專利名稱：鋅離子作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用及其測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，主要是 ー種在治療糖尿病方面上的鋅離子作為a-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用及其測定方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)《糖尿病醫(yī)學(xué)》Diabate Medicine，10，688 (1993)報(bào)道，a -葡萄糖苷酶抑制劑可抑制存在于小腸微絨毛的a-葡萄糖苷酶，延緩碳水化合物的吸收，延遲雙糖、低聚糖、多糖的吸收，延遲并減低餐后血糖升高，可作為ー種新型的糖尿病治療藥物。a-葡萄糖苷酶抑制劑對改善高血糖癥狀和高血糖所致的肥胖癥、糖尿病等各種疾病很有用。目前臨床常用的a-葡萄糖苷酶抑制劑為阿卡波糖(Acarbose,拜唐蘋)或其類似物，是由微生物發(fā)酵制得的，可競爭性抑制多種a-葡萄糖苷酶(如蔗糖酶、麥芽糖酶、淀粉葡萄糖苷酶等)的活性，對糖尿病有很好的療效，但長期使用可能會出現(xiàn)胃腸脹氣、腹痛、腹瀉等消化道副反應(yīng)，且制藥成本較高。因此，尋找更為安全高效的a-葡萄糖苷酶抑制劑成為研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種鋅離子作為a-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用及其測定方法，其作用同阿卡波糖類似，且具有來源豐富、廉價(jià)、易于制備和容易攝取等特點(diǎn)。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的。鋅離子作為a-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用為=Zn2+通過抑制酶活性從而減緩或抑制碳水化合物的消化吸收，可作為II型糖尿病的治療藥物。鋅離子作為a-葡萄糖苷酶抑制劑的測定方法為I)配制0. 6mM (毫摩爾/升)醋酸鋅，用50mMこ磺酸(pH 6. 5)緩沖液逐級稀釋成不同濃度，a -葡萄糖苷酶用50mM磷酸緩沖液(pH7. 4)配制成3 y M a -葡萄糖苷酶液；2)將不同濃度的醋酸鋅30 y L與等體積的a -葡萄糖苷酶液混合，設(shè)置不含醋酸鋅的30 y L緩沖液與等體積的a -葡萄糖苷酶混合作為空白対照，以上體系25°C保溫3hr后測定酶活力。作為優(yōu)選，用上述50mM磷酸緩沖液(pH7. 4)配制IOmM pNPG溶液，取600 u L分別與上述等體積的醋酸鋅溶液和こ磺酸緩沖液(空白對照)混合，作為測定a -葡萄糖苷酶活性的底物體系。所述的a-葡萄糖苷酶抑制劑的活力測定方法為先將ImL預(yù)熱至37°C的含不同濃度Zn2+的pNPG底物置于比色皿中，加入5 ii L對應(yīng)Zn2+濃度的a -葡萄糖苷酶溶液，迅速混合，通過島津公司UV-1800紫外可見分光光度計(jì)檢測400nm處每分鐘吸光值變化來指示反應(yīng)速度V值，從而表征酶活性的大小，其測定溫度為37°C。本發(fā)明的有益效果為鋅離子對a-葡萄糖苷酶具有強(qiáng)效的抑制作用，鋅離子可成為II型糖尿病治療的有效的作用物質(zhì)。


圖I是Zn2+對a -葡萄糖苷酶的抑制影響圖；圖2是V和[E]的關(guān)系圖；圖3 是 Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)圖；圖4是根據(jù)圖3求得的Slope值對Zn2+濃度作圖；圖5是Zn2+抑制a -葡萄糖苷酶的時(shí)間過程圖；圖6是根據(jù)圖5進(jìn)行的時(shí)間過程半對數(shù)曲線分析圖；圖7是Zn2+對a-葡萄糖苷酶內(nèi)源熒光的影響圖； 圖8是a -葡萄糖苷酶內(nèi)源熒光最大熒光強(qiáng)度處波長隨Zn2+濃度變化圖；圖9是a -葡萄糖苷酶ANS結(jié)合的最大熒光強(qiáng)度隨Zn2+濃度變化圖；圖10是a -葡萄糖苷酶的序列比對圖；圖11是a -葡萄糖苷酶的計(jì)算機(jī)結(jié)構(gòu)模擬圖；圖12是a -葡萄糖苷酶與Zn2+作用的初始結(jié)構(gòu)圖；圖13是a -葡萄糖苷酶與Zn2+的分子動力學(xué)模擬圖；圖14是a -葡萄糖苷酶與Zn2+結(jié)合的結(jié)構(gòu)模擬圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細(xì)的介紹鋅離子(Zn2+)是很多酶催化作用的輔助因子，同時(shí)擔(dān)任轉(zhuǎn)錄因子的作用和突觸傳導(dǎo)的底物。Zn2+對于機(jī)體的正常生長、免疫功能和傷ロ愈合等均有作用。因此，Zn2+是生物體必須的營養(yǎng)因子，在機(jī)體的代謝和疾病抵抗中起重要作用。鑒于Zn2+對細(xì)胞作用的重要性，在飲食中需含有足夠量的鋅以維護(hù)機(jī)體健康。另ー方面，Zn2+在某些條件下還具有抑制酶活性的功能。本發(fā)明的目的在于提供Zn2+的新用途，即作為a-葡萄糖苷酶抑制劑的新應(yīng)用。本發(fā)明所用的Zn2+,來源于醋酸鋅ニ水合物，其英文名稱為Zinc acetatedihydrate，分子式為Zn(CH3COO)2 2H20，分子量219. 51，為白色單斜片狀晶體，易溶于水，
其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示
H3CT、0* Zn2+ 21^0
』JS醋酸鋅ニ水合物為商品化物質(zhì)，可以從試劑公司直接購買到。本發(fā)明所用a-葡萄糖苷酶的英文名稱為Alpha-glucosidase，來源于釀酒酵母，為凍干粉末，購于Sigma公司。為了更好的理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面詳細(xì)說明Zn2+作為a-葡萄糖苷酶抑制劑使用的機(jī)理。I. a -葡萄糖苷酶活性測定方法a -葡萄糖苷酶可催化底物對硝基苯-a _D_批喃葡糖苷(p_Nitrophenyla -D-glucopyranosid e, pNPG)形成 4_ 硝基酌'(^i-Nitrophenol, pNP),而 pNP 在 400nm 波長處有最大吸收峰。因此通過測定酶催化反應(yīng)體系的A4tltl隨時(shí)間的增長直線，該直線的斜率即為a -葡萄糖苷酶的活力。即以PNPG為底物通過分光光度法在波長400nm處測定pNP的產(chǎn)生速度來計(jì)算a -葡萄糖苷酶活力的大小。具體測定方法為在ImL用50mM磷酸緩沖液(PH7.4)配制的5mM pNPG底物體系中，加入5 y L a -葡萄糖苷酶溶液，迅速混勻，通過島津公司UV-1800紫外可見分光光度計(jì)檢測400nm處每分鐘吸光值變化來指示反應(yīng)速度v值，從而表征酶活性的大小。測定溫度為37°C。2. Zn2+對a -葡萄糖苷酶抑制作用的測定配制0. 6mM (毫摩爾/升)醋酸 鋅，用50mM 2_(N_嗎啡啉)こ磺酸(MES)緩沖液(pH 6. 5)逐級稀釋成不同濃度。將不同濃度的醋酸鋅30 UL與等體積的a-葡萄糖苷酶液混合，25°C保溫3hr后測定酶活力。測定時(shí)a -葡萄糖苷酶終濃度為I. 5 u M(微摩爾/升)，底物pNPG濃度為5mM，底物中含相應(yīng)濃度抑制劑醋酸鋅。Zn2+濃度與a -葡萄糖苷酶活力的關(guān)系如圖I所示。由圖I可知a-葡萄糖苷酶活力被Zn2+以濃度依賴的方式顯著地抑制，酶活力下降一半時(shí)Zn2+的濃度(IC5tl)為0. 056±0. 006mM(n=3);當(dāng)Zn2+濃度高于0. 3mM時(shí)，酪氨酸酶被完全抑制。3. Zn2+對a -葡萄糖苷酶的抑制為可逆的抑制作用為了判斷Zn2+介導(dǎo)的抑制作用是否為可逆反應(yīng)，在反應(yīng)體系中，加入不同濃度的醋酸鋅，當(dāng)?shù)孜颬NPG濃度不變時(shí)，改變a -葡萄糖苷酶的加入量，測定a -葡萄糖苷酶催化底物氧化的活力隨酶量的關(guān)系。結(jié)果如圖2所示v值代表在400nm波長處每分鐘吸光值的變化，[E]代表a-葡萄糖苷酶的濃度，Zn2+濃度分別為0 (▼)、(). 03 ( A ),0. 045 (■)和0. 06mM( )，體系中pNPG的終濃度為5mM。圖中直線均經(jīng)過坐標(biāo)軸原點(diǎn)，直線的斜率隨著加入Zn2+濃度的增大而下降，證實(shí)Zn2+對a -葡萄糖苷酶的抑制作用是ー個(gè)可逆過程。4. Zn2+對a -葡萄糖苷酶的拋物線-混合型抑制分析為評估Zn2+對a -葡萄糖苷酶抑制的類型，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖?；旌闲鸵种苿恿W(xué)分析的Lineweaver-Burk方程如公式I所示
權(quán)利要求
1.鋅離子作為a-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用。
2.一種鋅離子作為a-葡萄糖苷酶抑制劑的測定方法，其特征在干 1)、配制0.6mM毫摩爾/升的醋酸鋅，用50mMこ磺酸pH為6. 5的緩沖液逐級稀釋成不同濃度，a -葡萄糖苷酶用50mM、pH7. 4的磷酸緩沖液配制成3 y M a -葡萄糖苷酶液； 2)、將不同濃度的醋酸鋅30y L與等體積的a -葡萄糖苷酶液混合，設(shè)置不含醋酸鋅的30uL緩沖液與等體積的a -葡萄糖苷酶混合作為空白対照，以上體系25°C保溫3hr后測定酶活力。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鋅離子作為a-葡萄糖苷酶抑制劑的測定方法，其特征在于用上述50mM、pH7. 4的磷酸緩沖液配制IOmM pNPG溶液，取600 u L分別與上述等體積的醋酸鋅溶液和こ磺酸緩沖液空白對照混合，作為測定a-葡萄糖苷酶活性的底物體系。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的a-葡萄糖苷酶抑制劑的測定方法，其特征在于活力測定方法步驟如下先將ImL預(yù)熱至37°C的含不同濃度Zn2+的pNPG底物置于比色皿中，加入5V- L對應(yīng)Zn2+濃度的a -葡萄糖苷酶溶液,迅速混合,通過紫外可見分光光度計(jì)檢測400nm處每分鐘吸光值變化來指示反應(yīng)速度V值，從而表征酶活性的大小，其測定溫度為37°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鋅離子作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用及其測定方法，1)配制0.6mM(毫摩爾/升)醋酸鋅，用50mM乙磺酸(pH 6.5)緩沖液逐級稀釋成不同濃度，α-葡萄糖苷酶用50mM磷酸緩沖液(pH7.4)配制成3μMα-葡萄糖苷酶液；2)將不同濃度的醋酸鋅30μL與等體積的α-葡萄糖苷酶液混合，設(shè)置不含醋酸鋅的30μL緩沖液與等體積的α-葡萄糖苷酶混合作為空白對照，以上體系25℃保溫3hr后測定酶活力。本發(fā)明的有益效果為鋅離子對α-葡萄糖苷酶具有強(qiáng)效的抑制作用，鋅離子可成為II型糖尿病治療的有效的作用物質(zhì)。
文檔編號G01N21/31GK102861002SQ20121037643
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者尹尚軍, 斯越秀, 錢國英, 樸龍斗 申請人:浙江萬里學(xué)院