專利名稱：一種基于點(diǎn)擊化學(xué)仿生分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及對(duì)食品過(guò)敏原的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品過(guò)敏原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)是一種能夠檢測(cè)食品過(guò)敏原的電化學(xué)傳感器制備，本發(fā)明還涉及采用所述的仿生分子印跡技術(shù)測(cè)定樣品中痕量食品過(guò)敏原的方法。
背景技術(shù)：
食品過(guò)敏原現(xiàn)已成為一個(gè)新興的公眾性食品安全問(wèn)題，特別是在發(fā)達(dá)國(guó)家，調(diào)查顯示全世界范圍內(nèi)有超過(guò)1%的成年人對(duì)食品過(guò)敏，而嬰幼兒和兒童發(fā)生率達(dá)到了 5%-10%。一般來(lái)說(shuō)，食品過(guò)敏原為分別屬于不同家族的蛋白或糖蛋白，微量的食品過(guò)敏原蛋白即可 引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。近年來(lái)，國(guó)際食品法典委員會(huì)、各發(fā)達(dá)國(guó)家紛紛出臺(tái)了各種食品過(guò)敏原標(biāo)識(shí)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)的實(shí)施措施，其中以美國(guó)和歐盟的尤為嚴(yán)格，已經(jīng)進(jìn)入了強(qiáng)制性實(shí)施階段，這對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品、食品進(jìn)出口貿(mào)易帶來(lái)了不容忽視的影響。我國(guó)也于2008年奧運(yùn)會(huì)期間正式開(kāi)展了食品過(guò)敏原檢測(cè)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定工作。目前系統(tǒng)全面精確可靠的食品中過(guò)敏原檢測(cè)和分析技術(shù)體系形成迫在眉睫。過(guò)敏原反應(yīng)是由過(guò)敏原入侵人體內(nèi)而致,引起過(guò)敏反應(yīng)的反應(yīng)原一般為具有酸性等電點(diǎn)的蛋白或糖蛋白。過(guò)敏原在食品的加工處理中表現(xiàn)出極大的穩(wěn)定性，通過(guò)一般加工手段如加熱、超高壓、烘烤、干燥后其酶活性仍然存在，尚具備一定程度的致敏性，這是食品安全上的一個(gè)難題。世界糧油組織1995年報(bào)告，90%以上的食物過(guò)敏反應(yīng)是由牛奶、雞蛋、魚(yú)、貝殼海產(chǎn)品、花生、大豆、果仁和小麥8類食物引起，10%的過(guò)敏原是由170多種其他食物引起。檢測(cè)過(guò)敏原的方法主要有I)體內(nèi)檢查，如皮膚試驗(yàn)(劃痕試驗(yàn)，點(diǎn)刺試驗(yàn),皮內(nèi)注射試驗(yàn))和激發(fā)試驗(yàn)(氣道粘膜、結(jié)膜激發(fā)反應(yīng))；2)體外檢查，如嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒試驗(yàn)、放射免疫吸附試驗(yàn)(RIST)、放射變應(yīng)原吸附試驗(yàn)(RAST)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。其中應(yīng)用最為廣泛的方法是皮膚試驗(yàn)，它為過(guò)敏癥診斷可提供快速但卻是非定量的結(jié)果，而無(wú)論對(duì)醫(yī)生還是病人來(lái)講，體外診斷無(wú)疑是方便和可靠的，但由于ELISA檢測(cè)試劑盒和試條，存在復(fù)雜的抗體制備過(guò)程，價(jià)格較為昂貴；PCR技術(shù)雖具有開(kāi)發(fā)前景，但是食品處理過(guò)程中DNA的變性作用和該方法的最大檢測(cè)限度限制了其在當(dāng)前的應(yīng)用和發(fā)展。迫切需要開(kāi)發(fā)各種特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快、成本低、檢測(cè)面廣的分析檢測(cè)方法和技術(shù)來(lái)適應(yīng)形勢(shì)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于點(diǎn)擊化學(xué)仿生分子印跡食品過(guò)敏原快速檢測(cè)傳感器的制備及應(yīng)用，本發(fā)明以仿生分子印跡膜為基礎(chǔ)，建立了食品過(guò)敏原的電化學(xué)仿生免疫傳感快速檢測(cè)方法，成功建立了快速、特異、靈敏的檢測(cè)食品過(guò)敏原的傳感器。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種基于點(diǎn)擊化學(xué)仿生分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及對(duì)食品過(guò)敏原的檢測(cè)，其特征是包括以下步驟
(O 選擇與電極表面固定的疊氮燒基硫醇，制備疊氮端基的自組裝單層膜；
(2)通過(guò)與丙烯酸丙炔酯點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，對(duì)疊氮端基的自組裝單層膜進(jìn)行端基烯基功能化；
(3)選擇能與過(guò)敏原反應(yīng)合成過(guò)敏原仿生分子印跡聚合物(MIPs)的功能單體；
(4)利用現(xiàn)有方法制備出石墨烯材料，摻入到仿生分子印跡聚合物；
(5)按一定物質(zhì)的量比將食品過(guò)敏原的模板分子、功能單體、石墨烯、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑和有機(jī)溶劑混合均勻，制備分子印跡聚合物溶液；
(6 ) 將分子印跡聚合物溶液滴于經(jīng)過(guò)(2 )處理過(guò)的電極表面，紫外光引發(fā)制備摻有石墨烯的仿生分子印跡聚合物；
本發(fā)明所述食品過(guò)敏原仿生分子印跡聚合物的模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、致孔齊U、引發(fā)劑和有機(jī)溶劑的物質(zhì)的量比為O. I I : I : O. 5 5 20 55 O. 05
O.2 : I. 5 30，每毫升中摻入IOmg石墨烯。本發(fā)明所述摻有石墨烯材料的仿生分子印跡聚合物制備的傳感器檢測(cè)痕量食品過(guò)敏原的方法，將按上述任意一種方法制得的分子印跡聚合物通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)修飾于工作電極制備電化學(xué)傳感器，對(duì)食品提取液中的食品過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)，其特征是包括如下步驟
(1)含過(guò)敏原食品經(jīng)正己烷4°C浸提過(guò)夜，冷凍離心，收集上清液，用30%_50%飽和度硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)組分溶解在PBS中，分別加硫酸至pH 5. 2或pH4. 5等電點(diǎn)，離心后沉淀物溶解在PBS中，得到食品過(guò)敏原；
(2)將所用金電極(Φ=4ι πι)用O. 05 μ m的招粉進(jìn)行拋光,用piranha溶液(H2SO4/H202=3:1)浸泡5min，二次蒸餾水洗滌，氮?dú)鈿夥崭稍?，將清洗過(guò)的電極在O. 5mol/L的H2SO4溶液中于-O. 8^1. 5V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，再用二次蒸餾水清洗干凈，氮?dú)鈿夥障赂稍?°C保存使用；
(3)將(2)處理過(guò)的金電極,在lmmol/L硫代癸燒和2mmol/L疊氮^ 燒基硫醇混合液中孵育24h，然后用二次蒸餾水洗滌干凈，氮?dú)獯蹈桑?br> (4)將步驟(3)處理過(guò)的電極浸入到丙烯酸丙炔酯溶液中，溶液中含有抗壞血酸和硫酸銅，避光放置20h，先用甲醇洗滌，然后二次蒸餾水洗滌，晾干；
(5)將步驟(4)處理過(guò)的工作電極晾干后滴加MIPs溶液20μ L，紫外光(365nm)下誘導(dǎo)聚合反應(yīng)lh，然后將工作電極用洗脫劑洗脫10-15分鐘，在室溫下干燥5-10分鐘，成功制備過(guò)敏原仿生分子印跡膜電化學(xué)傳感器，保存在4°C的冰箱中備用；
(6)將制得的過(guò)敏原分子印跡膜電極連接到電化學(xué)工作站，對(duì)樣品提取液中的過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)。所述的置氣燒基硫醇為置氣十一燒基硫醇，丙稀酸丙塊酷對(duì)置氣端基的自組裝單層膜進(jìn)行端基烯基功能化。所述的仿生分子印跡電化學(xué)傳感器的工作電極為金電極(Φ=4πιπι)；
所述的模板食品過(guò)敏原可以是水溶性并與功能單體、交聯(lián)單體相容；
所述的功能單體為丙烯酰胺(AM)、甲基丙烯酰胺(MAM)、丙烯酸(ΑΑ)、甲基丙烯酸(MAA)或4-乙烯基吡啶(4-VP)；
所述交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRM)、N、N-亞甲基二丙烯酰胺、3，5_ 二(丙烯酰胺)苯甲酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)；
所述的引發(fā)劑是可以引起聚合反應(yīng)但不使模板蛋白發(fā)生變性的所有引發(fā)劑包括熱引發(fā)劑和光引發(fā)劑，包括偶氮二異丁腈、過(guò)硫酸鉀、過(guò)硫酸銨、二乙基二硫代氨基甲酸鈉等；所述致孔劑采用二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、異丙醇；
所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷或四氯化碳；
所述洗脫液為可以將模板蛋白從印跡膜上洗脫的緩沖溶液、鹽溶液、堿溶液和變性劑等，包括各種濃度的磷酸鹽緩沖溶液或NaCl鹽溶液和NaOH堿溶液或變性劑十二烷基硫酸鈉等。
具體實(shí)施方式
·
實(shí)施例I :花生過(guò)敏原的檢測(cè)
(1)稱取花生30g，使用組織破碎機(jī)破碎得粉末，按重量體積比g/mL為1:10浸入正己烷中脫脂，4°C浸提過(guò)夜，冷凍離心，收集上層蛋白浸液，IOmL蛋白浸液緩慢加至質(zhì)量濃度30%的飽和硫酸銨，4°C下靜置過(guò)夜，離心沉淀，對(duì)上層清液再緩慢加至質(zhì)量濃度50%飽和硫酸銨，靜置30min，離心，將30%-50%飽和度沉淀的蛋白質(zhì)組分溶解在PBS中，加硫酸至PH5. 2等電點(diǎn)，離心后沉淀物溶解在PBS中，裝入透析袋對(duì)蒸餾水透析4h，期間換透析液一次，然后轉(zhuǎn)至PBS中繼續(xù)透析，即得花生過(guò)敏原待測(cè)液，取待測(cè)液ImL加入傳感反應(yīng)池中進(jìn)行檢測(cè)；
(2)選擇能與花生過(guò)敏原合成仿生分子印跡聚合物的功能單體丙烯酰胺(AM)；
(3)石墨烯材料溶液的制備在超聲攪拌的條件下，取2mg石墨烯加入到水中，從而獲得黑色溶液；
(4)模板分子花生過(guò)敏原，功能單體丙烯酰胺(AM)，交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，致孔劑氯仿，引發(fā)劑過(guò)硫酸鉀，有機(jī)溶劑二氯甲烷按物質(zhì)的量比為
O.5 I I 40 O. I 2.0，摻入石墨烯，混合均勻，得到花生過(guò)敏原MIPs溶液；
(5)工作電極選用金電極為工作電極，將所用金電極(Φ=4πιπι)用O.05 μ m的鋁粉進(jìn)行拋光，用piranha溶液(H2S04/H202=3:1 )浸泡5min, 二次蒸懼水洗漆,氮?dú)鈿夥崭稍?將清洗過(guò)的電極在O. 5mol/L的H2SO4溶液中于-O. 8^1. 5V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，再用二次蒸餾水清洗干凈，保證電極表面無(wú)雜質(zhì)；
(6)將(5)處理好的金電極,在lmmol/L硫代癸燒和2mmol/L疊氮^燒基硫醇混合液中孵育24h，然后用二次蒸餾水洗滌干凈，氮?dú)獯蹈桑?br> (7)將步驟(6)制備好的電極浸入到丙烯酸丙炔酯溶液中，溶液中含有O.lmol/L抗壞血酸和O. 05mol/L硫酸銅，避光放置20h，先用甲醇洗滌2次，然后二次蒸餾水洗滌3次，晾干;
(8)將步驟(7)處理過(guò)的工作電極晾干后滴加MIPs溶液20μL，紫外光(365nm)下誘導(dǎo)聚合反應(yīng)lh，將電極在l%SDS-10%HAc混合液洗脫中浸泡10 min，直至把這一層中的模版分子花生過(guò)敏原完全洗掉，在室溫下干燥10 min，成功制備花生過(guò)敏原仿生分子印跡電化學(xué)傳感器，保存在4°C的冰箱中備用；
(9)將制得的花生過(guò)敏原分子印跡膜電極連接到電化學(xué)工作站，對(duì)花生樣品提取液中的花生過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)，花生過(guò)敏原蛋白的最低檢測(cè)限為10ng/mL。
實(shí)施例2 :雞蛋過(guò)敏原檢測(cè)
(1)將雞蛋中蛋清與蛋黃分開(kāi)，稱取蛋清30g，按重量體積比g/mL為1:10浸入正己烷中脫脂，將蛋清攪拌均勻，4°C浸提過(guò)夜，冷凍離心，收集上層蛋白浸液，IOmL蛋白浸液緩慢加至質(zhì)量濃度30%的飽和硫酸銨，4°C下靜置過(guò)夜，離心沉淀，對(duì)上層清液再緩慢加至質(zhì)量濃度50%飽和硫酸銨，靜置30min，離心，將30%_50%飽和度沉淀的蛋白質(zhì)組分溶解在PBS中，加硫酸至PH5. 2等電點(diǎn)，離心后沉淀物溶解在PBS中，裝入透析袋對(duì)蒸餾水透析4h，期間換透析液一次，然后轉(zhuǎn)至PBS中繼續(xù)透析，即得雞蛋過(guò)敏原待測(cè)液，取待測(cè)液ImL加入傳感反應(yīng)池中進(jìn)行檢測(cè)；
(2)選擇能與雞蛋過(guò)敏原合成仿生分子印跡聚合物的功能單體甲基丙烯酰胺(MAM)；
(3)石墨烯材料溶液的制備在超聲攪拌的條件下，取2mg石墨烯加入到水中，從而獲得黑色溶液；
(4)模板分子雞蛋過(guò)敏原，功能單體甲基丙烯酰胺(MAM)，交聯(lián)劑3，5_二 (丙烯酰胺)苯甲酸，致孔劑四氯化碳，引發(fā)劑偶氮二異丁腈，有機(jī)溶劑四氯化碳按物質(zhì)的量比為
O.2 I O. 5 50 O. 15 5. 0，摻入適量石墨烯，混合均勻，得到雞蛋過(guò)敏原MIPs溶液；
(5)工作電極選用金電極為工作電極，將所用金電極(Φ=4πιπι)用O.05 μ m的鋁粉進(jìn)行拋光，用piranha溶液(H2S04/H202=3:1 )浸泡5min, 二次蒸懼水洗漆,氮?dú)夥崭稍?將清洗過(guò)的電極在O. 5mol/L的H2SO4溶液中于-O. 8^1. 5V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，再用二次蒸餾水清洗干凈，保證電極表面無(wú)雜質(zhì)；
(6)將處理好的金電極，在lmmol/L硫代癸烷和2mmol/L疊氮i^一烷基硫醇混合液中孵育24h，然后用二次蒸餾水洗滌干凈，氮?dú)獯蹈桑?br> (7)將步驟(6)制備好的電極浸入到丙烯酸丙炔酯溶液中，溶液中含有O.lmol/L抗壞血酸和O. 05mol/L硫酸銅，避光放置20h，先用甲醇洗滌2次，然后二次蒸餾水洗滌3次，晾干;
(8)將步驟(7)中晾干的工作電極上滴加步驟(4)制備的MIPs溶液20yL，紫外光(365nm)下誘導(dǎo)聚合反應(yīng)lh，將電極在l%SDS_10%HAc混合液洗脫中浸泡lOmin，直至把這一層中的模版分子雞蛋過(guò)敏原完全洗掉，在室溫下干燥10 min，成功制備雞蛋過(guò)敏原仿生分子印跡電化學(xué)傳感器，保存在4°C的冰箱中備用；
(9)將制得雞蛋過(guò)敏原分子印跡膜電極連接到電化學(xué)工作站，對(duì)雞蛋樣品提取液中的雞蛋過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)，雞蛋過(guò)敏原蛋白的最低檢測(cè)限為2. Ong/mL。
權(quán)利要求
1.一種基于點(diǎn)擊化學(xué)食品過(guò)敏原仿生分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及應(yīng)用，其特征是包括以下步驟 (O選擇與電極表面固定的疊氮燒基硫醇，制備疊氮端基的自組裝單層膜； (2)通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，對(duì)疊氮端基的自組裝單層膜進(jìn)行端基烯基功能化； (3)選擇能與過(guò)敏原反應(yīng)合成過(guò)敏原仿生分子印跡聚合物(MIPs)的功能單體； 利用現(xiàn)有方法制備出石墨烯材料，摻入到仿生分子印跡聚合物； (5)按一定物質(zhì)的量比將食品過(guò)敏原的模板分子、功能單體、石墨烯、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑和有機(jī)溶劑混合均勻，制備分子印跡聚合物溶液； (6)將分子印跡聚合物溶液滴于經(jīng)過(guò)(2)處理過(guò)的電極表面，紫外光引發(fā)制備摻有石墨烯的仿生分子印跡聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述點(diǎn)擊化學(xué)食品過(guò)敏原仿生分子印跡的制備方法，其特征是所述食品過(guò)敏原仿生分子印跡聚合物的模板分子、功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑和有機(jī)溶劑的物質(zhì)的量比為O. I I : I : O. 5 5 20 55 O. 05 O. 2 I. 5 30，每毫升中摻入IOmg石墨烯。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述點(diǎn)擊化學(xué)食品過(guò)敏原仿生分子印跡的制備方法，其特征是所述摻有石墨烯材料的仿生分子印跡聚合物MIPs修飾到傳感器檢測(cè)痕量食品過(guò)敏原的方法，其特征是包括如下步驟 含過(guò)敏原食品經(jīng)正己烷4°C浸提過(guò)夜，冷凍離心，收集上清液；用30%-50%飽和度硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)組分溶解在PBS中，分別加硫酸至pH5. 2或pH4. 5等電點(diǎn)，離心后沉淀物溶液在PBS中，得到食品過(guò)敏原； 將所用金電極(Φ=4ι πι)用O. 05 μ m的招粉進(jìn)行拋光,用piranha溶液(H2S04/H202=3:1)浸泡5min，二次蒸餾水洗滌，氮?dú)夥崭稍?，將清洗過(guò)的電極在O. 5mol/L的H2SO4溶液中于-O. 8^1. 5V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定，再用二次蒸餾水清洗干凈，氮?dú)夥障赂稍?°C保存使用； 將(2)處理好的金電極，在lmmol/L硫代癸烷和2mmol/L疊氮i^一烷基硫醇混合液中孵育24h，然后用二次蒸餾水洗滌干凈，氮?dú)獯蹈桑? 將步驟(3 )制備好的電極浸入到丙烯酸丙炔酯溶液中，溶液中含有抗壞血酸和硫酸銅，避光放置20h，先用甲醇洗滌，然后二次蒸餾水洗滌，晾干； 將步驟(4)中晾干的工作電極上滴加MIPs溶液20yL，紫外光(365nm)下誘導(dǎo)聚合反應(yīng)lh，然后將工作電極用洗脫劑洗脫10-15分鐘，在室溫下干燥5-10分鐘，成功制備過(guò)敏原仿生分子印跡膜電化學(xué)傳感器，保存在4°C的冰箱中備用； 將制得的過(guò)敏原分子印跡膜電極連接到電化學(xué)工作站，對(duì)樣品提取液中的過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的置氣燒基硫醇為置氣十一燒基硫醇，丙稀酸丙塊酷對(duì)置氣端基的自組裝單層膜進(jìn)行端基烯基功能化。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的模板食品過(guò)敏原可以是水溶性并與功能單體、交聯(lián)單體相容。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述洗脫液為可以將模板蛋白從印跡膜上洗脫的緩沖溶液、鹽溶液、堿溶液和變性劑等，包括各種濃度的磷酸鹽緩沖溶液或NaCl鹽溶液和NaOH堿溶液或變性劑十一焼基硫酸納等 。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基于點(diǎn)擊化學(xué)仿生分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及對(duì)食品過(guò)敏原的檢測(cè)方法。選擇與電極表面固定的疊氮烷基硫醇，制備疊氮端基的自組裝單層膜；通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，對(duì)疊氮端基的自組裝單層膜進(jìn)行端基烯基功能化；選擇能與過(guò)敏原反應(yīng)合成過(guò)敏原人工抗體的MIPs的功能單體；利用現(xiàn)有方法制備出石墨烯材料，摻入到人工抗體的制備；按一定物質(zhì)的量比將食品過(guò)敏原的模板分子、功能單體、石墨烯、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑和有機(jī)溶劑混合均勻制備摻有石墨烯的仿生分子印跡聚合物(MIPs)；將制得的分子印跡聚合物修飾工作電極連接到電化學(xué)工作站，對(duì)食品提取液中的食品過(guò)敏原進(jìn)行檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/26GK102944590SQ20121047217
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者葛慎光, 顏梅, 于京華, 葛磊, 黃加棟, 張彥, 楚成超, 王盼盼, 劉芳, 劉偉艷, 孫國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)