專利名稱：一種正品大黃種子的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及正品大黃種子的檢測方法，屬于中藥領域。
背景技術：
大黃為寥科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim, ex Balf.或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖。具有灣熱通腸，涼血解毒，逐瘀通經的功效。用于實熱便秘，積滯腹痛，瀉痢不爽，濕熱黃疸，血熱吐衄，目赤，咽腫，腸癰腹痛，癰腫疔瘡，瘀血經閉，跌打損傷，上消化道出血；外治水火燙傷。掌葉大 黃分布于甘肅東南部、青海、四川西部、云南西北部及西藏東部；唐古特大黃分布于甘肅、青海、四川及西藏東北部；藥用大黃分布于陜西南部、河南西部、湖北西部、四川、云南等地。華北大黃、河套大黃是常見的偽品大黃，易與唐古特大黃等正品大黃混淆。
近年來，由于對野生大黃資源的無計劃采挖，導致野生大黃資源逐年減少，全國野生大黃資源已瀕臨枯竭。為滿足市場對優(yōu)質大黃日益增長的需求量，大黃人工種植規(guī)模不斷擴大，而品質純正的種子是藥材栽培的前提，是提高藥材產量和質量的根本保障。目前，我國大黃種子沒有檢驗標準和質量標準，主要是通過形狀、大小、顔色、表皮、飾紋等性狀進行鑒別，具有一定的局限性。申請?zhí)?01110337787. 7，發(fā)明名稱ー種鑒定真?zhèn)未簏S種子的方法的專利申請公開了ー種鑒別真?zhèn)未簏S種子的方法，它包括如下步驟(I)取待檢種子，提取待檢種子中的大黃酚和大黃素；(2)測定大黃種子中大黃酚和大黃素的含量；(3)計算大黃酚含量/大黃素含量的比值；(4)根據步驟(3)計算的比值判斷若比值大于1，判斷該種子為正品大黃種子，若比值小于或者等于1，判斷該種子為偽品大黃種子。該方法通過種子中大黃酚和大黃素含量的比值來確定大黃種子是否為正品，因精確測定某成分含量較難，誤差較大，導致該方法使用不方便，準確度不夠高。尤其針對在正品大黃種子中摻雜部分偽品的情況，容易得出錯誤的結論，難以替代傳統(tǒng)檢測方法。需尋找ー種更為簡便、準確、可靠的方法鑒定正品、偽品，以及正偽混合的大黃種子的方法。

發(fā)明內容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種正品大黃種子的檢測方法。本發(fā)明正品大黃種子的檢測方法，，它是采用高效液相色譜法檢測，包括如下步驟( I)取待檢種子，粉碎，用甲醇提取，過濾，得濾液，除去甲醇，酸水解，用有機溶劑萃取，得有機溶劑層，回收溶劑至干，再溶解，制成供試品溶液；(2)取蘆薈大黃素對照品，溶解，制備對照品溶液；(3)用高效液相色譜法檢測，在供試品溶液的色譜圖中，有色譜峰與蘆薈大黃素對照品色譜峰保留時間一致，鑒定待檢種子中含有正品大黃種子，色譜條件如下固定相十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相甲醇-0. 1%磷酸溶液，二者的體積比為(8(T90)(10 20);檢測波長254nm。其中，步驟(I)所述待檢種子為掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheumtanguticum，Maxim, ex Balf、華北大黃 Rheum franzenbachiiMunt.或者河套大黃 Rhumhotaoense C. Y. Cheng et C. T. Kao 的種子。其中，步驟(I)所述酸水解時，溶液中氫離子的濃度為2 3mol/L ;所述有機溶劑為三氯甲烷。優(yōu)選地，所述步驟(I)中，將待檢種子粉碎，過四號篩，得粉末，加甲醇，粉末與甲醇的質量體積比為I :15(Tl85，加熱回流3(T90min，冷卻，稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，得續(xù)濾液，揮去溶劑，加濃度為6 10%的鹽酸，超聲處理f3min，加等體積的三氯甲烷，加熱回流6(T80min，再用三氯甲烷萃取3次，毎次所用三氯甲烷體積同鹽酸體積，得 三氯甲烷層，回收溶劑至干，加甲醇制成供試品溶液。其中，所述步驟(3)中，甲醇與0. 1%磷酸溶液的體積比為85 :15。它還包括定性檢測方法，步驟如下I)取待檢種子，粉碎，用甲醇提取，過濾，得濾液，揮去溶剤，酸溶液水解，用有機溶劑萃取，得水層；2)取步驟I)所得水層，加廣3倍體積的濃氨水，震搖，無紅棕色至棕褐色絮狀沉淀；3)鑒定待檢種子為正品大黃種子。其中，步驟I)所述酸水解，溶液中氫離子的濃度為0. 52^2mol/L ;有機溶劑為こ醚。優(yōu)選地，所述步驟I)中，將待檢種子粉碎成細粉，加甲醇，細粉與甲醇的質量體積比為1:15^25,浸泡30mirT90min，過濾，得濾液，蒸干，加水，再加濃鹽酸，鹽酸體積為水體積的l/2(Tl/5，加熱回流2(T40min，冷卻，用こ醚萃取，萃取2次，毎次所用こ醚體積為水體積的:T5倍，得水層。本發(fā)明正品大黃種子的檢測方法可以準確檢測待檢種子中是否含有正品大黃種子，用本發(fā)明優(yōu)選的檢測方法，可以進ー步確定待檢種子是否還混有偽品種子，將正偽種子混合品從正品中排除，準確度高，且檢測方法簡單、快速，可以替代傳統(tǒng)檢測方法，具有良好的應用前景。顯然，根據本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內容再作進ー步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。


圖I高效液相色譜法游離蒽醌對照品圖譜，其中，I為蘆薈大黃素、2為大黃酸、3為大黃素、4為大黃酚、5為大黃素甲醚；圖2高效液相色譜法DHlO圖譜,其中，3為大黃素,4為大黃酚、5為大黃素甲醚；圖3高效液相色譜法DHl3圖譜，其中，I為蘆薈大黃素、3為大黃素、4為大黃酚、5為大黃素甲醚。圖4高效液相色譜法DHl5圖譜，其中，I為蘆薈大黃素、3為大黃素、4為大黃酚、5為大黃素甲醚。圖5高效液相色譜法DH26圖譜,其中，3為大黃素、4為大黃酚、5為大黃素甲醚。圖6沉淀檢測結果，其中，左邊為DH10、DH26，右邊為DHl3、DHl5。
具體實施方式

實施例I本發(fā)明檢測方法I、檢測方法(I)取待檢種子；(2)取待檢種子粉末(過四號篩)0. 15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇22. 5ml，稱定重量，加熱回流30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加6%鹽酸溶液5ml，超聲處理I分鐘，再加三氯甲烷5ml，加熱回流30min，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，毎次5ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至IOml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取蘆薈大黃素對照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作為對照品溶液。高效液相色譜法的檢測以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相；以甲醇-0. I %磷酸溶液(80 10)為流動相；檢測波長為254nm。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 yl，注入液相色譜儀，測定即可。(3)若步驟(2)中，在供試品溶液的色譜圖中，有色譜峰與蘆薈大黃素對照品色譜峰保留時間一致，說明待檢種子中含有正品大黃種子。實施例2本發(fā)明檢測方法I、檢測方法(I)取待檢種子；(2)取待檢種子粉末(過四號篩)0. 15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25ml，稱定重量，加熱回流I小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液IOml (8%鹽酸溶液中氫離子的濃度為2. 5mol/L)，超聲處理2分鐘，再加三氯甲烷10ml，加熱回流I小時，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，毎次10ml，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至IOml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取蘆薈大黃素對照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作為對照品溶液。高效液相色譜法的檢測以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相；以甲醇-0. I %磷酸溶液(85 15)為流動相；檢測波長為254nm。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 yl，注入液相色譜儀，測定即可。(3)若步驟(2)中，在供試品溶液的色譜圖中，有色譜峰與蘆薈大黃素對照品色譜峰保留時間一致，說明待檢種子中含有正品大黃種子。
實施例3本發(fā)明檢測方法I、檢測方法(I)取待檢種子；(2)取待檢種子粉末(過四號篩)0. 15g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇
27.75ml，稱定重量，加熱回流90min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5ml，置燒瓶中，揮去溶劑，加10%鹽酸溶液15ml，超聲處理3分鐘，再加三氯甲烷15ml，加熱回流90min，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，毎次15ml，合并三氯甲烷液，減壓 回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至IOml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取蘆薈大黃素對照品，加甲醇制成每Iml含16y g的溶液，作為對照品溶液。高效液相色譜法的檢測以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相；以甲醇-0. I %磷酸溶液(90 20)為流動相；檢測波長為254nm。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 yl，注入液相色譜儀，測定即可。(3)若步驟(2)中，在供試品溶液的色譜圖中，有色譜峰與蘆薈大黃素對照品色譜峰保留時間一致，說明待檢種子中含有正品大黃種子。實施例4本發(fā)明檢測方法I、檢測方法(I)取待檢種子；(2)按照實施例I的檢測方法檢測，在供試品溶液的色譜圖中，有色譜峰與蘆薈大黃素對照品色譜峰保留時間是否一致；(3)取待檢種子細粉I. Og,加甲醇15ml,浸泡30min,濾過,取濾液5ml,蒸干,殘洛加水IOml使溶解，再加濃鹽酸0. 5ml (所得稀鹽酸溶液中氫離子的濃度為0. 52mol/L),加熱回流20分鐘，立即冷卻，用こ醚分2次提取，毎次15ml，得水層；取水層，加I倍體積的濃氨水，震搖，觀察有無紅棕色至棕褐色絮狀沉淀；(4)若步驟(2)中，供試品溶液的色譜圖中，有色譜峰與蘆薈大黃素對照品色譜峰保留時間一致，并且。步驟(3)中，水層無紅棕色至棕褐色絮狀沉淀，將待檢種子鑒定為正品大黃種子。實施例5本發(fā)明檢測方法I、檢測方法(I)取待檢種子；(2)按照實施例2的檢測方法檢測，在供試品溶液的色譜圖中，有色譜峰與蘆薈大黃素對照品色譜峰保留時間是否一致；(3)取待檢種子細粉I. 0g，加甲醇20ml，浸泡I小時，濾過，取濾液5ml，蒸干，殘渣加水IOml使溶解，再加濃鹽酸Iml (所得稀鹽酸溶液中氫離子的濃度為I. 09mol/L)，加熱回流30分鐘，立即冷卻，用こ醚分2次提取，毎次20ml，得水層；取水層，加2倍體積的濃氨水，震搖，觀察有無紅棕色至棕褐色絮狀沉淀；(4)若步驟(2)中，供試品溶液的色譜圖中，有色譜峰與蘆薈大黃素對照品色譜峰保留時間一致，并且。步驟(3)中，水層無紅棕色至棕褐色絮狀沉淀，將待檢種子鑒定為正品大黃種子。實施例6本發(fā)明檢測方法I、檢測方法(I)取待檢種子；(2)按照實施例3的檢測方法檢測，在供試品溶液的色譜圖中，有色譜峰與蘆薈大黃素對照品色譜峰保留時間是否一致 ；(3)取待檢種子細粉I. Og,加甲醇25ml,浸泡90min,濾過,取濾液5ml,蒸干,殘洛加水IOml使溶解，再加濃鹽酸I. 5ml (所得稀鹽酸溶液中氫離子的濃度為I. 09mol/L)，カロ熱回流40分鐘，立即冷卻，用こ醚分2次提取，毎次25ml，得水層；取水層，加3倍體積的濃氨水，震搖，觀察有無紅棕色至棕褐色絮狀沉淀；(4)若步驟(2)中，供試品溶液的色譜圖中，有色譜峰與蘆薈大黃素對照品色譜峰保留時間一致，并且。步驟(3)中，水層無紅棕色至棕褐色絮狀沉淀，將待檢種子鑒定為正品大黃種子。實驗例I用本發(fā)明檢測方法檢測待檢種子I、實驗材料
權利要求
1.一種正品大黃種子的檢測方法，它是采用高效液相色譜法檢測，包括如下步驟 (1)取待檢種子，粉碎，用甲醇提取，過濾，得濾液，除去甲醇，酸水解，用有機溶劑萃取，得有機溶劑層，回收溶劑至干，再溶解，制成供試品溶液； (2)取蘆薈大黃素對照品，溶解，制備對照品溶液； (3 )用高效液相色譜法檢測，在供試品溶液的色譜圖中，有色譜峰與蘆薈大黃素對照品色譜峰保留時間一致，鑒定待檢種子中含有正品大黃種子，色譜條件如下固定相十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相甲醇-O. 1%磷酸溶液，二者的體積比為(8(Γ90) :(1(Γ20);檢測波長254nm。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)所述酸水解，溶液中氫離子的濃度為2 3mol/L ;所述有機溶劑為三氯甲烷。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，將待檢種子粉碎，過四號篩，得粉末，加甲醇，粉末與甲醇的質量體積比為I :15(Tl85，加熱回流3(T90min，冷卻，稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，得續(xù)濾液，揮去溶劑，加濃度為6 10%的鹽酸，超聲處理f 3min，加等體積的三氯甲烷，加熱回流6(T80min，再用三氯甲烷萃取3次，每次所用三氯甲烷體積同鹽酸體積，得三氯甲烷層，回收溶劑至干，加甲醇制成供試品溶液。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，甲醇與O.1%磷酸溶液的體積比為85 :15。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于它還包括定性檢測方法，步驟如下 1)取待檢種子，粉碎，用甲醇提取，過濾，得濾液，揮去溶劑，酸溶液水解，用有機溶劑萃取，得水層； 2)取步驟I)所得水層，加f3倍體積的濃氨水，震搖，無紅棕色至棕褐色絮狀沉淀； 3)鑒定待檢種子為正品大黃種子。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于步驟I)所述酸水解，溶液中氫離子的濃度為O. 52^2mol/L ;有機溶劑為乙醚。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，將待檢種子粉碎成細粉，加甲醇，細粉與甲醇的質量體積比為1:15^25,浸泡30mirT90min，過濾，得濾液，蒸干，加水，再加濃鹽酸，鹽酸體積為水體積的l/2(Tl/5，加熱回流2(T40min，冷卻，用乙醚萃取，萃取2次，每次所用乙醚體積為水體積的3飛倍，得水層。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種正品大黃種子的檢測方法，它是采用高效液相色譜法檢測，包括如下步驟(1)取待檢種子，粉碎，用甲醇提取，過濾，得濾液，除去甲醇，酸水解，用有機溶劑萃取，得有機溶劑層，回收溶劑至干，再溶解，制成供試品溶液；(2)取蘆薈大黃素對照品，溶解，制備對照品溶液；(3)用高效液相色譜法檢測，在供試品溶液的色譜圖中，有色譜峰與蘆薈大黃素對照品色譜峰保留時間一致，鑒定待檢種子中含有正品大黃種子，色譜條件如下固定相十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相甲醇-0.1％磷酸溶液，二者的體積比為(80~90)(10~20)；檢測波長254nm。本發(fā)明正品大黃種子的檢測方法準確度高，操作方便，成本低廉，市場應用前景良好。
文檔編號G01N30/02GK102854268SQ20121037634
公開日2013年1月2日 申請日期2012年10月8日 優(yōu)先權日2012年10月8日
發(fā)明者李敏, 敬勇, 林秋霞 申請人:成都中醫(yī)藥大學