專利名稱：采用光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析對血清中的待測靶物質(zhì)進行定性與定量檢測的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物學領域中的標記免疫分析方法，具體涉及一種采用光激發(fā)化學發(fā)光(Light initiatd Chemiluminescence Assay, LiCA)免疫分析對血清中的祀物質(zhì)進行定性與定量檢測的方法。
背景技術：
均相免疫指全部的反應與結果的觀察均在均一的液相界面進行的免疫學檢測方法，操作簡潔是均相免疫的主要特征。光激發(fā)化學發(fā)光(LiCA)免疫分析是這類方法的主要代表，亦是目前已經(jīng)商品化的主要均相免疫技術之一，與酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、電化學發(fā)光免疫分析等固相免疫分析相比，LiCA免疫分析涉及時間分辨熒光，納米微球研究，受體(生物素與親和素)固定，特殊的能量轉(zhuǎn)遞方式及均相免疫反應等多種前沿科學成果，其技·術含量最高，實驗操作最簡潔，但因Hooks效應的影響妨礙了其市場推廣。Hooks效應即鉤狀效應，其表現(xiàn)為當反應體系中待測物質(zhì)(包括抗原或抗體)的濃度升高到一定程度后，檢測信號反而下降或顯著下降，甚至出現(xiàn)假陰性結果，由此造成的后果首先是個別靶物質(zhì)含量極高的強陽性標本表現(xiàn)出假陰性，其次為陽性標本中大約10 30%左右強陽性標本，被誤判為弱陽或低濃度陽性。這種存在于多種血清學檢測中的量(待測物濃度)效(檢測信號)分離現(xiàn)象的產(chǎn)生雖可能與待測免疫分子的結構相關，但反應體系中靶物質(zhì)與對應免疫物質(zhì)比例的高度失調(diào)是其最主要的原因。這一效應如果發(fā)生于某些特殊臨床檢測如血清HBsAg的篩選，則可造成大量臨床標本的定量檢測結果偏離真值，部分強陽性標本測值降低或顯著降低，甚至導致個別具有高度傳染性的強陽性標本出現(xiàn)假陰性結果。如果這種漏檢發(fā)生在獻血員篩選，則勢必導致受血者發(fā)生輸血相關性肝炎的嚴重臨床事件。鑒于血清HBsAg檢測的范圍及其社會影響面極大，我國已明令禁止“一步法”檢測在獻血員HBV感染者篩選中的應用。通過近十余年的努力，對Hooks效應干擾的認識已有很大提高，針對固相免疫實驗中的Hooks效應糾正方法不斷出現(xiàn)。但由于反應方式的大相徑庭，這些方法都不能用于均相免疫實驗，而有效拮抗均相免疫中Hooks效應影響的方法迄今尚未見報道與公布。均相與固相免疫的主要差別，還在于全部的固相免疫試驗在操作上均存在一次甚至多次已反應物與未反應物質(zhì)的分離，而均相免疫在整個的實驗過程中，尤其是實驗信號的米集完成后，試劑體系中的未反應物單獨或與反應后物質(zhì)一道存在于同一反應孔(管)中，并很好地保留著與隨后加入靶物質(zhì)結合的能力，這一差別，為“靶物質(zhì)疊加反應”在均相免疫實驗中的實施提供了契機。此外，免疫學檢測方法的定量檢測范圍通常均較為局限，敏感性越高的試驗方法其定量范圍通常越窄，發(fā)光分析雖然在一定程度上能糾正這一現(xiàn)象，然而在兼顧方法敏感性，特異性，穩(wěn)定性及試劑成本的前提下，其定量檢測范圍亦僅在1000ng/ml左右。如何采用單一檢測對多數(shù)靶物質(zhì)實施全程或亞全程定量分析已經(jīng)成為制約免疫學技術發(fā)展的重要技術瓶頸。血清學免疫檢測技術至少包括固相與均相免疫兩類，能接受本專利措施的血清免疫學檢測實驗方法須具備以下前提。①不發(fā)生試劑系統(tǒng)對靶物質(zhì)的結合能力的自消耗不發(fā)生已反應物與未反應物間的相互分離與清除“未參與反應的試劑”能在系統(tǒng)中較長時期保留與靶物質(zhì)反應并生成檢測信號的能力。符合上述條件的實驗方法多集中在均相免疫實驗，光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析(LiCA)是其中的重要代表?，F(xiàn)有血清免疫學試驗盡管存在上述缺點，但在技術發(fā)展上均達到或基本達到在當前物質(zhì)與技術條件下該技術可具備的最佳的狀態(tài)。包括合理的實驗步驟與反應條件，完善的試驗操作與檢測系統(tǒng)(儀器)，穩(wěn)定的試劑質(zhì)量，以及良好地檢測品質(zhì)(高度的特異性敏感性與穩(wěn)定性)等。部分還預留進一步完善與發(fā)展的技術方向。本專利發(fā)明以上述各實驗方法的最新技術成果為基礎，全盤接受上述試驗技術發(fā)展所取得的優(yōu)良技術特征，不排斥正在或?qū)⒁M行的適合本專利技術實施的任何技術革新與改造，為適應本專利實施所進行的相關改造(包括試劑改造與實驗儀器改造)亦以不妨礙原有試驗的操作以及技術特征的充分發(fā)揮為前提。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是對現(xiàn)有的光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析方法進行改進，提供一種能糾正Hooks效應并擴大定量檢測范圍的光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析方法。上述目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種采用光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析對血清中的待測靶物質(zhì)進行定性或定量檢測的方法，包括如下步驟向血清中依次加入包被靶物質(zhì)抗體的發(fā)光微球、生物素標記的靶物質(zhì)抗體、鏈親和素包被的感光微球，混勻后溫育以發(fā)生免疫反應；然后用激發(fā)光激發(fā)上述免疫反應后的反應體系，并第一次檢測反應體系所發(fā)出的發(fā)射光的光子信號強度，檢測出的光子信號強度依據(jù)靶物質(zhì)濃度與發(fā)光信號強度的標準曲線關系，第一次確定靶物質(zhì)含量；在第一次檢測反應體系所發(fā)出的發(fā)射光的光子信號強度后，向免疫反應后的反應體系中加入抗He試劑，混勻后溫育發(fā)生免疫疊加反應；然后用激發(fā)光激發(fā)上述免疫疊加反應后的反應體系，并第二次檢測反應體系所發(fā)出的發(fā)射光的光子信號強度；根據(jù)第一次和第二次的光子信號強度推導新的靶物質(zhì)含量與信號強度的關系，并據(jù)此計算待測標本中的靶物質(zhì)濃度所述的反應體系與抗He試劑的體積比為5-50:1，當所述待測靶物質(zhì)為抗原時，所述的抗He試劑中靶物質(zhì)的濃度為10_200000ng/ml ；當所述待測靶物質(zhì)為抗體時，所述的抗He試劑中靶物質(zhì)的濃度為I. 0-20000IU/ml ο當所述待測靶物質(zhì)為抗原(如血清HBsAg)時，優(yōu)選的抗He試劑中靶物質(zhì)的濃度為2000ng/ml。當所述待測靶物質(zhì)為抗體(如血清抗HBc)時，優(yōu)選的抗He試劑中靶物質(zhì)的濃度為1000IU/ml。優(yōu)選的，所述的反應體系與抗He試劑的體積比為10:1。
優(yōu)選的，所述激發(fā)光波長為680nm,發(fā)射光波長為610_615nm。所述包被靶物質(zhì)抗體的發(fā)光微球的濃度為lO-lOOPg/ml，所述生物素標記的靶物質(zhì)抗體濃度為I. O-lOPg/ml，所述鏈親和素包被的感光微球濃度為lO-lOOPg/ml，所述血清與包被靶物質(zhì)抗體的發(fā)光微球、生物素標記的靶物質(zhì)抗體、鏈親和素包被的感光微球的體積比依次為1:1:1:7。所述室溫下溫育的時間為5-60分鐘。所述上述各項試驗條件，以能產(chǎn)生足以可供分析的試驗信號，并以不發(fā)生對試驗效果的干擾為前提，由于本專利主要發(fā)明點為抗He介入及其靶物質(zhì)疊加免疫反應，現(xiàn)階段LiCA檢測部分的主要實驗條件(即優(yōu)選實驗條件)的選擇依據(jù)市售試劑的規(guī)定，并接受可能出現(xiàn)的適宜本專利實施的改進；所述的方法在血清HBsAg、抗HBc、AFP定性和定量檢測中的應用。在LiCA檢測中，當?shù)谝淮蜭iCA反應及其檢測完畢后，包括標本在內(nèi)的全部的反應體系仍舊存在于反應孔中。陰性，及其低濃度陽性孔中的抗體或包被了抗體與親和素的發(fā)光微球未經(jīng)或僅部分與靶物質(zhì)(如抗原)發(fā)生反應，全部或多數(shù)抗體或包被了抗體的發(fā)光微球得以保留并具備與后續(xù)加入的靶物質(zhì)發(fā)生反應的能力，其反應強度足以使第二次LiCA檢測所獲得的信號(單獨或與一次LiCA反應信號疊加)達到飽和或過飽和狀態(tài)。在“靶物質(zhì)疊加反應”過程中能與隨后加入的靶物質(zhì)(其濃度以能產(chǎn)生可供識別與分析的試驗信號為度，通常以產(chǎn)生飽和LiCA信號的靶物質(zhì)的2倍為佳)發(fā)生反應并產(chǎn)生新的實驗信號，這一信號與第一次LiCA檢測的信號有機疊合，可使第二次LiCA所檢測出的信號強于或顯著強于該類標本所產(chǎn)生的第一次LiCA檢測信號。通過對其信號增強幅度的分析，可提示被檢測標本中的靶物質(zhì)為陰性，或低濃度陽性狀態(tài)。而靶物質(zhì)強陽性與超強陽性(即假陰性)孔中的抗體或包被了抗體的發(fā)光微球體系已經(jīng)與靶物質(zhì)充分反應并為其飽和與過飽和，在一次LiCA檢測中已表現(xiàn)出試驗信號強度與靶物質(zhì)濃度的負相關關系(不同程度Hooks效應所致)。不僅不具備與后續(xù)加入的靶物質(zhì)繼續(xù)反應的能力，其信號強度并可能存在受再次加入抗原的負面影響而出現(xiàn)降低的趨勢。在“靶物質(zhì)疊加反應”后的LiCA反應中，所檢測到的信號(第二次LiCA信號)基本由第一次LiCA反應產(chǎn)生，其強度與一次LiCA相當，略低或略強于(因測試原因)一次LiCA檢測的信號。如圖I所示，受Hooks效應影響，高與超高濃度靶物質(zhì)區(qū)段標本一次LiCA檢測信號的強度與靶物質(zhì)的濃度呈負相關，這種因濃度升高而造成的檢測信號漸進性降低，其原理與競爭抑制法(如競爭抑制性ELISA)類似，其表現(xiàn)呈檢測信號的漸進性降低，兩者的改變亦具有良好地劑量相關性。綜合上述靶物質(zhì)疊加LiCA所體現(xiàn)的種種實驗信號內(nèi)涵，可將被測標本劃分為如下5類即①陰性LiCA常規(guī)定量范圍內(nèi)的低陽性；③飽和信號的陽性信號因Hooks效應降低的高陽性；⑤信號接近或低于域值的超高陽性(即假陰性)。表I為對上述5類標本實施靶物質(zhì)疊加反應前后兩次LiCA檢測試驗信號特征的分析。表I靶物質(zhì)疊加免疫反應LiCA檢測實驗標本濃度區(qū)間評估方法濃度岡間第一次LiA分析第二次LjCA分析I兩者信號比較結果認定方式
接近或達飽和信根據(jù)第一次LiCA確
陰性域值以下十分顯著升高
號認陰性
隨濃度h升漸進接近或達飽和信根據(jù)第一次LiCA定
低濃度陽性不同程度升高
升高號量分析
接近或達飽和信僅能提示濃度區(qū)間， 中濃度陽性信號飽和狀態(tài)基本無改變
號暫時無法定量分析
隨濃度上升漸進根據(jù)第一次LiCA定
高濃度陽性隨濃度漸進降低基本無改變
降低量分析
域值附近或以
超高濃度陽性域值附近或以下基本無改變能提示濃度區(qū)間
下，假陰性從表I可以看出，通過靶物質(zhì)免疫疊加反應及對第一次LiCA檢測信號和第二次LiCA檢測信號進行對比分析，便可消除Hooks效應所致的假陰性，并大幅提升定量分析能力。從而實現(xiàn)對靶物質(zhì)在更高層面上的定性和定量分析。所述的方法同時可用于血清HBsAg、抗HBc、AFP等以外的其它抗原與抗體的定性和定量檢測。當然，本發(fā)明的原理也可用于其它均相免疫分析，如酶聯(lián)均相免疫分析與免疫凝集試驗分析等，能接受此改進措施的方法如前所述。這類方法通過引入“靶物質(zhì)疊加反應”，亦可達到消除Hooks效應影響并提升定量檢測范圍的目的。


圖I是受Hooks效應影響的LiCA檢測分段曲線圖。圖2是低濃度組標本HBsAg濃度與LiCA信號之間的線性關系曲線圖。圖3是高濃度標本HBsAg濃度與第一次LICA檢測信號之間的線性關系曲線圖。圖4是高濃度標本HBsAg濃度與第二次LiCA檢測信號之間的線性關系曲線圖。圖5是高濃度標本HBsAg濃度與第二次LiCA檢測信號飽和度之間的線性關系曲線圖。圖6是低濃度組標本抗HBc濃度與LiCA信號之間的線性關系曲線圖。圖7是高濃度標本抗HBc濃度與第一次LICA檢測信號之間的線性關系曲線圖。圖8是高濃度標本抗HBc濃度與第二次LiCA檢測信號之間的線性關系曲線圖。圖9是高濃度標本抗HBc濃度與第二次LiCA檢測信號飽和度之間的線性關系曲線圖。圖5、圖9中，橫坐標為待測靶物質(zhì)濃度，縱坐標為第一 /第二次LiCA檢測光子數(shù)比率(％)。其余各圖中，橫坐標為待測靶物質(zhì)濃度，縱坐標為檢測到的光子數(shù)。
具體實施例方式實施例I 檢測HBsAg的方法一、檢測方法方法名稱HBsAg檢測靶抗原疊加LiCA ；原有方法名稱HBsAg檢測LiCA;敏感性0.05-1. Ong/ml ；定量范圍0·1-500 至 1000ng/ml 內(nèi)；Hooks效應起點(即反應信號呈濃度依賴性降低起點)約50 000ng/ml左右； 假陰性出現(xiàn)濃度(反應信號接近cut off值)大于I OOOPg/ml ；二、材料I、儀器與耗材檢測儀器LiCA HT光激化學發(fā)光檢測儀；由中國博陽生物(上海)科技有限公司制造;2、試劑(I)血清HBsAg檢測光激化學發(fā)光試劑盒由博陽生物(上海)科技有限公司制造，市售獲得。包括下述試劑試劑I :Anti-HBs包被發(fā)光微球，濃度為4(^g/ml ；試劑2 :生物素化Anti-HBs，濃度為4· 0μδ/πι1 ；試劑3 :鏈親和素(SA)包被感光微球(通用微球)，濃度為5(^g/ml。(2)抗 He 試劑(全稱:抗 Hooks 效應試劑,Anti Hooks Effect Agent,抗 He):主要成分為HBsAg，濃度范圍10-200 000ng/ml ;本實施例選用三種不同HBsAg濃度的抗He，分別為2000ng/ml、10. Ong/ml、200 000ng/ml。(3)標準血清，含已知濃度HBsAg的血清，或純化HBsAg溶液。窄幅標準血清自制，或由上述LiCA試劑盒配備；用于低靶物質(zhì)濃度標本的計量分析(通常6個，濃度范圍在1000ng/ml以內(nèi))；寬幅標準血清自制，濃度經(jīng)衛(wèi)生部生物制品檢定所標定。用于高及超高靶物質(zhì)濃度組的計量分析(通常6個，濃度范圍在200(^g/ml以內(nèi))；本次使用的自制參比血清系純化自然表達HBsAg，紫外光譜吸收檢測其濃度；免疫活性未與市售標準品作嚴格比對。(4)陰性對照與陽性對照血清自制或市售試劑配備；用于域值確認，反應性評價，以及飽和信號強度的確認(現(xiàn)階段主要用自制陽性對照血清);(5)待檢標本血清,血漿或其它體液；其它標本(如基因重組表達產(chǎn)物)。三、操作步驟I.試驗準備取出所有試劑與標本，并恢復至室溫。2.實驗操作(I)取待測標本，陰、陽性對照，及其HBsAg定量標準血清系列各25μ1，分別加至LiCA板各反應孔中，每份標本加一孔(或根據(jù)需要的任意孔)；
(2)旋即加入試劑1，每一反應孔加入各25μ1。(3)旋即加入試劑2，每一反應孔加入各25μ1，37 溫育15分鐘，(4)加入試劑3，每一反應孔加入各175μ1，混勻，37°C溫育15分鐘；(5)置LICA發(fā)光檢測儀上，采用680nm波長激發(fā)，610nm波長檢測各孔信號，初步評價檢測標本的信號強度，并繪制標準曲線；(6)每一反應孔加入抗He試劑各25μ1,混勻，37°C溫育20分鐘；(7)再次置LiCA發(fā)光檢測儀上，采用680nm波長激發(fā)，610nm波長檢測各孔信號，并初步評價各反應孔信號強度；根據(jù)第一，第二次LiCA檢測結果，將待測標本分別歸類為5個靶物質(zhì)濃度區(qū)間，歸 類方式見表I。四、結果分析根據(jù)陰性對照結果按常規(guī)確定檢測域值；根據(jù)陽性對照孔(既定濃度靶物質(zhì))均值確定飽和信號強度；根據(jù)飽和信號強度計算各實驗孔二次LiCA信號飽和度；根據(jù)一，二次LiCA測值計算各實驗孔(兩者)信號比值；根據(jù)第一及第二次檢測結果及其上述分析指標對被檢測標本進行靶物質(zhì)濃度分類，分類方式見下表。表2受檢標本中靶物質(zhì)表達濃度狀態(tài)分類表
類別與表I 一次實驗信號二次實驗信號I 二次信號飽I一/二次信I大致濃度范圍估 達狀態(tài)和度號比評
I陰性域值或以下貼近飽和信號接近100% <5%無
2低陽低于飽和信號95% 貼近飽和信號接近100% 5S100% < 1000ng/nil
3中陽貼近飽和信號貼近飽和信號接近100%接近100% 1000-40000ng/ml
4高陽低于飽和信號95%低于飽和信號9』<95% 彡100% 40-1000Pg/ml
5超高陽域值或以下域值或以下<5%接近100% >1000Rg/ml( I)根據(jù)各標本的檢測數(shù)據(jù)以及前述分析，自上表中確定各自的靶物質(zhì)濃度狀態(tài)，并對陰性，中等程度陽性，及其假陰性(即第1、3、5類標本)作出定性報告；(2)采用前述制備的低及高濃度標準品系列孔檢測數(shù)據(jù)繪制的標準曲線，分別對歸類于低陽與高陽組(即第2、4類標本)的標本以回歸法判讀定量檢測數(shù)據(jù)。五、檢測效果(一)采用抗He ( (2000 ng/ml)檢測
I、域值與飽和信號值域值697. 5 (陰性對照均值)X2. I =1464. 8飽和信號值862478 (兩孔陽性對照均值)。2、低濃度靶物質(zhì)的檢測效果對一組系列稀釋的低濃度靶物質(zhì)(參比法標定)進行檢測，結果見表3。表3低濃度組HBsAg含量與LiCA信號之間的劑量相關性
權利要求
1.一種采用光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析對血清中的待測靶物質(zhì)進行定性或定量檢測的方法，包括如下步驟向血清中依次加入包被靶物質(zhì)抗體的發(fā)光微球、生物素標記的靶物質(zhì)抗體、鏈親和素包被的感光微球，混勻后溫育以發(fā)生免疫反應；然后用激發(fā)光激發(fā)上述免疫反應后的反應體系，并第一次檢測反應體系所發(fā)出的發(fā)射光的光子信號強度，檢測出的光子信號強度依據(jù)靶物質(zhì)濃度與發(fā)光信號強度的標準曲線關系，第一次確定靶物質(zhì)含量；其特征在于在第一次檢測反應體系所發(fā)出的發(fā)射光的光子信號強度后，向免疫反應后的反應體系中加入抗He試劑，混勻后溫育發(fā)生免疫疊加反應；然后用激發(fā)光激發(fā)上述免疫疊加反應后的反應體系，并第二次檢測反應體系所發(fā)出的發(fā)射光的光子信號強度； 根據(jù)第一次和第二次 的光子信號強度推導新的靶物質(zhì)含量與信號強度的關系，并據(jù)此計算待測標本中的靶物質(zhì)濃度 所述的反應體系與抗He試劑的體積比為5-50:1 ； 所述待測靶物質(zhì)為抗原時，所述的抗He試劑中靶物質(zhì)的濃度為10-200000ng/ml ； 所述待測靶物質(zhì)為抗體時，所述的抗He試劑中靶物質(zhì)的濃度為l-20000IU/ml。
2.如權利要求I所述的采用光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析對血清中的待測靶物質(zhì)進行定性與定量檢測的方法，其特征在于所述待測靶物質(zhì)為抗原，所述的抗He試劑中靶物質(zhì)的濃度為 2000ng/ml。
3.如權利要求I所述的采用光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析對血清中的待測靶物質(zhì)進行定性與定量檢測的方法，其特征在于所述待測靶物質(zhì)為抗體，所述的抗He試劑中靶物質(zhì)的濃度為 1000IU/ml。
4.如權利要求I所述的采用光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析對血清中的待測靶物質(zhì)進行定性與定量檢測的方法，其特征在于所述的反應體系與抗He試劑的體積比為10:1。
5.如權利要求I所述的采用光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析對血清中的待測靶物質(zhì)進行定性與定量檢測的方法，其特征在于所述激發(fā)光波長為680nm,發(fā)射光波長為610_615nm。
6.如權利要求I所述的采用光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析對血清中的待測靶物質(zhì)進行定性與定量檢測的方法，其特征在于所述包被靶物質(zhì)抗體的發(fā)光微球的濃度為IO-IOOPg/ml，所述生物素標記的靶物質(zhì)抗體濃度為I. O-lOPg/ml，所述鏈親和素包被的感光微球濃度為lO-lOOPg/ml，所述血清與包被靶物質(zhì)抗體的發(fā)光微球、生物素標記的靶物質(zhì)抗體、鏈親和素包被的感光微球的體積比依次為1: 1: 1: 7。
7.如權利要求I所述的采用光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析對血清中的待測靶物質(zhì)進行定性與定量檢測的方法，其特征在于所述溫育的時間為5 60分鐘。
8.權利要求I所述的方法在血清HBsAg定性和定量檢測中的應用。
9.權利要求I所述的方法在血清抗HBc定性和定量檢測中的應用。
10.權利要求I所述的方法在血清AFP定性和定量檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種采用光激發(fā)化學發(fā)光免疫分析對血清中的靶物質(zhì)進行定性與定量檢測的方法，包括向待測標本中加入包被靶物質(zhì)抗體的發(fā)光微球、生物素包被靶物質(zhì)抗體、鏈親和素(SA)包被的感光微球進行第一次免疫反應和檢測的步驟，還包括向反應體系中加入抗He試劑發(fā)生靶物質(zhì)免疫疊加反應，并進行第二次光激發(fā)化學發(fā)光免疫檢測的步驟。本發(fā)明通過對兩次LiCA檢測結果的綜合分析達到全方位糾正Hooks效應的目標，分析過程包括根據(jù)其在一次LiCA與二次LiCA檢測的信號特征將被檢標本區(qū)分為陰、低陽、中陽，高陽與超高陽等五個濃度區(qū)間；根據(jù)第一次LiCA對低陽與超高陽濃度區(qū)段的標本進行定量分析。本發(fā)明具有結果準確，操作簡便，適用范圍廣等特點。
文檔編號G01N21/76GK102944672SQ20121046152
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權日2012年11月16日
發(fā)明者李方和, 李時君 申請人:李方和