.用于編碼權(quán)利要求1所述的內(nèi)切葡聚糖酶的基因，其核苷酸序列為SEQID N0:2。
4.權(quán)利要求1所述的內(nèi)切葡聚糖酶在制備單克隆抗體中的應(yīng)用。
5.一種單克隆抗體，所述的單克隆抗體是以權(quán)利要求1所述的內(nèi)切葡聚糖酶為抗原制備的。
6.權(quán)利要求5所述的單克隆抗體用于檢測玉米細菌性枯萎病菌。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種內(nèi)切葡聚糖酶，即從玉米細菌性枯萎病菌中分離的內(nèi)切葡聚糖酶基因，其氨基酸序列為SEQ ID NO1。本發(fā)明篩選的內(nèi)切葡聚糖酶用于制備單克隆抗體。本發(fā)明克隆得到了玉米細菌性枯萎病菌細胞壁降解酶基因及其編碼的氨基酸序列，對明確該病的病理生理學(xué)特征及致病機理提供了重要理論依據(jù)，將該基因序列克隆到大腸埃希菌中表達，表達的蛋白則可以快速地用于制備特異性單克隆抗體，可作為口岸檢疫過程中快速檢測玉米細菌性枯萎病菌的一種高效手段。
文檔編號G01N33/577GK102994482SQ20121052585
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月7日
發(fā)明者厲艷 申請人:山東出入境檢驗檢疫局