專利名稱：一種金柑中檸檬苦素和諾米林的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種金柑中檸檬苦素和諾米林的測定方法，屬于化學(xué)分析檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
金柑(Fortunella crassifolia Swingle)也稱金橘、金實(shí)、柑子、山橘、盧橘、四季橘，是蕓香科、柑橘亞科、金柑屬植物，為福建省特色水果之一。尤溪縣是福建省金柑主產(chǎn)區(qū)，也是我國金柑五大產(chǎn)區(qū)之一，2007年尤溪金柑獲得國家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。近年來，金柑果實(shí)因其營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，已漸漸被消費(fèi)者接受。金柑鮮食通常無苦味，但經(jīng)榨汁、殺菌等加工處理后就表現(xiàn)出苦味，這種現(xiàn)象稱之為“延遲苦味”。金柑汁出現(xiàn)“延遲苦味”的原因主要是在酸性條件和檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶的催化下，果實(shí)中所存在的非苦味的檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)變成了具有強(qiáng)烈苦味的檸檬苦素類化合物所造成。檸檬苦素類化合物是一類高度氧化的四環(huán)三萜類植物次生代謝產(chǎn)物，主要存在于 蕓香科和楝科的植物組織中。金柑中含有較多朽1檬苦素(Limonin)和諾米林(Nomilin),這2種苷兀是引起金柑汁苦味的主要原因之一。據(jù)報(bào)道，有強(qiáng)烈苦味的朽1檬苦素和諾米林在果汁中含量超過6mg/L，那么果汁就不適合飲用。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，檸檬苦素在水溶液中的苦味閾值約為6mg/L，比柚皮苷要苦20倍。由于金柑中檸檬苦素類化合物等苦味物質(zhì)的存在，大大影響了金柑加工產(chǎn)品的口感，限制了金柑的深加工和消費(fèi)者的需求。檸檬苦素含量的高低直接影響金柑及其產(chǎn)品的品質(zhì)，測定檸檬苦素的含量有利于控制金柑及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。這些苦味物質(zhì)雖影響金柑產(chǎn)品的口感，但具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗腫瘤等功能，應(yīng)用價(jià)值很高。因此建立一種可靠的分析方法，分析金柑中檸檬苦素和諾米林的含量變化，不僅有利于金柑產(chǎn)品的深加工，也有利于開發(fā)利用金柑中的苦味物質(zhì)。目前，檸檬苦素的提取方法主要有結(jié)晶分離法、索氏提取法、超臨界流體萃取法、樹脂吸附法、微波消解法和超聲波法等。其中超聲波法提取是一種新興的提取技術(shù)，此方法快速、高效，尤其適于易揮發(fā)、低沸點(diǎn)的有效成分提取。研究金柑中的苦味物質(zhì)，需要一種能精確定量金柑苦味物質(zhì)的分析方法。已報(bào)道的檢測方法很多，主要有HPLC法、Davis法、TLC法、UV法、RIA法等。以上方法中Davis法測定的步驟繁瑣，UV法僅適用于對(duì)檸檬苦素類化合物總量的測定，TLC法因依靠目測進(jìn)行定量，測試結(jié)果誤差較大，RIA法檢測不僅需用到昂貴的計(jì)數(shù)器，而且還存在放射性保護(hù)和廢物處理等問題。目前多采用HPLC法檢測檸檬苦素類化合物，但是由于水果與果汁中檸檬苦素類化合物含量常超越該方法的線性范圍和檢出限，測定結(jié)果有誤差。同時(shí)相同流速下分析時(shí)間較長，通常為十幾分鐘，消耗流動(dòng)相。隨著色譜柱填料技術(shù)的發(fā)展，超高效液相色譜(Ultra Performance LiquidChromatography, UPLC)技術(shù)比傳統(tǒng)的HPLC技術(shù)具有更高的分離能力，大大改善了分析速度、靈敏度和分離度。目前，對(duì)于應(yīng)用超高效液相色譜法同時(shí)測定金柑中檸檬苦素和諾米林的方法未見文獻(xiàn)報(bào)道及專利公開。本方法旨在建立UPLC同時(shí)測定金柑中檸檬苦素和諾米林的分析方法，以實(shí)現(xiàn)檸檬苦素類化合物快速、準(zhǔn)確的檢測，以豐富檸檬苦素類化合物的檢測手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的為提供一種超高效液相色譜技術(shù)快速測定金柑中檸檬苦素和諾米林的定量分析方法，該方法提取方法簡單、操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可同時(shí)快速測定金柑中檸檬苦素和諾米林的含量。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
利用超高效液相色譜快速測定金柑中檸檬苦素和諾米林的方法，步驟如下將金柑果實(shí)去籽，45°C熱風(fēng)烘干至恒重，粉碎過40目篩，制得金柑粉末；稱取5. Og金柑粉末置于燒瓶中，加入IOOmL 二氯甲烷，50°C超聲波提取lh，提取液抽濾后取濾液，50°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，乙腈溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜罥OOmL,經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾得清液，采用超高效液相色譜分析，測定金柑中檸檬苦素和諾米林的含量；超高效液相色譜的分析條件為ACQUITY UPLC BEH C18規(guī)格為2. ImmX 100 mm、I. 7 μ m的色譜柱，流動(dòng)相為體積比45 55的乙腈一/K，柱溫為35°C，流速為0. 3mL/min，進(jìn)樣量2yL，檢測波長為215nm。所述超高效液相色譜的檢測器為PDA檢測器。所述金柑果實(shí)應(yīng)挑選無病蟲害、無霉變、無腐爛的金柑果實(shí)作為加工原料。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為
(I)本發(fā)明建立了一種同時(shí)檢測檸檬苦素和諾米林的分析方法，操作簡便、步驟較少。本發(fā)明通過優(yōu)化色譜條件，使檸檬苦素和諾米林濃度范圍分別為I 1780μ g/mL和I 1720 μ g/mL時(shí)與色譜峰面積具有良好線性關(guān)系，滿足在日常檢測中柑橘類水果的檸檬苦素和諾米林的檢測要求，克服了傳統(tǒng)高效液相色譜對(duì)檸檬苦素和諾米林檢測范圍較低的不足。(2)本發(fā)明采用了超高效液相色譜技術(shù)有效減少了分析時(shí)間、節(jié)省了流動(dòng)相用量。將常規(guī)液相色譜分析所需的幾十分鐘時(shí)間縮短為幾分鐘，流動(dòng)相的消耗量不及傳統(tǒng)方法的十分之一。在保證分離度的同時(shí)，降低了分析成本，提高了分析效率。(3)本發(fā)明的檸檬苦素的加標(biāo)回收率在97. 19 100. 06%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為O. 74 2. 25% ;諾米林的加標(biāo)回收率在95. 35 99. 83%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為O. 8(Γ3. 36% ;方法的重復(fù)性較高，準(zhǔn)確性較好。


圖I為檸檬苦素與諾米林的紫外掃描吸收圖；其中圖I(a)為檸檬苦素的紫外掃描吸收圖，圖I (b)為諾米林的紫外掃描吸收圖。圖2為標(biāo)準(zhǔn)品和提取樣品的UPLC色譜圖；其中圖2 Ca)為標(biāo)準(zhǔn)品中檸檬苦素、諾米林的UPLC色譜圖，峰I :檸檬苦素，峰2 :諾米林；圖2 (b)為提取樣品中檸檬苦素、諾米林的UPLC色譜圖，峰I :檸檬苦素，峰2 :諾米林。圖3為UPLC標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；其中圖3 (a)為檸檬苦素的UPLC標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，圖3(b)為諾米林的UPLC標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
具體實(shí)施例方式通過以下具體實(shí)施步驟，進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是實(shí)施例僅用于說明，并不能限制本發(fā)明的范圍。測試儀器與色譜條件
ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司);色譜柱型號(hào)ACQUITY UPLC BEH C18 柱(2. ImmX 100 mm, I. 7 μ m, Waters 公司，USA);流動(dòng)相乙腈水(45 : 55);柱溫35°C;流速0. 3mL/min ;進(jìn)樣體積:2 μ L ;檢測器=PDA檢測器；檢測波長215nm ;流動(dòng)相梯度程序等度洗脫。輔助類儀器
高速組織搗碎機(jī)(天津市臺(tái)斯特儀器有限公司，F(xiàn)W135);超聲波振蕩器(上海生析超聲儀器有限公司，DS-8510 DTH);高速冷凍離心機(jī)(美國貝克曼公司，AvantiJ-E);分析天平(德國賽多利斯)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器生化廠，RE-52AA)超純水純化系統(tǒng)·
(美國Millipore公司)；渦旋混合器。試劑和樣品
乙腈(色譜純)；水為超純水；二氯甲烷(分析純)、乙醇(分析純)；檸檬苦素和諾米林標(biāo)樣，購自SIGMA公司。標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的制備
標(biāo)準(zhǔn)溶液配制分別準(zhǔn)確稱取檸檬苦素和諾米林標(biāo)準(zhǔn)品O. 0178g和O. 0172g,用乙腈溶解并定容至10mL。分別配制成含朽1檬苦素I. 78mg/mL和諾米林I. 72mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品制備將金柑去籽，45°C熱風(fēng)烘干至恒重后，粉碎過40目篩，制得金柑粉末。取粉末5. Og置于燒瓶中，加入IOOmL 二氯甲烷50°C下超聲波提取lh。提取液抽濾后取濾液，50°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，乙腈溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜罥OOmL,混勻，經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾得清液，以用于進(jìn)樣分析。實(shí)施步驟I :超高效液相色譜檢測波長的選擇
以乙腈為空白，采用PDA檢測器在200 400nm范圍內(nèi)對(duì)一定濃度的檸檬苦素和諾米林的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見附圖I (a)與I (b)。選擇檸檬苦素和諾米林的最大吸收波長一215nm作為此方法的檢測波長。實(shí)施步驟2 :樣品提取溶劑的選擇
選擇二氯甲烷、乙醇、丙酮三種溶劑50°C水浴提取lh，結(jié)果見表I。二氯甲烷提取效果為佳。表I不同溶劑對(duì)檸檬苦素和諾米林提取效果的影響
_剤檸懌苦緊mg gm米林, S g
二飄甲烷0S6009!
_O *00.0SS
ZMO. CQM2
實(shí)施步驟3 :樣品提取方法的選擇水浴提取法取金柑粉末5. O g置于燒瓶中，加入IOOmL提取溶劑50°C水浴回流提取。采用二氯甲烷作為提取溶劑，對(duì)水浴提取和超聲波提取進(jìn)行了比較。結(jié)果見表2。超聲波方法提取Ih效果為佳。表2不同提取方法對(duì)檸檬苦素和諾米林提取效果的影響
權(quán)利要求
1.一種利用超高效液相色譜快速測定金柑中檸檬苦素和諾米林的方法，其特征在于將金柑果實(shí)去籽，45°c熱風(fēng)烘干至恒重，粉碎過40目篩，制得金柑粉末；稱取5. Og金柑粉末置于燒瓶中，加入IOOmL 二氯甲烷，50°C超聲波提取lh，提取液抽濾后取濾液，50°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，乙腈溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜罥OOmL,經(jīng)O. 22 μ m濾膜過濾得清液，采用超高效液相色譜分析，測定金柑中檸檬苦素和諾米林的含量；超高效液相色譜的分析條件為ACQUITYUPLC BEH C18規(guī)格為2. 1_X 100 mmU. 7ym的色譜柱，流動(dòng)相為體積比45 55的乙腈—7jC,柱溫為35°C,流速為0. 3mL/min,進(jìn)樣量2 μ L，檢測波長為215nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種利用超高效液相色譜快速測定金柑中檸檬苦素和諾米林的方法，其特征在于超高效液相色譜的檢測器為=PDA檢測器。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用超高效液相色譜快速測定金柑中檸檬苦素和諾米林的測定方法，屬于化學(xué)分析檢測領(lǐng)域。該方法將金柑果實(shí)去籽，45℃熱風(fēng)烘干至恒重，粉碎過40目篩，制得金柑粉末。稱取5.0g粉末置于燒瓶中，加入100mL二氯甲烷，50℃超聲波提取1h。提取液抽濾后取濾液，50℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，乙腈溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?00mL，混勻，經(jīng)0.22μm濾膜過濾得清液，采用超高效液相色譜分析。該方法提取方法簡單、操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可同時(shí)快速測定金柑中檸檬苦素和諾米林的含量。本發(fā)明具有高效、合理、準(zhǔn)確和重復(fù)性好等特點(diǎn)，適用于金柑中檸檬苦素和諾米林的微量分析。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102944623SQ20121047266
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者鄭寶東, 張怡, 孟鵬, 盧旭, 曾紹校 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)