專利名稱：一種卷煙煙氣凝集物毒理學(xué)生物測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于卷煙煙氣凝集物毒性細(xì)胞效應(yīng)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種卷煙煙氣凝集物毒理學(xué)生物測定方法。
背景技術(shù)：
目前卷煙煙氣凝集物(cigarette smoke condensate CSC)的毒理學(xué)評價(jià)指標(biāo)包括，卷煙煙氣的細(xì)胞毒性(中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn))，細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)(AMES試驗(yàn))，誘發(fā)小鼠微核形成率(微核試驗(yàn))等三種檢測方法，主要目的是檢測其對細(xì)菌，哺乳動物細(xì)胞的致突變作用，中性紅細(xì)胞毒試驗(yàn)檢測的是卷煙煙氣凝集物殺傷細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性，細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)和微核形成試驗(yàn)反映的是煙氣凝集物的基因毒作用，進(jìn)而與腫瘤發(fā)生相關(guān)聯(lián)。過去對于腫瘤的發(fā)生主要?dú)w結(jié)于基因毒，即其致突變性。目前認(rèn)為腫瘤發(fā)生過程中除了基因損傷的積累外，細(xì)胞活躍的增殖是其癌變的前提。如果在煙氣凝集物的作用下細(xì)胞被完全破壞，細(xì)胞的癌變即無從說起。因此，中性紅試驗(yàn)的確可以反映煙氣凝集物的細(xì)胞毒性，但從致癌這一目前所認(rèn)為的吸煙最主要的危害來說，中性紅細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)合細(xì)菌回復(fù)突變和微核形成兩種基因毒檢測還不能充分的反映其煙氣凝集物的生物學(xué)毒性。直接殺傷細(xì)胞所需的煙氣凝集物劑量明顯高于刺激細(xì)胞增殖所需的劑量，因此，細(xì)胞的增殖試驗(yàn)對細(xì)胞毒試驗(yàn)將是一個(gè)有用的補(bǔ)充。即檢測煙氣凝集物對靶細(xì)胞增殖的刺激作用。這種細(xì)胞增殖刺激作用比直接的細(xì)胞毒作用更靈敏。事實(shí)上，通常吸煙者每次所暴露于煙氣凝集物的量是很微弱的，這一檢測結(jié)果更切合實(shí)際。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種卷煙煙氣凝集物毒理學(xué)生物測定方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)不能充分的反映其煙氣凝集物的生物學(xué)毒性的問題。為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是
一種卷煙煙氣凝集物毒理學(xué)生物測定方法，其特征在于，包括以下步驟
1，煙氣粒相物的獲得確定所要選用及需處理的樣品，在恒溫恒濕，即20°c和60%相對濕度條件下平衡48h，通過德國Borgwaldt公司生產(chǎn)的RM- 20型轉(zhuǎn)盤式20孔道吸煙機(jī)，在維持20°C和60%相對濕度條件下,在標(biāo)準(zhǔn)抽吸條件下，即1 puff/ min , 2 s/ puff ,35 mL/ puff抽吸,煙氣通過85 mm直徑的劍橋?yàn)V片收集
2，煙氣粒相物的提取將獲得的濾紙片取下密封保存，處理時(shí)，用剪刀剪碎，放入50mL離心管中，加入二甲基亞砜以使其完全浸沒濾紙碎片。30°C下振蕩4hrs后，30°C，5000rpm條件下離心，取上清液體，收集入離心管中4°C密封保存?zhèn)溆谩?，細(xì)胞增殖/細(xì)胞毒試驗(yàn)
細(xì)胞株CCL-64貂肺上皮細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基中，經(jīng)時(shí)添加培養(yǎng)基并傳代，維持細(xì)胞在對數(shù)生長期，待用；
取培養(yǎng)至對數(shù)期的細(xì)胞株，調(diào)細(xì)胞濃度至1x105 /ml,接種于96孔板，104/孔細(xì)胞，添加待試的TPM 20%起始，對倍稀釋，370C培養(yǎng)48小時(shí)，加MTT，即儲存液2mg/ml，20 μ I/孔，繼續(xù)孵育4小時(shí)，棄上清，加DMSO 150ul/孔，570nm/630nm讀取光密度，分析結(jié)果，一般結(jié)果顯示，高濃度煙氣凝集物表現(xiàn)為直接的細(xì)胞毒效應(yīng)，即OD值低于陰性對照，當(dāng)待測樣品濃度降低時(shí)則表現(xiàn)為刺激細(xì)胞增殖，OD值高于陰性對照，以明顯刺激細(xì)胞增殖的最高稀釋度為觀察終點(diǎn)。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果
本發(fā)明在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)下，以哺乳動物氣管上皮細(xì)胞或肺上皮細(xì)胞為靶細(xì)胞，以煙氣凝集物為待測樣品，兩者共育一定時(shí)間，以MTT法檢測受試靶細(xì)胞增殖狀態(tài)，反映待測樣品是否刺激靶細(xì)胞增殖，以細(xì)胞增殖的多少反映待測樣品的生物學(xué)活性，即“毒性”，本發(fā)明對細(xì)胞毒試驗(yàn)是一個(gè)有用的補(bǔ)充，即檢測煙氣凝 集物對靶細(xì)胞增殖的刺激作用。這種細(xì)胞增殖刺激作用比直接的細(xì)胞毒作用更靈敏。


圖1為煙氣凝聚物對CCL-64細(xì)胞增殖的刺激效應(yīng)檢測結(jié)果 圖2為圖1檢測結(jié)果的條形具體實(shí)施例方式申請人:給出以下實(shí)施例，但不局限于這些實(shí)施例
實(shí)施例1，一種卷煙煙氣凝集物毒理學(xué)生物測定方法，包括以下步驟1、煙氣粒相物的獲得。確定所要選用及需處理的樣品，在恒溫恒濕(20°c和60%相對濕度)條件下平衡48h，通過德國Borgwaldt公司生產(chǎn)的RM- 20型轉(zhuǎn)盤式20孔道吸煙機(jī)(需維持恒溫恒濕，20°C和60%相對濕度的條件),在標(biāo)準(zhǔn)抽吸條件下(I puff/ min , 2 s/ puff , 35 mL/ puff)抽吸，煙氣通過85 _直徑的劍橋?yàn)V片收集。濾紙?jiān)谑占療煔庵昂褪占隉煔庵蠓謩e稱重，最后得出所收的煙氣的重量。(具體參見陜西中煙中心實(shí)驗(yàn)室)
2、煙氣粒相物的提取。將獲得的濾紙片取下密封拿回(須密封保存，維持恒定的條件)，處理時(shí)，用剪刀剪碎(一般對折之后剪成3-4小塊/片)放入50 mL離心管中，加入20mL 二甲基亞砜以使其完全浸沒濾紙碎片。常溫放置60min，置于搖床中于220r/min、3(TC下振蕩4hrs后，再在超聲儀上超聲40min,然后離心(30 °C, 5000rpm) 30min,最后將獲得的液體吸出，濾紙片取出并擠壓完全。收集入離心管中4°C密封保存，使用時(shí)需融化并IOOOOrpm, 27°C (溫度過低會導(dǎo)致凝固，過高會導(dǎo)致?lián)]發(fā))離心10分鐘，然后取出上清直接實(shí)驗(yàn)。注意整個(gè)過程要密封。溫度不可以過低(<20°C)或者過高(>45°C)。3、細(xì)胞增殖/細(xì)胞毒試驗(yàn)
細(xì)胞株CCL-64貂肺上皮細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%談牛血清得DMEM完全培養(yǎng)基中，經(jīng)時(shí)添加培養(yǎng)基并傳代，維持細(xì)胞在對數(shù)生長期。檢測時(shí)，取培養(yǎng)至對數(shù)期的細(xì)胞株，以含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(隨后檢測過程均以此培養(yǎng)基)調(diào)細(xì)胞濃度至IxlO5 /ml,接種于96孔板，IO4/孔細(xì)胞。添加待試的TPM 20%起始，對倍稀釋。37°C培養(yǎng)48小時(shí)，加MTT (儲存液2mg/ml)20l·! I/孔，繼續(xù)孵育4小時(shí)，棄上清，加DMSO 150ul/孔，570nm/630nm讀取光密度。分析結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種卷煙煙氣凝集物毒理學(xué)生物測定方法，其特征在于，包括以下步驟1)煙氣粒相物的獲得確定所要選用及需處理的樣品，在恒溫恒濕，即20°C和60%相對濕度條件下平衡48h，通過德國Borgwaldt公司生產(chǎn)的RM- 20型轉(zhuǎn)盤式20孔道吸煙機(jī)， 在維持20°C和60%相對濕度條件下,在標(biāo)準(zhǔn)抽吸條件下，即1 puff/ min , 2 s/ puff , 35 mL/ puff抽吸,煙氣通過85 mm直徑的劍橋?yàn)V片收集；2)煙氣粒相物的提取將獲得的濾紙片取下密封保存，處理時(shí)，用剪刀剪碎，放入50 mL離心管中，加入二甲基亞砜以使其完全浸沒濾紙碎片，30°C下振蕩4hrs后，30°C， 5000rpm條件下離心，取上清液體，收集入離心管中4°C密封保存?zhèn)溆茫?)細(xì)胞增殖/細(xì)胞毒試驗(yàn)細(xì)胞株CCL-64貂肺上皮細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基中，經(jīng)時(shí)添加培養(yǎng)基并傳代，維持細(xì)胞在對數(shù)生長期，待用；取培養(yǎng)至對數(shù)期的細(xì)胞株，調(diào)細(xì)胞濃度至1x105 /ml,接種于96孔板，104/孔細(xì)胞， 添加待試的TPM 20%起始，對倍稀釋，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，加MTT，即儲存液2mg/ml，20y I/ 孔，繼續(xù)孵育4小時(shí)，棄上清，加DMSO 150ul/孔，570nm/630nm讀取光密度，分析結(jié)果，一般結(jié)果顯示，高濃度煙氣凝集物表現(xiàn)為直接的細(xì)胞毒效應(yīng)，即OD值低于陰性對照，當(dāng)待測樣品濃度降低時(shí)則表現(xiàn)為刺激細(xì)胞增殖，OD值高于陰性對照，以明顯刺激細(xì)胞增殖的最高稀釋度為觀察終點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明屬于卷煙煙氣凝集物毒性細(xì)胞效應(yīng)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種卷煙煙氣凝集物毒理學(xué)生物測定方法?，F(xiàn)有技術(shù)不能充分的反映其煙氣凝集物的生物學(xué)毒性。為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是本發(fā)明在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)下，以哺乳動物氣管上皮細(xì)胞或肺上皮細(xì)胞為靶細(xì)胞，以煙氣凝集物為待測樣品，兩者共育一定時(shí)間，以MTT法檢測受試靶細(xì)胞增殖狀態(tài)，反映待測樣品是否刺激靶細(xì)胞增殖，以細(xì)胞增殖的多少反映待測樣品的生物學(xué)活性，即“毒性”，本發(fā)明對細(xì)胞毒試驗(yàn)是一個(gè)有用的補(bǔ)充，即檢測煙氣凝集物對靶細(xì)胞增殖的刺激作用。這種細(xì)胞增殖刺激作用比直接的細(xì)胞毒作用更靈敏。
文檔編號G01N1/28GK103018431SQ20121051524
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者雷東鋒, 王一理, 韓航航, 鄧寶安, 任軍林, 王宗英, 王科杰, 王大鋒 申請人:陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司