專利名稱：利用免疫層疊法進(jìn)行可溶性靶物質(zhì)的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種利用免疫層疊法進(jìn)行可溶性靶物質(zhì)檢測的方法。
背景技術(shù)：
免疫學(xué)技術(shù)是一類用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)研究，臨床診斷，及其相關(guān)生物制品生產(chǎn)監(jiān)測的實(shí)驗(yàn)方法。該類方法大致分為均相與固相免疫技術(shù)兩類。其發(fā)展順序可界定為傳統(tǒng)均相與類均相免疫，固相免疫，及其現(xiàn)代均相與類均相免疫等三個(gè)主要階段。各階段發(fā)展過程相互交錯(cuò)，相互推進(jìn)，相互補(bǔ)充，從而構(gòu)成一套完整地免疫血清學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系。新近，傳統(tǒng)均相免疫實(shí)驗(yàn)因其敏感性及其操作上的諸多原因已較少在臨床(及田間)使用；現(xiàn)代均相免疫實(shí)驗(yàn)因其技術(shù)含量過高，以及自身技術(shù)缺陷等原因尚未得以普及；而固相免 疫實(shí)驗(yàn)則成為迄今應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)創(chuàng)建于上世紀(jì)六十年代中后期，它同時(shí)用于固相及均相免疫技術(shù)中，是免疫(血清)學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重大技術(shù)進(jìn)步。既往標(biāo)記固相免疫實(shí)驗(yàn)就其反應(yīng)方式而言包括直接法、間接法、補(bǔ)體法、雙抗體(或雙抗原)夾心法、幾種不同方式的競爭與競爭抑制法，液相PAP技術(shù)，以及多種蛋白芯片技術(shù)等試驗(yàn)形式，具有高度的特異性、敏感性與穩(wěn)定性。操作步驟繁瑣及其定量檢測范圍狹窄是該類方法的主要缺點(diǎn)。自動(dòng)化儀器的發(fā)展及其推廣應(yīng)用使操作繁瑣的缺點(diǎn)從表觀上得以糾正或部分糾正，但其對實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性的影響并未因此而根除?，F(xiàn)代均相(及類均相)免疫技術(shù)的研發(fā)能有效地克服固相免疫檢測操作繁瑣的弊端，并能保持與之相同或更高的特異性，穩(wěn)定性與敏感性，如能克服定量范圍狹窄及其Hooks效應(yīng)干擾等技術(shù)瓶頸，將具有極其廣闊地應(yīng)用前景。現(xiàn)代均相免疫實(shí)驗(yàn)(包括LiCA等類均相免疫試驗(yàn))是一類為簡化固相免疫實(shí)驗(yàn)操作步驟而發(fā)展起來的新的試驗(yàn)方法。具備與固相免疫實(shí)驗(yàn)相當(dāng)或更高的敏感性，特異性與穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)步驟較固相免疫實(shí)驗(yàn)顯著簡單。其定量檢測范圍與部分發(fā)光免疫檢測技術(shù)相當(dāng)(如電化學(xué)發(fā)光)，但仍遠(yuǎn)不足以對多數(shù)免疫物質(zhì)作全定量檢測。Hooks效應(yīng)對其試驗(yàn)結(jié)果的影響較固相法相當(dāng)或略重，且?guī)追N在固相免疫檢測方法中糾正Hooks效應(yīng)的反應(yīng)模式，如二步法，一道洗滌法，及其排溢法等均無法用于均相免疫技術(shù)。這類技術(shù)缺陷嚴(yán)重妨礙了均相免疫技術(shù)的推廣應(yīng)用。如能克服這類弊端，其使用價(jià)值可望顯著大于現(xiàn)行固相免疫檢測。傳統(tǒng)均相與類均相免疫檢測技術(shù)操作相對簡便，可同時(shí)進(jìn)行初步的定性與定量(或半定量)檢測。該類方法敏感性偏低，定量范圍偏向靶物質(zhì)含量的高濃度端，受Hooks效應(yīng)影響程度相對較小等特征既是該類方法的技術(shù)缺陷，亦是它們區(qū)別于前兩類方法的重要特征。近十余年來，由于在材料與方法學(xué)上的進(jìn)步，上述缺陷已部分糾正。“Hooks效應(yīng)”或稱“鉤狀現(xiàn)象”是一種存在于多種血清學(xué)檢測中的量(靶物質(zhì)濃度)效(檢測信號(hào))分離現(xiàn)象，其發(fā)生雖可能與靶物質(zhì)免疫分子的結(jié)構(gòu)相關(guān)，但反應(yīng)體系中靶抗原與對應(yīng)抗體比例的高度失調(diào)是其最主要的原因。其表現(xiàn)為當(dāng)反應(yīng)體系中靶物質(zhì)，包括抗原或抗體的濃度升高到一定程度后，檢測信號(hào)反而下降或顯著下降，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果。隨著標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)在敏感性上的大幅提升，尤其是當(dāng)部分固相免疫實(shí)驗(yàn)主要反應(yīng)方式由傳統(tǒng)的二步法轉(zhuǎn)變?yōu)橐徊椒?如一步法ELISA)，并在我國臨床檢驗(yàn)中大量普及應(yīng)用后，由Hooks效應(yīng)引起的檢驗(yàn)結(jié)果失真便成為一個(gè)較為常見的臨床現(xiàn)象。這一效應(yīng)直接造成檢測結(jié)果的失真，顯著妨礙科研數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，并對臨床診斷、治療及其預(yù)后的判斷造成負(fù)面影響。如果發(fā)生于某些特殊臨床檢測如采用一步法ELISA或化學(xué)發(fā)光技術(shù)進(jìn)行血清HBsAg篩選，則可造成大量臨床標(biāo)本的定量結(jié)果偏離真值，部分強(qiáng)陽性標(biāo)本測值降低或顯著降低，甚至導(dǎo)致個(gè)別具有高度傳染性的強(qiáng)陽性標(biāo)本出現(xiàn)假陰性結(jié)果。如果這種漏檢發(fā)生在獻(xiàn)血員篩選，則勢必導(dǎo)致輸血相關(guān)性肝炎的嚴(yán)重臨床事件。在我國，血清HBsAg檢測的類均相免疫檢測實(shí)驗(yàn)如光激發(fā)化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)(Light Initiated chemiIumiNescence assay. LiCA)方法及其試劑已獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果受Hooks效應(yīng)的影響與一步法ELISA等方法相當(dāng)或更甚，若將其誤用于HBsAg的獻(xiàn)血員篩選，亦有可能產(chǎn)生與其它一步法固相免疫檢測相似的負(fù)面效果。鑒于血清HBsAg檢測的規(guī)模及其社會(huì)影響面極大，一些存在Hooks效應(yīng)干擾的檢測方法(如“一步法” ELISA與“一步法”化學(xué)發(fā)光等)已在我國獻(xiàn)血員HBV感染篩選中被禁止使用。LiCA也在禁用之列。與定性檢測相比，定量檢測是免疫血清學(xué)檢測發(fā)展的高級(jí)階段。為追求這一目標(biāo)，相關(guān)學(xué)者進(jìn)行了長期艱苦努力并取得較好成果。值得注意的是部分優(yōu)化措施在提高方法敏感性的同時(shí)，使這些實(shí)驗(yàn)方法的定量范圍顯著狹窄并被局限在靶物質(zhì)的低濃度端，顯然不能滿足對多數(shù)指標(biāo)的定量分析，尤其是采用高值試劑進(jìn)行的細(xì)胞因子及其時(shí)相蛋白類物質(zhì)的定量研究(通常為科學(xué)研究)，以及一些直接用于治療效果評價(jià)的特殊免疫標(biāo)志物(如血清HBsAg等)的全程定量檢測。這一現(xiàn)象已引起相關(guān)學(xué)者的高度關(guān)注，其糾正方法包括對原有技術(shù)如ELISA等的優(yōu)化，能一定程度提升檢測范圍但偶可傷及方法的敏感性；通過示蹤及其信號(hào)檢測方式的改進(jìn)發(fā)展新的試驗(yàn)方法，如通過建立各類免疫發(fā)光技術(shù)，將消光法檢測改為發(fā)光檢測以顯著拓寬定量范圍等，但其拓展范圍仍舊有限；實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的稀釋或系列稀釋，能定量檢測任意濃度的試驗(yàn)標(biāo)本，但操作過程繁瑣，且需成倍甚至數(shù)倍增加實(shí)驗(yàn)時(shí)間，試劑與器材的消耗。也就是說，為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為全面客觀，研究者不得不付出成倍甚至數(shù)倍的金錢與勞動(dòng)。新近，羅氏公司推出以電化學(xué)發(fā)光為依托的血清HBsAg全程定量檢·測試劑，其方法改進(jìn)同時(shí)涵蓋以上提及的三個(gè)技術(shù)層面，能基本滿足血清HBsAg的全程定量需要，頗受臨床檢驗(yàn)學(xué)者的歡迎。但由于其定量范圍拓展的基點(diǎn)主要立足于標(biāo)本稀釋及重復(fù)檢測，試劑耗費(fèi)成倍增加，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，在技術(shù)上并無特別的進(jìn)步?，F(xiàn)代免疫檢測方法多種技術(shù)特征的達(dá)成有賴于既往研究者對試驗(yàn)條件的長期優(yōu)化，這些優(yōu)化措施在賦予方法高度特異性，敏感性與穩(wěn)定性的同時(shí)，使定量范圍更趨狹窄，且Hooks效應(yīng)干擾亦更為顯著。為糾正這些缺陷所采取的措施又使實(shí)驗(yàn)方法操作相對繁瑣，結(jié)果穩(wěn)定性降低，反應(yīng)時(shí)間延長，及其試劑消耗顯著增加，不宜用作對高濃度與超高濃度標(biāo)本的檢測與定量檢測。因而，在保留現(xiàn)行技術(shù)優(yōu)勢的同時(shí)提升其對高濃度靶物質(zhì)的定量檢測能力便成為當(dāng)今免疫血清學(xué)檢驗(yàn)所面對的重要技術(shù)難題。鑒于近十余年來傳統(tǒng)均相免疫檢測方法的技術(shù)特質(zhì)已有顯著提升，以及他們既往在高濃度樣本檢測中所具有的特殊優(yōu)勢，如能將現(xiàn)代高敏感性檢測技術(shù)(包括經(jīng)改進(jìn)的傳統(tǒng)均相免疫實(shí)驗(yàn))與傳統(tǒng)低敏感性免疫學(xué)技術(shù)同時(shí)加以改造，并使兩者在定量檢測范圍上完美對接，從而建立一個(gè)既能保持現(xiàn)代免疫技術(shù)的特異性，敏感性，穩(wěn)定性與實(shí)驗(yàn)操作的簡潔，又能突破Hooks效應(yīng)干擾與定量范圍狹窄技術(shù)瓶頸的新型實(shí)驗(yàn)方法，即免疫層疊實(shí)驗(yàn)，將其用于對多種免疫物質(zhì)的檢測，有可能將現(xiàn)行免疫血清學(xué)檢測水平提升到一個(gè)前所未有的新高度。由于在糾正Hooks效應(yīng)同時(shí)能拓展定量檢測范圍，這一改進(jìn)措施(即免疫層疊實(shí)驗(yàn))較幾種旨在單純避免Hooks效應(yīng)干擾的免疫反應(yīng)方法，包括二步法，一道洗滌法，以及排溢法等顯然具有更大的競爭潛力。鑒于定量范圍狹窄的問題困擾著幾乎所有的免疫學(xué)檢測指標(biāo)，即便不存在Hooks效應(yīng)干擾的檢測標(biāo)志亦需要應(yīng)用免疫層疊實(shí)驗(yàn)以提升其檢測品質(zhì)。相對檢測試劑而言，受檢標(biāo)本實(shí)際上是一個(gè)更為復(fù)雜得多的生物學(xué)體系。檢測試劑在正常狀態(tài)下有足夠能力在體系中識(shí)別出未發(fā)生免疫反應(yīng)的對應(yīng)靶物質(zhì)。同理，某一檢測試劑與受檢標(biāo)本混合并實(shí)施檢測或免疫反應(yīng)后，作為生物體系的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本盡管在成分上有所增加(增加了試劑體系中的各個(gè)組分)，或在濃度上有所降低(稀釋)，但其生物學(xué)的本質(zhì)并無改變，如未參入干擾實(shí)驗(yàn)的有害物質(zhì)或因素，該體系中未參與免疫反應(yīng)的靶物質(zhì)仍可與隨后加入的對應(yīng)試劑進(jìn)行免疫反應(yīng)(后續(xù)免疫反應(yīng))，包括實(shí)施與前期相同或不同的檢 測反應(yīng)，從而形成，或再次形成可供觀察的實(shí)驗(yàn)信號(hào)。這一特征是實(shí)施免疫層疊實(shí)驗(yàn)的物質(zhì)條件。根據(jù)這一理念，在兩類試劑互不干擾的前提下，當(dāng)某一實(shí)驗(yàn)(基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn))完成后，可通過新試劑的加入立即在原位(或易位)進(jìn)行另一輪新的免疫實(shí)驗(yàn)(疊加實(shí)驗(yàn))反應(yīng)。由于取消樣本準(zhǔn)備與加樣等繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作，新的實(shí)驗(yàn)方法能在保留基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與疊加實(shí)驗(yàn)兩者多種高技術(shù)特征的同時(shí)，仍舊保持實(shí)驗(yàn)操作的簡潔與相對簡潔。從而極大提升這一新實(shí)驗(yàn)體系的應(yīng)用前景。同上理由推導(dǎo)，在免疫反應(yīng)中，部分參與免疫反應(yīng)但其結(jié)合位點(diǎn)并未為對應(yīng)免疫物質(zhì)所飽和的靶物質(zhì)仍舊可以參與隨后的抗原抗體反應(yīng)，這類反應(yīng)亦有助于二次反應(yīng)中實(shí)驗(yàn)信號(hào)的形成，而為抗原附著的固相物質(zhì)(如納米微球及某些標(biāo)記物等)的被動(dòng)參與則有助于對反應(yīng)信號(hào)的強(qiáng)化或提升。免疫層疊實(shí)驗(yàn)由基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與疊加實(shí)驗(yàn)所組成，實(shí)驗(yàn)方法的選擇是建立該方法的首要步驟。基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的選擇主要考慮實(shí)驗(yàn)方法的反應(yīng)方式，技術(shù)先進(jìn)性，以及特異性、敏感性與穩(wěn)定性等技術(shù)特征；疊加實(shí)驗(yàn)的選擇在考慮方法特異性與穩(wěn)定性的同時(shí)，主要考慮方法的簡便性，以及在敏感性與檢測范圍上與基礎(chǔ)方法的銜接。鑒于當(dāng)前用于免疫血清學(xué)檢測的實(shí)驗(yàn)方法在自然狀態(tài)下能達(dá)成完美對接者不多，因而在多數(shù)情況下需要對現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方法在敏感性與定量范圍上做出精細(xì)的調(diào)整。這種調(diào)整對基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)而言需要在保證足夠敏感性的前提下盡量拓展定量檢測范圍，而對疊加實(shí)驗(yàn)而言則需要調(diào)整(包括提升與鈍化)自身的敏感性，以確保其定量范圍與基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)?zāi)苡行У劂暯?。鑒于當(dāng)前供選擇的實(shí)驗(yàn)方法較多，多數(shù)實(shí)驗(yàn)在敏感性的提升研究上均經(jīng)過艱苦努力并取得經(jīng)驗(yàn)，因而當(dāng)選定適宜的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法后，在一定程度上調(diào)節(jié)疊加實(shí)驗(yàn)的敏感性不應(yīng)該存在過大的技術(shù)困難。免疫層疊實(shí)驗(yàn)的建立尚應(yīng)考慮以下因素。即依托與疊加反應(yīng)應(yīng)盡可能在同一空間(或試驗(yàn)位點(diǎn)如反應(yīng)孔)進(jìn)行，即在原位與換位反應(yīng)中優(yōu)先選擇前者；同理，在信號(hào)檢測上也應(yīng)該優(yōu)先考慮實(shí)驗(yàn)反應(yīng)與信號(hào)檢測在同一實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行而摒棄需要將樣品遷移的換位測定；此外，盡管從理論上講免疫層疊實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)嵤┒鄬盈B加，但此舉僅是在特殊場合下應(yīng)對某些因基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)定量檢測范圍過窄及靶物質(zhì)表達(dá)范圍過寬，一步疊加實(shí)驗(yàn)不能實(shí)施全定量檢測的特殊試驗(yàn)場合。即便是在這種情況下，我們?nèi)耘f寧愿選擇對試驗(yàn)方法與試劑(尤其是抗He試劑)的改進(jìn)，甚至是試驗(yàn)標(biāo)本稀釋等措施。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有原組合方法的多種技術(shù)特征，能同時(shí)用于抗原及抗體等免疫物質(zhì)的檢測，能拮抗Hooks效應(yīng)干擾，并能極大拓寬靶物質(zhì)定量檢測范圍的利用免疫層疊法進(jìn)行可溶性靶物質(zhì)檢測的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的利用免疫層疊法進(jìn) 行可溶性靶物質(zhì)的檢測方法，其特征在于它包括如下步驟(I)向血清中加入實(shí)驗(yàn)試劑進(jìn)行基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)，所述基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)為免疫層疊實(shí)驗(yàn)的第一次免疫反應(yīng)，所述實(shí)驗(yàn)試劑為基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)試劑，所述基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)為放射免疫實(shí)驗(yàn)、高敏感性乳膠凝集試驗(yàn)、固相酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光免疫實(shí)驗(yàn)、電化學(xué)發(fā)光免疫實(shí)驗(yàn)、時(shí)間分辨免疫熒光實(shí)驗(yàn)或光激發(fā)化學(xué)發(fā)光類免疫實(shí)驗(yàn)之中任一種實(shí)驗(yàn)；(2)對步驟I試驗(yàn)過程中所產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)信號(hào)進(jìn)行檢測，檢測出的實(shí)驗(yàn)信號(hào)依據(jù)靶物質(zhì)濃度與實(shí)驗(yàn)信號(hào)的函數(shù)關(guān)系，確定低濃度段靶物質(zhì)含量，所述低濃度段為基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)檢測所取得的定量范圍(3)在步驟(I)結(jié)束后，通過向弟一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試齊U，進(jìn)行至少一次的疊加免疫實(shí)驗(yàn)；抗He試劑為溶解于水中的能與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的抗體或抗原，所述抗體或抗原游離于水中或吸附在懸浮于水中的固相載體上，抗He試劑中抗體濃度為O. 05 1000 Kg/ml,或抗原濃度為O. 01 500 Kg/ml,加入抗He試劑體積與基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)體系的體積比例為I :1 20 ;(4)對步驟3實(shí)驗(yàn)過程中所產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)信號(hào)進(jìn)行檢測，檢測出的實(shí)驗(yàn)信號(hào)依據(jù)靶物質(zhì)濃度與實(shí)驗(yàn)信號(hào)的函數(shù)關(guān)系，確定高濃度段靶物質(zhì)含量；所述高濃度段為疊加免疫實(shí)驗(yàn)檢測所取得的能夠定量的檢測范圍(5)取基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)?zāi)芫_反應(yīng)靶物質(zhì)濃度的上限值為疊加免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果靶物質(zhì)濃度取值的下限值，將疊加免疫實(shí)驗(yàn)的下限值以上部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)上限值以下部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行交匯疊加；形成新的靶物質(zhì)含量與實(shí)驗(yàn)信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系，并據(jù)此計(jì)算待測標(biāo)本中的靶物質(zhì)濃度。作為優(yōu)選方案，所述步驟(I)中的實(shí)驗(yàn)試劑為包被有anti-HBs的發(fā)光微球、生物素化的anti-HBs和包被鏈親和素的感光微球；所述步驟(3)中抗He試劑的抗體為抗HBs ；所述步驟(3)中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min，所述的抗He試劑中抗HBs濃度為100 750 Pg/ml，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與一次免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :5 20。作為優(yōu)選方案，所述步驟(I)中的實(shí)驗(yàn)試劑為包被有anti-HBe的發(fā)光微球、生物素化的anti-HBe和包被鏈親和素的感光微球；所述步驟(3)中抗He試劑的主要免疫反應(yīng)物質(zhì)為抗HBe致敏的乳膠溶液；所述步驟(3)中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min，所述的抗He試劑中抗HBe標(biāo)記乳膠的質(zhì)量濃度為O. 5 2. 0%，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與基礎(chǔ)免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :5 20。作為優(yōu)選方案，所述步驟(I)中的實(shí)驗(yàn)試劑為抗人IgE抗體包被微孔板條、銪標(biāo)記抗-hlgE、洗滌液和發(fā)光促進(jìn)劑；所述步驟(3)中抗He試劑的主要免疫反應(yīng)物質(zhì)為抗人IgE致敏乳膠；所述步驟(3)中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min，所述的抗He試劑中抗人IgE標(biāo)記乳膠的質(zhì)量濃度為
O.I I. 0%，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與基礎(chǔ)免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :I 10。作為優(yōu)選方案，所述步驟(I)中的實(shí)驗(yàn)試劑為包被有anti-IL-6的酶標(biāo)反應(yīng)板、酶標(biāo)記anti-IL6、洗滌液、底物A及B，分別含TMB與H2O2和固定劑；所述步驟(3)中抗He試劑的主要免疫反應(yīng)物質(zhì)為抗人IL-6致敏乳膠；所述步驟(3)中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min,所述的抗He試劑中抗IL-6標(biāo)記乳膠的質(zhì)量濃度為O. I I. 0%，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與 基礎(chǔ)免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :1 10。作為優(yōu)選方案，述步驟(I)中的實(shí)驗(yàn)試劑為HBsAg包被酶標(biāo)反應(yīng)板、HRP酶標(biāo)記HBsAg、洗滌液和含發(fā)光促進(jìn)劑的發(fā)光底物；所述步驟(3)中抗He試劑的主要免疫反應(yīng)物質(zhì)為HBsAg致敏乳膠；所述步驟(3)中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min，所述的抗He試劑中HBsAg標(biāo)記乳膠的質(zhì)量濃度為O. I I. 0%，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與基礎(chǔ)免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :1 10。作為優(yōu)選方案，所述步驟(I)中的實(shí)驗(yàn)試劑為生物素化的anti-AFP、三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記anti-AFP、含發(fā)光促進(jìn)劑的鏈親和素標(biāo)記磁性微球、洗滌液和發(fā)光促進(jìn)劑；所述步驟
(3)中抗He試劑的主要免疫反應(yīng)物質(zhì)為抗人AFP抗體；所述步驟(3)中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min，所述的抗He試劑中抗人AFP的濃度為50 25(^g/ml，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與基礎(chǔ)免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :1 10。上述的方法在血清HBsAg、血清總IgE、血清人白細(xì)胞介素_6、血清抗HBs或血清AFP定性和定量檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明中(I)基礎(chǔ)試驗(yàn)是免疫層疊實(shí)驗(yàn)的主要技術(shù)依托，又稱依托免疫實(shí)驗(yàn)。通過此實(shí)驗(yàn)過程決定方法的特異性與敏感性。(2)疊加實(shí)驗(yàn)是免疫層疊實(shí)驗(yàn)的重要組成部分，反應(yīng)體系內(nèi)物質(zhì)包括基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)后孔(管)內(nèi)全部物質(zhì)，以及隨后加入的抗e試劑；反應(yīng)過程為兩者混合及其隨后的短時(shí)免疫反應(yīng)。此實(shí)驗(yàn)過程的介入可提高整體實(shí)驗(yàn)方法(專利方法)對Hooks效應(yīng)的拮抗能力，并顯著拓展定量檢測范圍。疊加實(shí)驗(yàn)包括多種不同的實(shí)驗(yàn)方法，其技術(shù)特征亦隨疊加實(shí)驗(yàn)的不同而異。(3)抗e試劑的主要成分為能與靶物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，并能間接或直接產(chǎn)生可檢測信號(hào)的實(shí)驗(yàn)材料。它是實(shí)施免疫疊加反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。(4)標(biāo)準(zhǔn)品的主要成分為能與靶物質(zhì)特異性結(jié)合，并能間接或直接產(chǎn)生可檢測信號(hào)的實(shí)驗(yàn)材料。該標(biāo)準(zhǔn)品溶解于與實(shí)驗(yàn)標(biāo)本類似的反應(yīng)體系中，由高低兩個(gè)系列組成，分別用于基礎(chǔ)與疊加實(shí)驗(yàn)，是實(shí)施免疫層疊反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。此兩系列中標(biāo)準(zhǔn)品樣本設(shè)定的數(shù)量及其濃度須滿足基礎(chǔ)與疊加實(shí)驗(yàn)對靶物質(zhì)定量的客觀要求。為增加實(shí)驗(yàn)試劑的利用效率，用于對疊加實(shí)驗(yàn)結(jié)果作定量分析的高濃度標(biāo)準(zhǔn)血清系列在基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)階段不必加到反應(yīng)板中。在基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)束后再根據(jù)濃度的不同依序加至對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)孔中作疊加實(shí)驗(yàn)。由此造成的誤差可以忽略或通過計(jì)算進(jìn)行校正。(5)定量方式與結(jié)果計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算采用函數(shù)法，由于全程(亞全程)定量涉及被檢測物質(zhì)的濃度變化范圍過寬，因而其標(biāo)準(zhǔn)品以兩個(gè)或兩個(gè)以上系列方式提供，結(jié)果的計(jì)算亦分兩個(gè)或以上階段，如基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，疊加實(shí)驗(yàn)階段等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最后形成需結(jié)合不同階段數(shù)據(jù)得出。用于免疫層疊技術(shù)中的實(shí)驗(yàn)過程及控制，實(shí)驗(yàn)試劑、耗材，實(shí)驗(yàn)儀器，以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理(計(jì)算)的軟硬件設(shè)施等均存在極大的研發(fā)空間，這些研發(fā)的完成應(yīng)包含在本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。 下列幾項(xiàng)為免疫層疊實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本概念①免疫層疊技術(shù)本發(fā)明中所指的“免疫層疊技術(shù)“是指將一種以上免疫方法有機(jī)結(jié)合在一起，用于對某一靶物質(zhì)進(jìn)行檢測，所形成的新的實(shí)驗(yàn)方法能保留原始方法的主要優(yōu)點(diǎn)，并能獲得一些原始方法所不具備的新特征。在本發(fā)明的描述中，“絮狀免疫凝集-LiCA”實(shí)驗(yàn)是免疫層疊技術(shù)的重要分支；血清HBsAg檢測全定量“絮狀免疫凝集-LiCA實(shí)驗(yàn)是“絮狀免疫凝集-LiCA”方法系統(tǒng)中具有代表性的實(shí)驗(yàn)方法，同時(shí)是為闡述本發(fā)明所采用的“優(yōu)選方案”。②基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)本發(fā)明中所指的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，是指建立“免疫層疊技術(shù)”所依托主要實(shí)驗(yàn)方法。該方法通常指現(xiàn)行流通的具有高度敏感性，特異性與穩(wěn)定性，且其操作相對簡便的免疫血清學(xué)檢測方法，能為免疫層疊實(shí)驗(yàn)提供最基本的技術(shù)保障。③疊加實(shí)驗(yàn)本發(fā)明中所指的疊加實(shí)驗(yàn)，是指建立“免疫層疊技術(shù)”所依托的主要實(shí)驗(yàn)方法之一，可為一重或數(shù)重迭加。該方法具有特異，穩(wěn)定，及其操作簡便等特點(diǎn)，但其敏感性較現(xiàn)行多數(shù)免疫血清學(xué)檢測方法為低，且具有較高的可調(diào)節(jié)性。用于構(gòu)建免疫層疊實(shí)驗(yàn)，能為糾正Hooks效應(yīng)影響，并拓寬定量檢測范圍提供技術(shù)方向；④優(yōu)選方案本發(fā)明內(nèi)容中所指優(yōu)選方案系指為更清楚地闡述本發(fā)明的核心觀點(diǎn)而采用的一種應(yīng)用方法舉例。具體是指血清HBsAg檢測絮狀免疫凝集-LiCA。應(yīng)用該優(yōu)選方案作為方法舉例能更為清楚地闡述“免疫層疊技術(shù)”的發(fā)明點(diǎn)，基本原理、實(shí)驗(yàn)操作及其具體應(yīng)用，以及專利方法所具有的先進(jìn)性、實(shí)用性、代表性及其易轉(zhuǎn)化性等諸多特點(diǎn)。⑤顯性實(shí)驗(yàn)操作本發(fā)明中所描述的顯性實(shí)驗(yàn)操作，系指不能為實(shí)驗(yàn)儀器所完全取代，或雖可為實(shí)驗(yàn)儀器取代但對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響無法消除的實(shí)驗(yàn)操作。⑥假陰性本發(fā)明中所描述的假陰性，專指因待測靶物質(zhì)濃度過高，在反應(yīng)體系中形成對對應(yīng)檢測系統(tǒng)的飽和結(jié)合并阻止可檢測信號(hào)的產(chǎn)生而導(dǎo)致的一種假陰性檢測結(jié)果;⑦全程定量檢測本發(fā)明中所描述的全程定量，系指通過單一實(shí)驗(yàn)對標(biāo)本中自然表達(dá)的任意濃度靶物質(zhì)含量進(jìn)行定量檢測。這是一個(gè)相對的技術(shù)概念。在現(xiàn)有技術(shù)條件下，尚無一個(gè)免疫血清學(xué)方法能做到全程定量檢測。新近，羅氏公司推出血清HBsAg電化學(xué)發(fā)光全程定量檢測，其最高檢測濃度可達(dá)500 000ng/ml或以上，應(yīng)該認(rèn)為達(dá)到全程或亞全程定量。然該法以標(biāo)本的稀釋或系列稀釋及其重復(fù)實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，在技術(shù)上不具備實(shí)質(zhì)性的創(chuàng)新。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供了一種“免疫層疊法”免疫血清學(xué)實(shí)驗(yàn)方法體系及其在可溶性抗原(或抗體)檢測中的應(yīng)用，并通過對“優(yōu)選方案”的介紹對其進(jìn)行細(xì)致說明。其特殊之處在于I.創(chuàng)新性強(qiáng)在確?，F(xiàn)有基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)方法多種優(yōu)良技術(shù)特征的前提下，能克服現(xiàn)有免疫血清學(xué)技術(shù)受Hooks效應(yīng)干擾及其定量檢測范圍狹窄等兩項(xiàng)長期阻礙發(fā)展的技術(shù)瓶頸，使那些濃度變異范圍大或超大，檢測精度要求高，不同濃度表達(dá)分別具有不同生物學(xué)意義的靶物質(zhì)的全程定量檢測得以實(shí)施，具有高度的原始創(chuàng)新性與廣泛地實(shí)用性。
2.實(shí)驗(yàn)技術(shù)先進(jìn)該實(shí)驗(yàn)體系能把握當(dāng)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，有選擇性地選用當(dāng)前最先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)為依托，并能保留它們在敏感性，特異性，穩(wěn)定性，及其操作簡捷性等方面的諸多技術(shù)特征，不排斥這些技術(shù)可能出現(xiàn)的新改進(jìn)與新發(fā)展，并能接受不斷出現(xiàn)的新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法。其先進(jìn)程度始終與當(dāng)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展并駕齊驅(qū)；3.涉及面廣就實(shí)驗(yàn)技術(shù)而言，它在理論上能涉及當(dāng)代可用于可溶性抗原抗體檢測的一切新舊技術(shù)。重點(diǎn)包括幾種現(xiàn)代最優(yōu)秀的免疫血清學(xué)試驗(yàn)(基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn))，以及幾種檢測敏感性偏低但具備高度可塑性的實(shí)驗(yàn)方法或方法系統(tǒng)。就檢測對象而言，涵蓋所有的抗原，半抗原與相應(yīng)的抗體，及其以抗原抗體反應(yīng)(包括配受體反應(yīng))為手段進(jìn)行檢測的其它物質(zhì)；就應(yīng)用領(lǐng)域而言以生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?yàn)榛c(diǎn)，向外發(fā)散至全部的基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)生物學(xué)整體，以及需要涉及抗原抗體反應(yīng)或者與之類似反應(yīng)的研究與應(yīng)用領(lǐng)域。4.技術(shù)發(fā)展空間廣闊該項(xiàng)專利在實(shí)驗(yàn)方法上的成功證明了其所推行技術(shù)在理論上的正確性，其進(jìn)一步的推廣應(yīng)用將涉及多種實(shí)驗(yàn)方法在儀器，試劑及其實(shí)驗(yàn)材料上的多方面改進(jìn)，并引發(fā)上述領(lǐng)域中一系列發(fā)現(xiàn)，發(fā)明及其創(chuàng)新，這種全面而系統(tǒng)的創(chuàng)新機(jī)遇將為我國相關(guān)學(xué)科跨越式發(fā)展提供良好的契機(jī)。而以本發(fā)明技術(shù)為導(dǎo)向開展系統(tǒng)扎實(shí)的技術(shù)研究，可望將國內(nèi)外免疫血清學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平推向一個(gè)新的高度。絮狀免疫沉淀-LiCA (優(yōu)選方法)是在LiCA (—種現(xiàn)代類均相免疫實(shí)驗(yàn))的基礎(chǔ)上引入絮狀免疫凝集試驗(yàn)(傳統(tǒng)均相免疫檢測實(shí)驗(yàn))，所建立的“免疫層疊實(shí)驗(yàn)”能同時(shí)用于多種血清抗原或抗體檢測。血清HBsAg全程定量檢測絮狀免疫凝集-LiCA是這一技術(shù)系列的代表方法之一。這一方法既具有LiCA的高度敏感性、特異性與穩(wěn)定性，又能保留其操作簡捷等優(yōu)點(diǎn)，并能克服LiCA的Hooks效應(yīng)干擾及其定量檢測范圍狹窄的技術(shù)瓶頸。這一反應(yīng)方式不僅用于普通免疫物質(zhì)的定性與定量分析，尤其適宜對精度要求高，濃度變異范圍大或超大的靶物質(zhì)進(jìn)行全程定量檢測。該方法承載了“免疫層疊技術(shù)”的主要優(yōu)點(diǎn)，具有高度的實(shí)用性。


圖I是本發(fā)明基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)(LiCA)檢測血清HBsAg與光子數(shù)量之間的的量效關(guān)系O其中X軸HBsAg濃度(2nng/ml) ;Y軸光子數(shù)。圖2是本發(fā)明疊加實(shí)驗(yàn)(絮狀免疫凝集)檢測血清HBsAg含量與檢測信號(hào)之間的劑量相關(guān)性。其中Χ 軸:HBsAg 濃度(2lg/ml) ;Y 軸消光度(A45Q)。圖3是本發(fā)明血清HBsAg絮狀免疫凝集-LiCA檢測及其與羅氏電化學(xué)發(fā)光(稀釋法)全定量檢測試驗(yàn)的比較。其中-X軸羅氏公司檢測濃度，Y軸本發(fā)明方法檢測濃度。濃度均為ng/ml。 圖4是本發(fā)明血清HBeAg基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)(LiCA)檢測信號(hào)強(qiáng)度與靶抗原濃度之間的量效關(guān)系。其中X軸HBeAg濃度(2n ng/ml) ;Y軸光子數(shù)。圖5是本發(fā)明疊加實(shí)驗(yàn)(乳膠免疫凝集)檢測血清HBeAg含量與檢測信號(hào)之間的劑量相關(guān)性。其中Χ軸:HBeAg 濃度(2lg/ml) ;Y 軸:消光度(A45tl)；圖6是本發(fā)明基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)(時(shí)間分辨免疫實(shí)驗(yàn))檢測人血清總IgE含量與檢測信號(hào)之間的劑量相關(guān)性。其中Χ軸hIgE濃度(2n ng/ml) ;Y軸發(fā)光系數(shù)值；圖7是本發(fā)明疊加免疫實(shí)驗(yàn)(絮狀免疫凝集)檢測人血清總IgE含量與檢測信號(hào)之間的劑量相關(guān)性。其中Χ軸:hIgE 濃度(2lg/ml) ;Y 軸消光度(Α45。)。圖8是本發(fā)明血清IL-6檢測基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)(ELISA)信號(hào)與靶物質(zhì)濃度之間的劑
量關(guān)系。其中Χ軸:人 IL-6 濃度(2nfg /ml) ;Y 軸消光度(A45Q)。圖9是本發(fā)明血清IL-6檢測疊加實(shí)驗(yàn)(乳膠凝集試驗(yàn))信號(hào)與靶物質(zhì)濃度間的劑
量關(guān)系。其中X軸人 IL-6 濃度(2nng/ml) ;Y 軸消光度(A45Q)。圖10是本發(fā)明血清抗HBs檢測基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)(ELISA)信號(hào)與靶物質(zhì)濃度之間的劑量關(guān)系。其中X軸抗 HBs 濃度(2n mIU/ml) ;Y 軸消光度(A45tl)。其中Χ 軸50· O IU/mlX2el-2el2 ;Y 軸Α450圖11是本發(fā)明血清抗HBs檢測疊加實(shí)驗(yàn)(乳膠凝集試驗(yàn))信號(hào)與靶物質(zhì)濃度之間的劑量關(guān)系。其中Χ軸-M HBs 濃度(2n IU/ml) ；Y 軸消光度(Α450)。圖12是本發(fā)明基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)(電化學(xué)發(fā)光)檢測血清AFP濃度與檢測信號(hào)之間的量效關(guān)系。其中Χ軸:AFP濃度(2n ng/ml) ;Y軸發(fā)光系數(shù)值；圖13是本發(fā)明疊加實(shí)驗(yàn)(絮狀免疫凝集)檢測血清AFP含量與檢測信號(hào)之間的劑量相關(guān)性。
其中X軸AFP 濃度(2n Pg/ml) ；Y 軸消光度(Α45。)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。實(shí)施例I 血清HBsAg檢測絮狀免疫凝集-LiCA一.方法構(gòu)建基礎(chǔ)方法光激發(fā)化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)(Lightinitiated chemi I luminescenceassay, LiCA)；層疊方法絮狀免疫凝集試(Flocculentimmune agglutination test, FIAT)
定量范圍1.0-1 000 000 ng/ml。Hooks效應(yīng)拮抗完全拮抗。二.實(shí)驗(yàn)材料I、儀器與耗材LiCA發(fā)光檢測體統(tǒng)=LiCA TH高通量均相發(fā)光免疫分析儀酶標(biāo)比色儀ThermoLabsystems Multiskan MK32 酶標(biāo)儀LiCA反應(yīng)板 96 孔2 試劑LiCA HBsAg檢測試劑由中國上海博陽生物技術(shù)公司生產(chǎn)，市售獲得。包括試劑I :包被有anti-HBs的發(fā)光微球，試劑2 :生物素化的anti-HBs。試劑3 :包被鏈親和素(SA)的感光微球。抗He (抗Hooks效應(yīng)試劑)，自制,專利試劑,主要成分為抗HBs ;標(biāo)準(zhǔn)品窄幅標(biāo)準(zhǔn)血清LICA試劑盒隨帶寬幅標(biāo)準(zhǔn)血清自制(暫)，專利制品；陰性對照與陽性對照血清自制或市售試劑配備；用于域值確認(rèn)，以及試劑的反應(yīng)性評價(jià)；待檢標(biāo)本血清(血漿或其它體液)。其它(略)三.實(shí)驗(yàn)方法以下各步驟中反應(yīng)條件為第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min，所述的抗He試劑中抗HBs濃度為100 750Kg/ml，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與一次免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :5 20，以下為優(yōu)選的條件I.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備取出所有試劑與標(biāo)本，按需調(diào)整至工作(或準(zhǔn)工作)濃度；并復(fù)溫至室溫。2.實(shí)驗(yàn)操作I)取待測標(biāo)本，陰、陽性對照，及其HBsAg定量標(biāo)準(zhǔn)血清系列各25ul，分別加至LiCA板各反應(yīng)孔中，每份標(biāo)本加一孔(或根據(jù)需要的任意孔)；2)加入試劑I，每一實(shí)驗(yàn)孔加入各25 μι。3)旋即加入試劑2，每一實(shí)驗(yàn)孔加入各25 μ ?；靹?，37°C溫育15 min ；
4)加入試劑3，每一實(shí)驗(yàn)孔各加入175 μ ?；靹?，37°C溫育15 min ；5)置LiCA發(fā)光檢測儀上，680 nm激發(fā)，610nm波長檢測各孔實(shí)驗(yàn)信號(hào)并計(jì)算各孔靶物質(zhì)的濃度。6)置酶標(biāo)比色儀上，450 mn透射法比濁測定并記錄各孔本底吸收；7)每一實(shí)驗(yàn)孔加入抗He溶液各25 μ ?；靹?，37°C溫育15min ;8)置酶標(biāo)比色儀上，透射法比濁，檢測各孔實(shí)驗(yàn)信號(hào)(OD)，經(jīng)空白校正后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品各孔(管)信號(hào)計(jì)算各孔靶物質(zhì)的濃度；9)綜合上述兩步檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合報(bào)道待測標(biāo)本的靶物質(zhì)濃度。四.應(yīng)用效果
采用本發(fā)明方法之實(shí)施例I對一組低濃度實(shí)驗(yàn)標(biāo)本(系列稀釋的參比血清)進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表I及圖I。基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)(LiCA)的信號(hào)強(qiáng)度與血清HBsAg濃度之間均有很好地劑量相關(guān)關(guān)系。表I血清HBsAg絮狀免疫凝集-LiCA實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)(LiCA)檢測結(jié)果。
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103 TB HM-il I；-x錄& =；； ；S*:祀抗原濃度設(shè)定值。采用本發(fā)明方法之實(shí)施例I對中高濃度試驗(yàn)標(biāo)本(系列稀釋的參比血清)進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2及圖2。疊加實(shí)驗(yàn)(乳膠凝集試驗(yàn))的信號(hào)強(qiáng)度與血清HBsAg濃度之間有很好地劑量相關(guān)關(guān)系。表2血清HBsAg絮狀免疫凝集-LiCA疊加實(shí)驗(yàn)(絮狀免疫凝集)檢測結(jié)果。
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A，. j- " g -.4: - SI ' i“ 155 : LU -； - -; -1* :最高濃度孔出現(xiàn)顯然的比色誤差；** :靶抗原濃度設(shè)定值采用本發(fā)明方法(絮狀免疫凝集-LiCA)對一組血清HBsAg陽性標(biāo)本進(jìn)行檢測，并與美國羅氏電化學(xué)發(fā)光稀釋法全程定量檢測試劑進(jìn)行比較，兩者比較結(jié)果見圖3。X軸為羅氏公司檢測濃度，Y軸為本發(fā)明方法檢測濃度。五·實(shí)施效果評價(jià)(說明)采用本發(fā)明方法進(jìn)行血清HBsAg檢測，圓滿達(dá)成預(yù)定的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)。主要技術(shù)特征如下。I.依托方法與疊加方法兩者其信號(hào)形成的強(qiáng)度與HBsAg濃度之間具有很好的劑
量相關(guān)性。
2. LiCA為當(dāng)前用于血清HBsAg檢測最先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)方法之一。具有很好的特異性，敏感性與穩(wěn)定性，操作簡便是其最重要的技術(shù)特征。將其用于本發(fā)明方法(免疫疊層實(shí)驗(yàn))，由于全盤保留LiCA的實(shí)驗(yàn)試劑與操作，能使上述主要技術(shù)特征得以完整保留，因而使本發(fā)明技術(shù)在對低濃度實(shí)驗(yàn)樣本的檢測時(shí)獲得與LiCA完全一致的敏感性，特異性與穩(wěn)定性。3.絮狀免疫凝集試驗(yàn)操作簡單，特異性高，其實(shí)驗(yàn)過程，信號(hào)采集方式，以及多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的設(shè)定均具有較大的可塑性。有目的地對這些條件進(jìn)行優(yōu)化，能在保障操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定等技術(shù)特征的前提下，使實(shí)驗(yàn)方法的敏感性及其定量檢測范圍在一定范圍內(nèi)得到調(diào)節(jié)。專項(xiàng)檢測儀器的開發(fā)與應(yīng)用將顯著提升疊加實(shí)驗(yàn)的信號(hào)采集效果。具有很大的發(fā)展空間。4.采用基礎(chǔ)方法(LiCA)進(jìn)行血清HBsAg檢測，其靶物質(zhì)最高可定量濃度可達(dá)到甚至超過1000 ng/ml ;而疊加方法(絮狀免疫沉淀試驗(yàn))的定量檢測下限值，即便采用透射終點(diǎn)法，亦可達(dá)到2000ng/ml以下。即使不作任何調(diào)整，兩者計(jì)量區(qū)間在自然狀態(tài)下即可達(dá)成對接(見圖I及2)。調(diào)整試劑制備并采用專門研發(fā)檢測儀器能顯著提升信號(hào)采集，尤其是 疊加實(shí)驗(yàn)信號(hào)采集的效果，將進(jìn)一步提升兩者定量區(qū)間的對接質(zhì)量。這一特征為本試驗(yàn)的成立奠定基礎(chǔ)。5.圖2結(jié)果顯示，采用透射終點(diǎn)法檢測，當(dāng)靶物質(zhì)濃度上升至2. 048X IO6 ng/ml(即2. 048 mg/ml)時(shí)，其檢測信號(hào)與靶物質(zhì)濃度之間仍舊保有較好的劑量相關(guān)性。提示，采用此法檢測，其定量范圍可延生至2. 048X IO6 ng/ml或以上，不僅能完全消除LiCA試驗(yàn)因Hooks效應(yīng)所致的假陰性，同時(shí)大大拓展了 LiCA的定量檢測范圍。6.方法的“有機(jī)疊加”是指通過將基礎(chǔ)方法與疊加方法限制在同一實(shí)驗(yàn)容器中進(jìn)行，并共用同一次加入的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，這一設(shè)定可使實(shí)驗(yàn)操作簡化，僅增加一步顯性操作便能達(dá)成本發(fā)明所設(shè)定的全部實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)。鑒于操作簡便是LiCA的主要特點(diǎn)，即便增加抗He加入步驟，所形成的專利方法亦較現(xiàn)有多種固相免疫檢測技術(shù)簡捷。然而，為實(shí)現(xiàn)這種完全的“有機(jī)疊加”需要保證并提升所依托方法的試劑品質(zhì)，并可能對現(xiàn)行試劑，儀器甚至實(shí)驗(yàn)耗材進(jìn)行較大幅度的改造。在達(dá)成上述改進(jìn)之前，試驗(yàn)結(jié)果的分析與報(bào)告(制作)不得不采用手工操作。7.綜上所述，本發(fā)明方法舉例的特點(diǎn)為，其一，能獲得與現(xiàn)行檢測方法相似或更加優(yōu)良的技術(shù)特征，包括與LiCA同等的特異性敏感性與穩(wěn)定性，以及雖較LiCA法略增加但仍較現(xiàn)行固相免疫檢測實(shí)驗(yàn)顯著簡潔的實(shí)驗(yàn)操作；其二，能突破現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方法在技術(shù)發(fā)展上的瓶頸。包括完全糾正LiCA在檢測中Hooks效應(yīng)的干擾，以及顯著拓展其靶物質(zhì)定量檢測的范圍等。具有很強(qiáng)的原始創(chuàng)新性與實(shí)用性。實(shí)施例2血清HBeAg檢測乳膠免疫凝集-LiCA一.方法構(gòu)建基礎(chǔ)方法光激發(fā)化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)(Lightinitiated chemi I luminescenceassay, LiCA)；層疊方法乳膠免疫凝集試驗(yàn)(LatexImmune agglutination test, LIAT)；定量范圍1·0-100 000ng/ml。Hooks效應(yīng)拮抗完全拮抗二.實(shí)驗(yàn)材料
I、儀器與耗材LiCA發(fā)光檢測體統(tǒng)=LiCA TH高通量均相發(fā)光免疫分析儀；酶標(biāo)比色儀ThermoLabsystems Multiskan MK32 酶標(biāo)儀酶標(biāo)反應(yīng)板96孔；2.試劑LiCA HBsAg檢測試劑由中國上海博陽生物技術(shù)公司生產(chǎn)，市售獲得。包括試劑I :包被有anti-HBe的發(fā)光微球； 試劑2 :生物素化的anti-HBe ；試劑3 :包被鏈親和素(SA)的感光微球；抗He (抗Hooks效應(yīng)試劑)，自制,專利試劑,主要成分為抗HBe致敏的乳膠溶液；標(biāo)準(zhǔn)品窄幅標(biāo)準(zhǔn)血清LiCA試劑盒隨帶；寬幅標(biāo)準(zhǔn)血清自制，專利制品；陰性對照與陽性對照血清自制或市售試劑配備；用于域值確認(rèn)，以及試劑的反應(yīng)性評價(jià)；待檢標(biāo)本血清(血漿或其它體液)。其它(略)三.試驗(yàn)操作I.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備(I)取出所有試劑與標(biāo)本，按需調(diào)整至工作(或準(zhǔn)工作)濃度；并復(fù)溫至接近室溫水平。(2)按需取試劑2及試劑3各等體積，混勻，室溫放置20分鐘；2.實(shí)驗(yàn)操作以下各步驟中的反應(yīng)條件為中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min，所述的抗He試劑中抗HBe標(biāo)記乳膠的質(zhì)量濃度為O. 5 2. 0%，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與基礎(chǔ)免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :5 20，以下為優(yōu)選的條件I)取待測標(biāo)本，陰、陽性對照,及HBeAg定量標(biāo)準(zhǔn)血清系列各50 μ ，分別加至LiCA板各反應(yīng)孔中，每份標(biāo)本加一孔(或根據(jù)需要的任意孔)，2)加入試劑I,每一反應(yīng)孔加入各50 μ ；3)旋即加入試劑2，3混合液，每一反應(yīng)孔加入各150 μ ，混勻，溫育15分鐘以完成免疫反應(yīng)；4)置LiCA發(fā)光檢測儀上，680 nm波長激發(fā)，610nm波長檢測各孔測試信號(hào)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并初步評價(jià)檢測標(biāo)本的信號(hào)強(qiáng)度；5)置酶標(biāo)比色儀上，450 mn透射法比濁記錄各孔本底吸收；6)每一實(shí)驗(yàn)孔加入抗He溶液各25ul?；靹?，37°C溫育15min ;7)置酶標(biāo)比色儀上，透射法比濁，檢測各孔實(shí)驗(yàn)信號(hào)(A45tl)，校正并計(jì)算各孔靶物質(zhì)的濃度；8)綜合上述兩步檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合報(bào)道待測標(biāo)本的靶物質(zhì)濃度。四.應(yīng)用效果
采用本發(fā)明方法之實(shí)施例2對低濃度標(biāo)準(zhǔn)血清(系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)血清)進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3及圖4?；A(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)(LiCA)的信號(hào)強(qiáng)度與血清HBeAg濃度之間有很好地劑量相關(guān)關(guān)系。表3血清HBeAg絮狀免疫凝集-LiCA基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)(LiCA)檢測結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種利用免疫層疊法進(jìn)行可溶性靶物質(zhì)的檢測方法，其特征在于它包括如下步驟 (1)向血清中加入實(shí)驗(yàn)試劑進(jìn)行基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)，所述基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)為免疫層疊實(shí)驗(yàn)的第一次免疫反應(yīng)，所述實(shí)驗(yàn)試劑為基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)試劑，所述基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)為放射免疫實(shí)驗(yàn)、高敏感性乳膠凝集試驗(yàn)、固相酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光免疫實(shí)驗(yàn)、電化學(xué)發(fā)光免疫實(shí)驗(yàn)、時(shí)間分辨免疫熒光實(shí)驗(yàn)或光激發(fā)化學(xué)發(fā)光類免疫實(shí)驗(yàn)之中任一種實(shí)驗(yàn)； (2)對步驟I試驗(yàn)過程中所產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)信號(hào)進(jìn)行檢測，檢測出的實(shí)驗(yàn)信號(hào)依據(jù)靶物質(zhì)濃度與實(shí)驗(yàn)信號(hào)的函數(shù)關(guān)系，確定低濃度段靶物質(zhì)含量，所述低濃度段為基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)檢測所取得的定量范圍 (3)在步驟(I)結(jié)束后，通過向弟一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑,進(jìn)行至少一次的疊加免疫實(shí)驗(yàn)；抗He試劑為溶解于水中的能與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的抗體或抗原，所述抗體或抗原游離于水中或吸附在懸浮于水中的固相載體上，抗He試劑中抗體濃度為O. 05 1000 Kg/ml,或抗原濃度為O. 01 500 Kg/ml,加入抗He試劑體積與基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)體系的體積比例為I :1 20 ; (4)對步驟3實(shí)驗(yàn)過程中所產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)信號(hào)進(jìn)行檢測，檢測出的實(shí)驗(yàn)信號(hào)依據(jù)靶物質(zhì)濃度與實(shí)驗(yàn)信號(hào)的函數(shù)關(guān)系，確定高濃度段靶物質(zhì)含量；所述高濃度段為疊加免疫實(shí)驗(yàn)檢測所取得的能夠定量的檢測范圍 (5)取基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)?zāi)芫_反應(yīng)靶物質(zhì)濃度的上限值為疊加免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果靶物質(zhì)濃度取值的下限值，將疊加免疫實(shí)驗(yàn)的下限值以上部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)上限值以下部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行交匯疊加；形成新的靶物質(zhì)含量與實(shí)驗(yàn)信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系，并據(jù)此計(jì)算待測標(biāo)本中的靶物質(zhì)濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用免疫層疊法進(jìn)行可溶性靶物質(zhì)檢測的方法，其特征在于所述步驟(I)中的實(shí)驗(yàn)試劑為包被有anti-HBs的發(fā)光微球、生物素化的anti_HBs和包被鏈親和素的感光微球；所述步驟(3)中抗He試劑的抗體為抗HBs ;所述步驟(3)中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min，所述的抗He試劑中抗HBs濃度為100 750 Pg/ml，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與一次免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :5 20。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用免疫層疊法進(jìn)行可溶性靶物質(zhì)檢測的方法，其特征在于所述步驟(I)中的實(shí)驗(yàn)試劑為包被有anti-HBe的發(fā)光微球、生物素化的anti_HBe和包被鏈親和素的感光微球；所述步驟(3)中抗He試劑的主要免疫反應(yīng)物質(zhì)為抗HBe致敏的乳膠溶液；所述步驟(3)中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min，所述的抗He試劑中抗HBe標(biāo)記乳膠的質(zhì)量濃度為O.5 2. 0%，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與基礎(chǔ)免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :5 20。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用免疫層疊法進(jìn)行可溶性靶物質(zhì)檢測的方法，其特征在于所述步驟(I)中的實(shí)驗(yàn)試劑為抗人IgE抗體包被微孔板條、銪標(biāo)記抗-hlgE、洗滌液和發(fā)光促進(jìn)劑；所述步驟(3)中抗He試劑的主要免疫反應(yīng)物質(zhì)為抗人IgE致敏乳膠；所述步驟(3)中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min,所述的抗He試劑中抗人IgE標(biāo)記乳膠的質(zhì)量濃度為O. I I. 0%,其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與基礎(chǔ)免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :1 10。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用免疫層疊法進(jìn)行可溶性靶物質(zhì)檢測的方法，其特征在于所述步驟(I)中的實(shí)驗(yàn)試劑為包被有anti-IL-6的酶標(biāo)反應(yīng)板、酶標(biāo)記anti_IL6、洗滌液、底物A及B，分別含TMB與H2O2和固定劑；所述步驟(3)中抗He試劑的主要免疫反應(yīng)物質(zhì)為抗人IL-6致敏乳膠；所述步驟(3)中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min，所述的抗He試劑中抗IL-6標(biāo)記乳膠的質(zhì)量濃度為O. I I. 0%，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與基礎(chǔ)免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :1 10。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用免疫層疊法進(jìn)行可溶性靶物質(zhì)檢測的方法，其特征在于所述步驟(I)中的實(shí)驗(yàn)試劑為HBsAg包被酶標(biāo)反應(yīng)板、HRP酶標(biāo)記HBsAg、洗滌液和含發(fā)光促進(jìn)劑的發(fā)光底物；所述步驟(3)中抗He試劑的主要免疫反應(yīng)物質(zhì)為HBsAg致敏乳膠；所述步驟(3)中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min，所述的抗He試劑中HBsAg標(biāo)記乳膠的質(zhì)量濃度為O. I I. 0%，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與基礎(chǔ)免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :1 10。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用免疫層疊法進(jìn)行可溶性靶物質(zhì)檢測的方法，其特征在于所述步驟(I)中的實(shí)驗(yàn)試劑為生物素化的anti-AFP、三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記anti_AFP、含發(fā)光促進(jìn)劑的鏈親和素標(biāo)記磁性微球、洗滌液和發(fā)光促進(jìn)劑；所述步驟(3)中抗He試劑的抗體為抗人AFP抗體；所述步驟(3)中向第一次免疫反應(yīng)后的反應(yīng)體系中定量加入抗He試劑進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)是在37°C下溫育5 60min，所述的抗He試劑中抗人AFP的濃度為50 25(^g/ml，其加入體積為5 50μ 7孔；加入體積與基礎(chǔ)免疫反應(yīng)終末體系的比例為I :1 10。
8.權(quán)利要求I所述的方法在血清HBsAg、血清HBeAg、血清總IgE、血清人白細(xì)胞介素_6、血清抗HBs或血清AFP定性和定量檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用免疫層疊法進(jìn)行可溶性靶物質(zhì)的檢測方法，它以現(xiàn)代免疫血清學(xué)試驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過引入傳統(tǒng)均相或類均相免疫實(shí)驗(yàn)，建立血清抗原或抗體檢測免疫層疊實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟(1)試劑與標(biāo)準(zhǔn)血清的準(zhǔn)備；(2)進(jìn)行基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)即現(xiàn)代高敏感性免疫血清學(xué)試驗(yàn)(如LiCA實(shí)驗(yàn)等)；(3)進(jìn)行疊加免疫實(shí)驗(yàn)即相對低敏感性免疫實(shí)驗(yàn)(如絮狀免疫凝集實(shí)驗(yàn)等)；(4)綜合得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該方法將兩種具有較大反差的免疫實(shí)驗(yàn)有機(jī)結(jié)合，既保留了LiCA所具有的敏感，特異及其穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，操作簡捷，又能克服Hooks效應(yīng)干擾及其定量檢測范圍狹窄的技術(shù)問題，能滿足精度要求高，濃度變異范圍大的實(shí)驗(yàn)要求，能進(jìn)行全程定量檢測，具有高度的實(shí)用性。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102914643SQ20121046194
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者李方和, 李時(shí)君 申請人:李方和