專利名稱：使用了熒光粒子的檢測(cè)對(duì)象物質(zhì)的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用了熒光粒子的檢測(cè)對(duì)象物質(zhì)的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
一直以來(lái)，作為對(duì)蛋白質(zhì)、酶、無(wú)機(jī)化合物等進(jìn)行定量的高靈敏度且容易的測(cè)定方法，廣泛使用熒光檢測(cè)法。該熒光檢測(cè)法是對(duì)被認(rèn)為含有能被特定波長(zhǎng)的光激發(fā)而發(fā)出熒光的檢測(cè)對(duì)象物質(zhì)(待測(cè)物質(zhì))的試樣照射上述特定波長(zhǎng)的激發(fā)光、并通過檢測(cè)此時(shí)的熒光來(lái)確認(rèn)待測(cè)物質(zhì)的存在的方法。另外，在待測(cè)物質(zhì)不是熒光體時(shí)，還廣泛采取下述方法使利用熒光色素進(jìn)行標(biāo)記并與待測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)與試樣接觸，之后與上述同樣地檢測(cè)熒光，由此確認(rèn)該結(jié)合、即待測(cè)物質(zhì)的存在。在這種熒光檢測(cè)法中，為了提高檢測(cè)的靈敏度，已知有利用由等離子體共振產(chǎn)生的電場(chǎng)增強(qiáng)的效應(yīng)的方法。該方法中，為了產(chǎn)生等離子體共振，準(zhǔn)備在透明支撐體上的規(guī)定區(qū)域上設(shè)有金屬層的傳感芯片，對(duì)支撐體與金屬膜的界面從與支撐體的金屬層形成面相反面的一側(cè)以全反射角以上的規(guī)定角度入射激發(fā)光。通過該激發(fā)光的照射，在金屬層上產(chǎn)生表面等離子體。通過該表面等離子體的產(chǎn)生所帶來(lái)的電場(chǎng)增強(qiáng)作用使熒光增強(qiáng)，從而信噪t匕(信號(hào)/噪音比，S/N比)提高。利用表面等離子體激發(fā)的熒光檢測(cè)法(以下記為“SPF法”)與利用落射激發(fā)的熒光檢測(cè)法(以下記為“落射熒光法”)相比，信號(hào)增強(qiáng)度能獲得約10倍，可以以高靈敏度進(jìn)行測(cè)定。例如在專利文獻(xiàn)I所記載的求得待測(cè)物質(zhì)的量的光信號(hào)檢測(cè)方法中，準(zhǔn)備具有傳感器部的傳感芯片，并使試樣與傳感芯片的傳感器部接觸，其中所述傳感器部具備設(shè)于電介質(zhì)板一個(gè)面的規(guī)定區(qū)域上的金屬層。通過該接觸，被賦予了與試樣所含待測(cè)物質(zhì)的量相對(duì)應(yīng)量的光響應(yīng)性標(biāo)記物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)結(jié)合在傳感器部上。接著，對(duì)規(guī)定區(qū)域照射激發(fā)光，檢測(cè)金屬層上產(chǎn)生的電場(chǎng)增強(qiáng)場(chǎng)內(nèi)所產(chǎn)生的光響應(yīng)性標(biāo)記物質(zhì)發(fā)出的光，從而求得待測(cè)物質(zhì)的量。另外，該方法中，作為光響應(yīng)性標(biāo)記物質(zhì)，還可以使用含有多個(gè)光響應(yīng)物質(zhì)而成的物質(zhì)，以使得利用透過由光響應(yīng)物質(zhì)產(chǎn)生的光的光透過材料來(lái)防止在光響應(yīng)物質(zhì)接近金屬層時(shí)所產(chǎn)生的金屬消光。另外，專利文獻(xiàn)2所記載的分析方法中，通過利用了針對(duì)待測(cè)物質(zhì)的多種抗體的免疫分析，可以拓寬能夠定量的待測(cè)物質(zhì)的濃度范圍?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:日本特開2010-190880號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特開平10-90268號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題在現(xiàn)有的利用了 SPF法的免疫診斷系統(tǒng)中，為了減輕制品所含的試劑量等的不均，采用的是根據(jù)用與測(cè)定對(duì)象物發(fā)生反應(yīng)的試驗(yàn)區(qū)的信號(hào)值除于與試劑量成比例的對(duì)照區(qū)的信號(hào)值獲得的校正系數(shù)來(lái)校正測(cè)定結(jié)果的不均的手法。因此存在下述問題如果由溫度等的變化所導(dǎo)致的信號(hào)變化是在試驗(yàn)區(qū)的信號(hào)值和對(duì)照區(qū)的信號(hào)值獨(dú)立地發(fā)生變化時(shí)，即便使用該校正系數(shù)也無(wú)法正確地進(jìn)行校正。一般來(lái)說是通過改變固定在基板上的抗體的量或者固定在標(biāo)記上的抗體的量來(lái)調(diào)整由溫度等的變化所導(dǎo)致的信號(hào)變化率。具體地說，通過減少固定在基板上的抗體量進(jìn)行調(diào)整，可以增大溫度依賴性。但是，也有即便改變固定在基板上的抗體量或固定在標(biāo)記上的抗體量也無(wú)法調(diào)整由溫度等的變化所導(dǎo)致的信號(hào)變化率的情況。本發(fā)明要解決的課題就在于要消除上述現(xiàn)有技術(shù)的問題。即，本發(fā)明要解決的課題在于提供在利用了調(diào)整由溫度等的變化所導(dǎo)致的信號(hào)變化率的校正系統(tǒng)的熒光分析中、對(duì)照區(qū)的信號(hào)值與試驗(yàn)區(qū)的信號(hào)值的溫度依賴性差異小的待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)方法。用于解決課題的手段為了解決上述課題，本發(fā)明人等進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過使用下述熒光粒子進(jìn)行熒光分析，可以減小對(duì)照區(qū)的信號(hào)值與試驗(yàn)區(qū)的信號(hào)值的溫度依賴性差異，所述熒光粒子結(jié)合有能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第I結(jié)合物質(zhì)；和能夠與對(duì)第I結(jié)合物質(zhì)具有結(jié)合性的第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與待 測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)而完成。S卩，根據(jù)本發(fā)明，提供一種待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定方法，其包含下述工序(I)使待測(cè)物質(zhì)和熒光粒子與存在于基板上的試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)接觸、并使熒光粒子與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的工序；(2)對(duì)試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)的熒光粒子的熒光進(jìn)行測(cè)定的工序；(3)使用對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值對(duì)試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值進(jìn)行校正的工序，熒光粒子為結(jié)合有下述(i)和(ii)的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子(i)能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)；(ii)能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)，在對(duì)照區(qū)上固定有相對(duì)于第I結(jié)合物質(zhì)可結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)。優(yōu)選的是在工序(2)中，通過測(cè)定試驗(yàn)區(qū)以及對(duì)照區(qū)的各自上的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子的熒光，求得各個(gè)區(qū)域的熒光信號(hào)值，使用對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值來(lái)校正試驗(yàn)區(qū)的突光信號(hào)值。優(yōu)選的是在試驗(yàn)區(qū)上固定有待測(cè)物質(zhì)或者具有針對(duì)結(jié)合于熒光粒子的第I結(jié)合物質(zhì)的抗原決定部位的待測(cè)物質(zhì)的類似化合物。優(yōu)選的是在工序(I)中，使接觸于基板的待測(cè)物質(zhì)與結(jié)合于基板的試驗(yàn)區(qū)的待測(cè)物質(zhì)或者具有抗原決定部位的待測(cè)物質(zhì)的類似化合物相對(duì)于結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子發(fā)
生競(jìng)爭(zhēng)。優(yōu)選的是上述第I結(jié)合物質(zhì)是能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的抗體，固定在對(duì)照區(qū)的第2結(jié)合物質(zhì)是可與作為第I結(jié)合物質(zhì)的抗體及不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)分別結(jié)合的抗體。優(yōu)選上述第3結(jié)合物質(zhì)是能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的抗體。優(yōu)選熒光粒子為熒光膠乳粒子。優(yōu)選工序(2)中通過表面等離子體熒光測(cè)定或落射熒光測(cè)定來(lái)對(duì)熒光進(jìn)行測(cè)定。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種待測(cè)物質(zhì)測(cè)定芯片，其在基板上具有試驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)，并用于待測(cè)物質(zhì)測(cè)定，該待測(cè)物質(zhì)測(cè)定包含使各個(gè)區(qū)域與含有待測(cè)物質(zhì)和熒光粒子的待測(cè)試樣相接觸，并使熒光粒子與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，測(cè)定各個(gè)區(qū)域的熒光粒子的熒光，使用對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值對(duì)試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值進(jìn)行校正，熒光粒子為結(jié)合有下述(i)和(ii)的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子(i)能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)；(ii)能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)，在對(duì)照區(qū)上固定有相對(duì)于第I結(jié)合物質(zhì)可結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)。另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種待測(cè)物質(zhì)測(cè)定試劑盒，其由待測(cè)物質(zhì)測(cè)定芯片和待測(cè)試樣中使用的熒光粒子構(gòu)成，所述待測(cè)物質(zhì)測(cè)定芯片在基板上具有試驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)，并用于待測(cè)物質(zhì)測(cè)定，該待測(cè)物質(zhì)測(cè)定包含使各個(gè)區(qū)域與含有待測(cè)物質(zhì)和熒光粒子的待測(cè)試樣相接觸，并使熒光粒子與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，測(cè)定各個(gè)區(qū)域的熒光粒子的熒光，使用對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值對(duì)試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值進(jìn)行校正，熒光粒子為結(jié)合有下述(i)和(ii)的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子(i)能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)；(ii)能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)，在對(duì)照區(qū)上固定有相對(duì)于第I結(jié)合物質(zhì)可結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，在利用了調(diào)整由溫度等的變化所導(dǎo)致的信號(hào)變化率的校正系統(tǒng)的熒光分析中，能夠提供使用了可減小對(duì)照區(qū)的信號(hào)值與試驗(yàn)區(qū)的信號(hào)值的溫度依賴性差異的熒光的待測(cè)物質(zhì)檢測(cè)方法。


圖1表示在使用了固定有I種作為第I結(jié)合物質(zhì)的抗體的熒光粒子的情況下、在使固定有能夠與上述作為第I結(jié)合物質(zhì)的抗體結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)的對(duì)照區(qū)的抗體濃度及測(cè)定時(shí)的溫度發(fā)生變化時(shí)的、作為第2結(jié)合物質(zhì)的固定于基板上的抗體的濃度與信號(hào)變化率之間的關(guān)系。圖2表示在使用了固定有2種抗體(針對(duì)待測(cè)物質(zhì)的抗體、即作為第I結(jié)合物質(zhì)的抗體；和針對(duì)待測(cè)物質(zhì)以外的物質(zhì)的抗體、即作為第3結(jié)合物質(zhì)的抗體)的熒光粒子的情況下、在使固定有能夠與上述作為第I結(jié)合物質(zhì)的抗體結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)的對(duì)照區(qū)的抗體濃度及測(cè)定時(shí)的溫度發(fā)生變化時(shí)的、作為第2結(jié)合物質(zhì)的固定于基板上的抗體的濃度與信號(hào)變化率之間的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式以下進(jìn)一步詳細(xì)地說明本發(fā)明。本發(fā)明的待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定方法包含下述工序(I)使待測(cè)物質(zhì)和熒光粒子與存在于基板上的試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)接觸、并使熒光粒子與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的工序；(2)對(duì)試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)的熒光粒子的熒光進(jìn)行測(cè)定的工序；(3)使用對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值對(duì)試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值進(jìn)行校正的工序，
熒光粒子為結(jié)合有下述(i)和(ii)的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子( i )能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)；(ii)能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)，在對(duì)照區(qū)上固定有相對(duì)于第I結(jié)合物質(zhì)可結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)。工序(2)中，可以通過對(duì)試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)的各自上的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子的熒光進(jìn)行測(cè)定，求得各個(gè)區(qū)域的熒光信號(hào)值，使用對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值對(duì)試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值進(jìn)行校正。作為上述對(duì)熒光信號(hào)值進(jìn)行校正的方法的一個(gè)例子，可舉出用試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值除以對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值，但并非限定于此，例如還可以由關(guān)系式算出對(duì)應(yīng)于對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值的變換系數(shù)來(lái)對(duì)試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值進(jìn)行校正，還可通過由試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值減去對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值來(lái)進(jìn)行校正。(熒光粒子)作為本發(fā)明中使用的熒光粒子，可以使用免疫反應(yīng)中常用的被熒光進(jìn)行了著色的粒子，例如可使用熒光聚苯乙烯珠粒等熒光高分子粒子、熒光玻璃珠粒等熒光玻璃粒子。作為熒光高分子粒子的材質(zhì)的具體例子，有使用了苯乙烯、甲基丙烯酸、(甲基)丙烯酸縮水甘油酯、丁二烯、氯乙烯、醋酸乙烯酯-丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸苯酯、甲基丙烯酸丁酯等單體的高分子或者使用了 2個(gè)以上單體的共聚物等合成高分子，優(yōu)選將它們均勻懸浮而成的膠乳。另外，還可舉出其他的有機(jī)高分子粉末或無(wú)機(jī)物質(zhì)粉末、微生物、血細(xì)胞或細(xì)胞膜片、脂質(zhì)體等。使用膠乳粒子時(shí)，作為膠乳的材質(zhì)的具體例子，可舉出聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯_(甲基)丙烯酸縮水甘油酯共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸鹽共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚醋酸乙烯酯-丙烯酸酯等。作為膠乳，優(yōu)選至少含有苯乙烯作為單體的共聚物，特別優(yōu)選苯乙烯與丙烯酸或甲基丙烯酸的共聚物。膠乳的制作方法并無(wú)特別限定，可通過任意的聚合方法進(jìn)行制作。但在抗體標(biāo)記時(shí)若存在表面活性劑則抗體固定變難，因而在制作膠乳時(shí)，優(yōu)選無(wú)乳化劑的乳液聚合、即不使用表面活性劑等乳化劑的乳液
口 o當(dāng)通過聚合獲得的膠乳本身為熒光性時(shí)，可直接作為熒光膠乳粒子使用。當(dāng)通過聚合獲得的膠乳為非熒光性時(shí)，通過在膠乳中添加熒光物質(zhì)(熒光色素等)，可以制作熒光膠乳粒子。即，熒光膠乳粒子可通過在含有水及水溶性有機(jī)溶劑的膠乳粒子的溶液中添加熒光色素并進(jìn)行攪拌等來(lái)制造。熒光粒子的平均粒徑根據(jù)粒子的材質(zhì)或?qū)Υ郎y(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量的濃度范圍、測(cè)定機(jī)器等而有所不同，但優(yōu)選為0.001 IOiim (更優(yōu)選為0.001 I Pm)的范圍。含有熒光色素的脂質(zhì)體或微囊劑等也可作為熒光粒子使用。熒光發(fā)色只要是吸收紫外光等而激發(fā)并在返回基底狀態(tài)時(shí)被發(fā)射，則無(wú)特別限定，例如可以使用黃綠(激發(fā)波長(zhǎng)為505nm/發(fā)射波長(zhǎng)為 515nm,以下相同)、藍(lán)(350 356nm/415 440nm)、紅(535 580nm/575 605nm)、澄(540nm/560nm)、紅-澄(565nm/580nm)、深紅(625nm/645nm)、暗紅(660nm/680nm)等突光發(fā)色。發(fā)出這些突光的突光粒子例如可從Invitrogen公司獲得,在該公司中以FluoSpheres(注冊(cè)商標(biāo))的商品名出售。(平均粒徑的測(cè)定方法)
本發(fā)明中使用的熒光粒子的平均粒徑可利用市售的粒度分布計(jì)等進(jìn)行測(cè)量。作為粒度分布的測(cè)定方法，已知有光學(xué)顯微鏡法、共聚焦激光顯微鏡法、電子顯微鏡法、原子力顯微鏡法、靜態(tài)光散射法、激光衍射法、動(dòng)態(tài)光散射法、離心沉降法、電脈沖測(cè)量法、色譜分析法、超聲波衰減法等，對(duì)應(yīng)于各個(gè)原理的裝置都有市售。從粒徑范圍及測(cè)定的容易性出發(fā)，本發(fā)明中優(yōu)選使用動(dòng)態(tài)光散射法。作為使用了動(dòng)態(tài)光散射的市售的測(cè)定裝置，可舉出Nanotrac UPA (日機(jī)裝株式會(huì)社)、動(dòng)態(tài)光散射式粒徑分布測(cè)定裝置LB-550 (株式會(huì)社堀場(chǎng)制作所)、濃厚系粒徑分析儀FPAR-1000 (大塚電子株式會(huì)社)等，本發(fā)明中求得的值是25°C的測(cè)定溫度下測(cè)得的中位徑(d = 50)的值。(待測(cè)物質(zhì)) 作為本發(fā)明的分析方法中的檢測(cè)對(duì)象的待測(cè)物質(zhì)的種類并無(wú)特別限定,例如可舉出皮質(zhì)醇、IGF-1、IGFBP-3、LH、TSH、ADH、GH、尿中 GH、ACTH、催乳激素、FSH、TBG、TSAb、T4、抗TPO抗體、微粒體抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體、了511、甲狀腺球蛋白、了3、打'4、打'3、1，25-(010 2維生素D、NTx、Intact PINP、骨鈣素、降鈣素、BAP、脫氧吡啶啉、PTH、PTHrP、5_HIAA、HVA、左旋多巴、MHPG, VMA、兒茶酚胺、血清素、變腎上腺素、11-去氧皮質(zhì)醇、17-1 3、17-011孕烯醇酮、醛甾酮、雄甾酮、雄烯二酮、11-0HCS、皮質(zhì)甾酮、可的松、DOC,DHEA-S、孕烯醇酮、5 a 二氫睪丸酮、HCG- ^亞單位、E2、E3、雌激素、E1、HCG、睪丸酮、孕甾烷二醇、孕甾烷三醇、黃體酮、CPR、VIP、胰島素、促胃液素、胰高血糖素、抗GAD抗體、抗IA-2抗體、抗胰島素抗體、心肌肌鈣蛋白T、心室肌球蛋白輕鏈1、H-FABP、HANP、BNP、NT-proBNP、肌紅蛋白等。作為待測(cè)物質(zhì)的特別優(yōu)選的一個(gè)例子為皮質(zhì)醇。(結(jié)合物質(zhì)) 本發(fā)明中，使用通過使能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)與熒光粒子結(jié)合而獲得的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子。能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第I結(jié)合物質(zhì)例如可以是針對(duì)待測(cè)物質(zhì)(抗原)的抗體、針對(duì)待測(cè)物質(zhì)(抗體)的抗原、針對(duì)待測(cè)物質(zhì)(蛋白質(zhì)、低分子化合物、抗生物素蛋白、生物素等)的適配體等對(duì)待測(cè)物質(zhì)具有親和性的化合物，并無(wú)特別限定。另外，本發(fā)明中使用的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子上還可進(jìn)一步結(jié)合本說明書中以下說明的能夠與第2結(jié)合物質(zhì)(即固定在對(duì)照區(qū)上的“能夠與可與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第I結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)”)結(jié)合但不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)。(第I結(jié)合物質(zhì))本發(fā)明的方法中使用的第I結(jié)合物質(zhì)的優(yōu)選例子為抗原、抗體或它們的復(fù)合體，但并非限定于這些。例如，當(dāng)?shù)贗結(jié)合物質(zhì)為抗體時(shí)，作為對(duì)待測(cè)物質(zhì)具有特異性的抗體，例如可以使用由利用該待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行了免疫的動(dòng)物的血清制備的抗血清、由抗血清純化得到的免疫球蛋白級(jí)分、通過使用利用該待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行了免疫的動(dòng)物的脾臟細(xì)胞的細(xì)胞融合獲得的單克隆抗體或者它們的片段[例如F(ab’)2、Fab、Fab’或Fv]等。這些抗體的制備可通過常規(guī)方法進(jìn)行。而且，還可以如該抗體為嵌合體抗體等時(shí)那樣加以修飾，另外還可使用市售的抗體、由動(dòng)物血清或培養(yǎng)上清利用公知的方法制得的抗體?？贵w可以與其動(dòng)物種類或亞綱等無(wú)關(guān)地使用。例如，本發(fā)明中可使用的抗體為小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、山羊、兔子、綿羊、牛、雞等可引起免疫反應(yīng)的生物來(lái)源的抗體，具體地為小鼠IgG、小鼠IgM、大鼠IgG、大鼠IgM、倉(cāng)鼠IgG、IgM兔子IgG、兔子IgM、山羊IgG、山羊IgM、綿羊IgG、綿羊IgM、牛IgG、牛IgM、雞IgY等，可以適用于多克隆或單克隆這兩者。片段化抗體是具有至少I個(gè)抗原結(jié)合部位的由完全型抗體導(dǎo)出的分子，具體地為Fab、F(ab’)2等。這些片段化抗體可以是通過酶或化學(xué)處理或者利用基因工程的手法獲得的分子。使抗體或抗原等第I結(jié)合物質(zhì)固定在粒子上的方法例如記載于日本特開2000-206115號(hào)公報(bào)或Molecular Probes公司FluoSpheres (注冊(cè)商標(biāo))聚苯乙稀微球Polystyrene MicrosphereF8813所附帶的實(shí)驗(yàn)報(bào)告等中，制備免疫凝集反應(yīng)用試劑的公知方法都可以使用。另外，作為使作為第I結(jié)合物質(zhì)的抗體固定在粒子上的原理，物理吸附及利用共價(jià)鍵的化學(xué)結(jié)合的任一種原理都可以采用。作為在使抗體固定在粒子上后將未被抗體覆蓋的粒子表面覆蓋的封閉劑，可以使用公知的物質(zhì)，例如可以使用BSA (牛血清白蛋白)或脫脂奶、酪蛋白、大豆來(lái)源成分、魚來(lái)源成分、聚乙二醇等、或者包含這些物質(zhì)或與這些物質(zhì)性質(zhì)相同的物質(zhì)的市售的免疫反應(yīng)用封閉劑等。這些封閉劑還可以根據(jù)需要利用熱或酸、堿等實(shí)施部分變性等前處理。(第2結(jié)合物質(zhì))本發(fā)明中，在對(duì)照區(qū)上固定能夠與可與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第I結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)。即，作為固定在對(duì)照區(qū)上的第2結(jié)合物質(zhì)，可以使用能夠與結(jié)合在熒光粒子上的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合物質(zhì)。能夠與第I結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)例如可優(yōu)選使用針對(duì)結(jié)合物質(zhì)(抗體)的抗體、相對(duì)于結(jié)合物質(zhì)(抗體)結(jié)合的蛋白質(zhì)(ProteinA、Protein G)等對(duì)第I結(jié)合物質(zhì)具有親和性的化合物。另外，結(jié)合于熒光粒子上的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)內(nèi)的一部分可優(yōu)選使用與第2結(jié)合物質(zhì)為配位基-非配位基的關(guān)系的化合物。將抗體等第2結(jié)合物質(zhì)固定在基板上的方法例如記載于Nunc公司提供的Tech NotesVol. 2-12等中，制備通常ELISA試劑的公知方法都可以使用。另外，基板上還可實(shí)施通過配置自組裝單分子膜(SAM)等進(jìn)行的表面修飾，作為將作為第2結(jié)合物質(zhì)的抗體固定在基板上的原理，物理吸附及利用共價(jià)鍵的化學(xué)結(jié)合的任一種原理都可以采用。作為在使抗體固定在基板上后將未被抗體覆蓋的基板表面覆蓋的封閉劑，可以使用公知的物質(zhì)，例如可以使用BSA (牛血清白蛋白)或脫脂奶、酪蛋白、大豆來(lái)源成分、魚來(lái)源成分、聚乙二醇等、或者包含這些物質(zhì)或與這些物質(zhì)性質(zhì)相同的物質(zhì)的市售的免疫反應(yīng)用封閉劑等。這些封閉劑還可以根據(jù)需要利用熱或酸、堿等實(shí)施部分變性等前處理。(第3結(jié)合物質(zhì))作為能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)，除了可以使用結(jié)合于待測(cè)物質(zhì)以外的物質(zhì)的抗體之外，還可使用它們的片段[例如F(ab’)2、Fab、Fab’、Fv或Fe]等第2結(jié)合物質(zhì)可以捕獲的化合物。(抗體在熒光粒子上的固定)以下例示出將抗體固定在粒子上的具體方法。在粒子按照固體成分濃度達(dá)到0.1 10質(zhì)量％的方式進(jìn)行分散而得到的溶液中添加調(diào)整至0. 01 20mg/mL濃度的抗體溶液并進(jìn)行混合。在溫度為4 50°C的條件下用5分鐘 48小時(shí)的時(shí)間持續(xù)攪拌。接著，通過離心分離等方法將粒子與溶液分離，將溶液中所含的未與粒子結(jié)合的抗體充分地除去。之后，將使用緩沖液對(duì)粒子進(jìn)行洗滌的操作重復(fù)(TlO次。優(yōu)選在將粒子和抗體混合、實(shí)施使抗體結(jié)合于粒子的操作后，使用不參與抗原抗體反應(yīng)的成分、優(yōu)選蛋白質(zhì)、更優(yōu)選為BSA(牛血清白蛋白)、Block Ace、脫脂奶及酪蛋白等封閉劑將粒子表面的抗體未結(jié)合的部分進(jìn)行保護(hù)。本發(fā)明中，也可以將能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)和能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)預(yù)先進(jìn)行混合后再通過上述方法使其與粒子結(jié)合；還可以使能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)和能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)依次與粒子結(jié)合，但優(yōu)選預(yù)先混合后再與粒
丁彡口口。在將抗原或抗體等固定在粒子上時(shí)，可根據(jù)需要添加穩(wěn)定化劑。穩(wěn)定化劑是指蔗糖或多糖類等合成或天然高分子等，只要是穩(wěn)定抗原或抗體的物質(zhì)則無(wú)特別限定，還可使用 Immunoassay Stabilizer (ABI 公司)等的市售品。(分析的方式)本發(fā)明的分析方法包含下述工序(1)使待測(cè)物質(zhì)和熒光粒子與存在于基板上的試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)接觸、并使熒光粒子與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的工序；(2)對(duì)試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)的熒光粒子的熒光進(jìn)行測(cè)定的工序；(3)使用對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值對(duì)試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值進(jìn)行校正的工序。對(duì)于本發(fā)明的待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)方法，以包括檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)是否存在或測(cè)定待測(cè)物質(zhì)的量(即定量)等在內(nèi)的最為廣義的概念來(lái)進(jìn)行解釋，廣泛地包括在使用了基板的測(cè)定方法中通常已知的免疫學(xué)測(cè)定方法。(接觸工序)作為夾心法及競(jìng)爭(zhēng)法中的使結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子和待測(cè)物質(zhì)與基板接觸的方法，例如可通過Sigma-Aldrich公司提供的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)信息p. 258所記載的通常的ELISA分析方法(即將分散或溶解有熒光粒子和待測(cè)物質(zhì)的液體添加在基板上使其接觸的方法)來(lái)進(jìn)行。另外，還可通過將要接觸的場(chǎng)所設(shè)置在微流路內(nèi)，并使分散或溶解有熒光粒子和待測(cè)物質(zhì)的液體流過來(lái)使其接觸。以下對(duì)作為本發(fā)明分析方法的具體實(shí)施方式
的夾心法及競(jìng)爭(zhēng)法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并非限定于這些。(夾心法)夾心法并無(wú)特別限定，例如可通過以下步驟測(cè)定待測(cè)物質(zhì)。首先，預(yù)先準(zhǔn)備好對(duì)待測(cè)物質(zhì)具有特異性的第I結(jié)合物質(zhì)、能夠與第3結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)、以及雖然不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合但與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)。接著，使第I結(jié)合物質(zhì)及第3結(jié)合物質(zhì)結(jié)合于熒光粒子，制作結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子。另外，將第2結(jié)合物質(zhì)固定在基板上，制成對(duì)照區(qū)。將本發(fā)明用于夾心法時(shí)，另外準(zhǔn)備與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合但不與第I結(jié)合物質(zhì)及第3結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的第4結(jié)合物質(zhì)，固定在基板上而制成試驗(yàn)區(qū)。接著，使可能含有待測(cè)物質(zhì)的待測(cè)試樣(或其抽提液)和結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子與基板上的試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)接觸。當(dāng)待測(cè)試樣中存在待測(cè)物質(zhì)時(shí)，在試驗(yàn)區(qū)上，在待測(cè)物質(zhì)與結(jié)合于結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子的第I結(jié)合物質(zhì)之間、以及待測(cè)物質(zhì)與試驗(yàn)區(qū)上的第4結(jié)合物質(zhì)之間發(fā)生反應(yīng)(使用了抗原及抗體時(shí)為抗原抗體反應(yīng))，對(duì)應(yīng)于待測(cè)物質(zhì)的量的熒光粒子被固定在試驗(yàn)區(qū)上。另一方面，在對(duì)照區(qū)上，結(jié)合于結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子的第I結(jié)合物質(zhì)或第3結(jié)合物質(zhì)與固定在對(duì)照區(qū)上的第2結(jié)合物質(zhì)之間發(fā)生反應(yīng)，從而熒光粒子被固定在對(duì)照區(qū)上。夾心法中，固定在試驗(yàn)區(qū)上的第4結(jié)合物質(zhì)與待測(cè)物質(zhì)的反應(yīng)、以及待測(cè)物質(zhì)與結(jié)合于結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子的第I結(jié)合物質(zhì)的反應(yīng)結(jié)束、并且固定在對(duì)照區(qū)上的第2結(jié)合物質(zhì)與結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子上的第I及第3結(jié)合物質(zhì)的反應(yīng)結(jié)束后，將2個(gè)基板上的區(qū)域中未結(jié)合的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子除去、洗滌。接著，檢測(cè)來(lái)自結(jié)合于試驗(yàn)區(qū)的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子的信號(hào)強(qiáng)度，使用來(lái)自結(jié)合于對(duì)照區(qū)的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子的信號(hào)強(qiáng)度的測(cè)定值來(lái)進(jìn)行校正，從而可以測(cè)定正確的待測(cè)物質(zhì)的濃度。需要說明的是，熒光強(qiáng)度與待測(cè)物質(zhì)的濃度具有正相關(guān)關(guān)系。作為第4結(jié)合物質(zhì)，只要是能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合但不與第I結(jié)合物質(zhì)及第3結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)則可以沒有特別限定地使用。優(yōu)選地可以使用不與第I結(jié)合物質(zhì)及第3結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的抗體或者它們的片段[例如F(ab’)2、Fab、Fab\ Fv或Fe]等化合物。(競(jìng)爭(zhēng)法)競(jìng)爭(zhēng)法中并無(wú)特別限定，例如可以通過以下步驟對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。競(jìng)爭(zhēng)法作為檢測(cè)無(wú)法用夾心法分析的低分子化合物的抗原的手法，在本領(lǐng)域中是眾所周知的。首先，預(yù)先制備對(duì)待測(cè)物質(zhì)具有特異性的第I結(jié)合物質(zhì)、能夠與第I結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)、以及不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合但能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)。接著，使第I結(jié)合物質(zhì)和第3結(jié)合物質(zhì)結(jié)合于突光粒子,制成結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記突光粒子。接著，將能夠與第3結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)固定在固相、例如基板上，制成對(duì)照區(qū)。另外，將對(duì)第I結(jié)合物質(zhì)具有結(jié)合性的待測(cè)物質(zhì)本身、或者具有與待測(cè)物質(zhì)相類似部位且具有與待測(cè)物質(zhì)同樣的針對(duì)第I結(jié)合物質(zhì)的抗原決定部位的化合物固定在相同基板上的同一面上的不同位置，制成試驗(yàn)區(qū)。接著，使可能含有待測(cè)物質(zhì)的待測(cè)試樣(或其抽提液)和結(jié)合有第I結(jié)合物質(zhì)及第3結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子與基板接觸。當(dāng)待測(cè)試樣中不存在待測(cè)物質(zhì)時(shí)，由結(jié)合于結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子的第I結(jié)合物質(zhì)與固定在試驗(yàn)區(qū)上的對(duì)第I結(jié)合物質(zhì)具有結(jié)合性的待測(cè)物質(zhì)其本身或者具有與待測(cè)物質(zhì)同樣的針對(duì)第I結(jié)合物質(zhì)抗體的抗原決定部位的類似化合物而在基板上發(fā)生反應(yīng)。另一方面，當(dāng)存在待測(cè)物質(zhì)時(shí)，由于待測(cè)物質(zhì)會(huì)與第I結(jié)合物質(zhì)結(jié)合，因而與對(duì)第I結(jié)合物質(zhì)具有結(jié)合性的待測(cè)物質(zhì)其本身或者具有與待測(cè)物質(zhì)相類似的部位且具有與待測(cè)物質(zhì)相同的針對(duì)第I結(jié)合物質(zhì)抗體的抗原決定部位的化合物在試驗(yàn)區(qū)上的反應(yīng)被阻礙，從而結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子不會(huì)被固定在試驗(yàn)區(qū)上。另一方面，在對(duì)照區(qū)上，在結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子上的第3結(jié)合物質(zhì)與固定在對(duì)照區(qū)上的第2結(jié)合物質(zhì)之間會(huì)發(fā)生反應(yīng)，結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子被固定在對(duì)照區(qū)上。在競(jìng)爭(zhēng)法中，預(yù)先準(zhǔn)備多個(gè)待測(cè)物質(zhì)濃度不同的待測(cè)物質(zhì)量已知的試樣，在使該試樣及結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子在試驗(yàn)區(qū)上及對(duì)照區(qū)上接觸的同時(shí)，在不同的多個(gè)時(shí)刻測(cè)定來(lái)自試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)。由該多個(gè)測(cè)定結(jié)果求得在各待測(cè)物質(zhì)濃度下熒光量的時(shí)間變化(斜率)。以該時(shí)間變化為Y軸、以待測(cè)物質(zhì)濃度為X軸作圖，使用最小二乘法等適當(dāng)?shù)臄M合方法，獲得待測(cè)物質(zhì)濃度對(duì)熒光量時(shí)間變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)如此獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由使用了目標(biāo)待測(cè)試樣的熒光量時(shí)間變化結(jié)果，可以定量待測(cè)試樣所含的待測(cè)物質(zhì)的量。(具有抗原決定部位的待測(cè)物質(zhì)的類似化合物)本發(fā)明中，作為競(jìng)爭(zhēng)法中可使用的具有抗原決定部位的待測(cè)物質(zhì)的類似化合物，可以使用具有針對(duì)本發(fā)明的第I結(jié)合物質(zhì)的抗原決定部位的待測(cè)物質(zhì)的類似化合物，例如可優(yōu)選使用待測(cè)物質(zhì)(皮質(zhì)醇等)的半抗原。(基板)
作為進(jìn)行后述的SPF法時(shí)的基板，優(yōu)選使用表面上具有金屬膜的基板。作為構(gòu)成金屬膜的金屬，可以使用可產(chǎn)生表面等離子體共振的物質(zhì)。優(yōu)選地可舉出金、銀、銅、鋁、鉬等自由電子金屬，特別優(yōu)選金。這些金屬可単獨(dú)使用或組合使用。另外，考慮到在上述基板上的附著性，還可在基板與金屬所形成的層之間設(shè)置由鉻等形成的夾層。金屬膜的膜厚是任意的，但例如優(yōu)選為0.1nm以上且500nm以下、特別優(yōu)選為Inm以上且200nm以下。超過500nm時(shí)，無(wú)法充分地檢測(cè)介質(zhì)的表面等離子體現(xiàn)象。另外，在設(shè)置由鉻等形成的夾層時(shí)，該夾層的厚度優(yōu)選為0.1nm以上且IOnm以下。金屬膜的形成通過常規(guī)方法進(jìn)行即可，例如可通過濺射法、蒸鍍法、離子鍍法、電鍍法、非電解鍍法等進(jìn)行。金屬膜優(yōu)選配置在基體上。這里，“配置在基體上”是指除了按照金屬膜直接接觸于基體上的方式進(jìn)行配置的情況之外，還包括金屬膜不與基體直接接觸、而是隔著其他層進(jìn)行配置的情況。作為本發(fā)明中能夠使用的基體，例如考慮到表面等離子體共振生物傳感器用時(shí)，可以使用作為ー種通常的光學(xué)玻璃的BK7 (硼硅酸玻璃)等光學(xué)玻璃、或者合成樹月旨、具體地為聚甲基丙烯酸甲酷、聚對(duì)苯ニ甲酸こニ醇酯、聚碳酸酷、環(huán)烯烴聚合物等對(duì)激光透明的材料所形成的基體。這種基板優(yōu)選為對(duì)偏振光不顯示各向異性且加工性優(yōu)異的材料。
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作為用于利用SPF法進(jìn)行熒光檢測(cè)的基板的ー個(gè)例子，可以舉出以聚甲基丙烯酸甲酷(PMMA)為基體且蒸鍍有金膜的基板等。(熒光的檢測(cè)方法)作為本發(fā)明的熒光檢測(cè)方法，例如優(yōu)選使用能夠檢測(cè)熒光強(qiáng)度的設(shè)備、具體地使用酶標(biāo)儀或用于進(jìn)行利用表面等離子體激發(fā)的熒光檢測(cè)法(SPF法)的生物傳感器等來(lái)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度的檢測(cè)通常在抗原抗體反應(yīng)后的一定時(shí)間、例如數(shù)分鐘 數(shù)小時(shí)后結(jié)束。通過將上述免疫復(fù)合體的形成程度以熒光強(qiáng)度的形式進(jìn)行檢測(cè)，可以由熒光強(qiáng)度與待測(cè)物質(zhì)的濃度的關(guān)系對(duì)待測(cè)物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量。另外，熒光的測(cè)定方式可以是酶標(biāo)儀測(cè)定，也可以是流式測(cè)定。另外，SPF法可以以比利用落射激發(fā)的熒光檢測(cè)法(以下稱作“落射熒光法”)更高的靈敏度進(jìn)行測(cè)定。作為上述表面等離子體熒光(SPF)生物傳感器，例如可以使用日本特開2008-249361號(hào)公報(bào)所記載的傳感器，其具備由透過規(guī)定波長(zhǎng)的激發(fā)光的材料所形成的光波導(dǎo)路；形成在該光波導(dǎo)路的ー個(gè)表面上的金屬膜；產(chǎn)生光束的光源；使上述光束通過光波導(dǎo)路并使其相對(duì)于該光波導(dǎo)路與金屬膜的界面以產(chǎn)生表面等離子體的入射角入射的光學(xué)體系；以及對(duì)由于通過該表面等離子體而增強(qiáng)的消散波的激發(fā)所產(chǎn)生的熒光進(jìn)行檢測(cè)的熒光檢測(cè)手段。(待測(cè)物質(zhì)的量的測(cè)定方法)作為本發(fā)明的利用SPF法的待測(cè)物質(zhì)的定量方法的ー個(gè)例子，可以利用以下的方法對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定量。具體地說，準(zhǔn)備含有各濃度已知的待測(cè)物質(zhì)的試樣，在使檢測(cè)熒光的部位流下的同時(shí)，在不同的多個(gè)時(shí)刻測(cè)定來(lái)自熒光檢測(cè)部位的熒光信號(hào)。由該多個(gè)測(cè)定結(jié)果求得在各待測(cè)物質(zhì)濃度下熒光量的時(shí)間變化(斜率)。以該時(shí)間變化為Y軸、以待測(cè)物質(zhì)濃度為X軸作圖，使用最小二乗法等適當(dāng)?shù)臄M合方法，獲得待測(cè)物質(zhì)濃度對(duì)熒光量時(shí)間變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。作為光信號(hào)系統(tǒng)，根據(jù)對(duì)應(yīng)于各個(gè)待測(cè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以確定目標(biāo)待測(cè)試樣的待測(cè)物質(zhì)的量。本發(fā)明的使用了熒光粒子的利用表面等離子體激發(fā)的熒光檢測(cè)(SPF)體系是對(duì)來(lái)自依賴于固定在基板上的金屬薄膜上的待測(cè)物質(zhì)量的熒光物質(zhì)的熒光進(jìn)行檢測(cè)的分析方法，將根據(jù)溶液中的反應(yīng)的進(jìn)行產(chǎn)生的光學(xué)透明度的變化例如以濁度的方式進(jìn)行檢測(cè)，是與所謂的膠乳凝集法不同的方法。膠乳凝集法中，膠乳試劑中的抗體致敏膠乳與檢體中的抗原通過抗體反應(yīng)而結(jié)合、凝集。該凝集塊隨著時(shí)間而増大，由對(duì)該凝集塊照射近紅外光所得的每單位時(shí)間的吸光度變化來(lái)對(duì)抗原濃度進(jìn)行定量的方式是膠乳凝集法。根據(jù)本發(fā)明，可以提供與膠乳凝集法相比非常簡(jiǎn)便的待測(cè)物質(zhì)檢測(cè)方法。本發(fā)明的使用了熒光粒子的檢測(cè)對(duì)象物質(zhì)的檢測(cè)方法可以使用試劑盒或芯片進(jìn)行實(shí)施，該試劑盒或芯片組裝有在基板上具有試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)這2個(gè)測(cè)定區(qū)域、且在對(duì)照區(qū)上固定有能夠與結(jié)合于熒光粒子的第I結(jié)合物質(zhì)結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)的基板。基板上的試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)優(yōu)選由產(chǎn)生表面等離子體共振的物質(zhì)構(gòu)成。該待測(cè)物質(zhì)檢測(cè)用試劑盒或芯片包含使這些區(qū)域與含有待測(cè)物質(zhì)及熒光粒子的待測(cè)試樣接觸，并使待測(cè)物質(zhì)與熒光粒子、或者試驗(yàn)區(qū)與熒光粒子、進(jìn)而對(duì)照區(qū)與熒光粒子發(fā)生反應(yīng)，測(cè)定試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)的熒光強(qiáng)度，使用對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值校正試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值。該待測(cè)物質(zhì)檢測(cè)用試劑盒或芯片中，熒光粒子可以是結(jié)合有(i)能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)和(ii)與固定在對(duì)照區(qū)上的第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子，且對(duì)照區(qū)固定有第2結(jié)合物質(zhì)。構(gòu)成使用了熒光粒子的待測(cè)物質(zhì)檢測(cè)用試劑盒或芯片的各原材料的例子、優(yōu)選范圍可以使用在使用了熒光粒子的待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)方法等中記載的例子或范圍。通過以下的實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受實(shí)施例的限定。實(shí)施例<比較例1>(進(jìn)行了碳 化ニ亞胺處理的熒光膠乳粒子的制作)在固體成分濃度為2質(zhì)量％的熒光膠乳粒子水溶液(InVitoogen公司制品、平均粒徑為200nm) 250 u L中添加50mM的MES緩沖液(pH為6. 0)溶液250 u L，使固體成分達(dá)到I質(zhì)量％后，添加lOmg/mL的EDC (1-こ基-3- (3-ニ甲基氨基丙基)碳化ニ亞胺鹽酸鹽、型號(hào)01-62-0011、和光純藥)水溶液8 ii L，在室溫下攪拌(1200rpm、25°C、15分鐘)，獲得碳化ニ亞胺處理熒光膠乳粒子。(抗皮質(zhì)醇抗體結(jié)合突光膠乳粒子的制作)在進(jìn)行了碳化ニ亞胺處理的熒光膠乳粒子500i! L中添加作為第I結(jié)合物質(zhì)的抗皮質(zhì)醇抗體(以下記為抗COR抗體、Hytest制、品名Ant1-Cortisol MAb XM210、6. 3mg/mL)9. L，在室溫下攪拌(1200rpm、25°C、2小時(shí))。添加2mol/L的Glycine (和光純藥)水溶液25 u L，攪拌30分鐘后，通過離心分離(15000rpm、4°C、15分鐘)使熒光膠乳粒子沉降。除去上清，添加PBS溶液(磷酸緩沖液、和光純藥、pH為7. 4) 500 u L，利用超聲波洗滌機(jī)使熒光膠乳粒子再分散。進(jìn)而進(jìn)行離心分離(1500011)111、4で、15分鐘)，除去上清后，添加含1質(zhì)量％BSA(牛血清白蛋白、和光純藥)的PBS(pH為7. 4)溶液500 y L，使熒光膠乳粒子再分散，從而獲得抗COR抗體結(jié)合熒光膠乳粒子的I質(zhì)量％溶液(反應(yīng)試劑)。(基板的制作)
在以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA、三菱Rayon公司制、ACRYPET VH-OOI)為基體的基板的單面上，按照試驗(yàn)區(qū)、對(duì)照區(qū)都達(dá)到寬度為4_、厚度為70nm的方式蒸鍍?cè)囼?yàn)區(qū)中、相鄰對(duì)照區(qū)中使用的金。將該基板裁剪成寬為5mm，從而制作了基板。在該基板的試驗(yàn)區(qū)的金蒸鍍膜上，滴加含皮質(zhì)醇半抗原(Fitzgerald公司制、80-1C10)的液體(濃度50ii g/mL(50mM MES緩沖液(pH6)中)，150mM NaCl )，25°C下孵育I小時(shí)使其物理吸附來(lái)進(jìn)行固定。另一方面，在對(duì)照區(qū)的金蒸鍍膜上滴加含有作為第2結(jié)合物質(zhì)的抗小鼠抗體(Ant1-mouse IgGF(ab，)2、制品名AffiniPure F(ab，) 2Fragment Rabbit Ant1-mouse IgG (H+L)、JacksonImmuno Research公司制)的液體(濃度0. 19、0. 75和6. 0 u g/mL的PBS溶液)，25°C下孵育I小時(shí)使其物理吸附來(lái)進(jìn)行固定。(基板的洗滌、封閉)在將如此制備的3種基板安裝于傳感芯片的流路之前，使用預(yù)先制備的洗滌用溶液(含0. 05質(zhì)量％Tween20 (聚氧こ烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酷、和光純藥公司制)的PBS溶液(pH為7. 4))300 ii L重復(fù)洗滌3次。洗滌結(jié)束后，為了進(jìn)行金蒸鍍膜上的抗小鼠抗體、皮質(zhì)醇半抗原的未吸附部分的封閉，添加含I質(zhì)量％酪蛋白(Thermo Scientific公司制)的PBS溶液(pH為7. 4) 300 iiL，室溫下靜置I小吋。用上述洗滌用溶液進(jìn)行洗滌后，添加作為穩(wěn)定劑的Immunoassay Stabilizer (ABI公司制)300 V- L,在室溫下放置30分鐘后除去溶液，使用干燥機(jī)將水分完全除去。(傳感芯片的制作)將制作的3種基板按照日本公開專利公報(bào)日本特開2010-190880號(hào)的第2實(shí)施方式的構(gòu)成密封在流路內(nèi)，從而制作了流路型傳感芯片。(測(cè)定)將待測(cè)物質(zhì)的皮質(zhì)醇濃度為3 U g/dL的血清和抗COR抗體標(biāo)記熒光膠乳粒子預(yù)先混合。在26°C、30°C、34°C的各溫度條件下，滴加在所制作的流路型傳感芯片上，一邊進(jìn)行泵抽吸ー邊以lOyL/min的速度使其流下。流下時(shí)，測(cè)定試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)的熒光強(qiáng)度，求得在各溫度條件下熒光強(qiáng)度信號(hào)的単位時(shí)間內(nèi)的強(qiáng)度變化率的系數(shù)。對(duì)于該系數(shù)，在求得根據(jù)溫度變化變動(dòng)的比例時(shí)，確認(rèn)了在試驗(yàn)區(qū)由溫度導(dǎo)致的系數(shù)的變化率為7。/。/1V。另一方面，對(duì)于對(duì)照區(qū)，求得滴加抗小鼠抗體的各濃度為0. 19,0. 75及6. Oii g/mL的液體所制作的基板的由溫度導(dǎo)致的系數(shù)的變化率。結(jié)果示于圖1。在對(duì)照區(qū)的任一抗小鼠抗體的濃度下，熒光量的信號(hào)強(qiáng)度的變化率都是每1°C均低于4%，與試驗(yàn)區(qū)的溫度特性偏離很大。<實(shí)施例1 >(使用了標(biāo)記有2種抗體的熒光膠乳粒子的溫度特性的探討)在比較例制作的進(jìn)行了碳化ニ亞胺處理的熒光膠乳粒子500 y L中添加作為第I結(jié)合物質(zhì)的抗COR抗體(6. 3mg/mL) 9. 5 u L、和作為第3結(jié)合物質(zhì)的抗TSH抗體(5. 48mg/mL、制品名Mab to TSH、廠家0EM CONCEPTS. ) 54. 7 y L，在 25°C下攪拌 2 小時(shí)(1200rpm)。添加2mol/L的Glycine水溶液25 u L,攪拌30分鐘后,進(jìn)行離心分離(15000rpm、4°C、15分鐘)，使熒光膠乳粒子沉降。除去上清，添加PBS溶液(pH為7. 4) 500 u L，利用超聲波洗滌機(jī)使熒光膠乳粒子再分散。進(jìn)而進(jìn)行離心分離(15000rpm、4°C、15分鐘)，除去上清后，添加含I質(zhì)量％BSA的PBS (pH為7. 4)溶液500 u L，使熒光膠乳粒子再分散，從而獲得抗COR抗體結(jié)合熒光膠乳粒子的I質(zhì)量％溶液。
基板的制作、基板的封閉、傳感芯片的制作及測(cè)定與比較例I同樣地進(jìn)行，皮質(zhì)醇檢測(cè)用的基板使用與比較例相同的基板。與比較例同樣地進(jìn)行測(cè)定。在確認(rèn)試驗(yàn)區(qū)的由溫度導(dǎo)致的熒光信號(hào)強(qiáng)度的系數(shù)的變化率時(shí)，確認(rèn)了 與比較例同樣，相對(duì)于I°C溫度變化、檢體濃度變化7%。另外，與比較例同樣地使用如圖2所示那樣改變了對(duì)照區(qū)的抗小鼠抗體的量的基板來(lái)確認(rèn)由溫度導(dǎo)致的熒光信號(hào)強(qiáng)度的系數(shù)的變化率時(shí)，確認(rèn)了依賴于檢體濃度的信號(hào)變化率在基板抗體濃度為
0.19 u g/mL時(shí)，每1°C為7. 5%的變化率。在其他濃度下，為4%以下的變化率。由該測(cè)定結(jié)果確認(rèn)了 通過最佳地設(shè)定抗小鼠抗體的量，可以利用對(duì)照區(qū)的信號(hào)值校正試驗(yàn)區(qū)的信號(hào)信息，從而可以提供溫度依賴性非常小的分析方法。
權(quán)利要求
1.一種待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定方法，其包含下述工序 (1)使待測(cè)物質(zhì)和熒光粒子與存在于基板上的試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)接觸、并使熒光粒子與所述待測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的工序； (2)對(duì)所述試驗(yàn)區(qū)及所述對(duì)照區(qū)的所述熒光粒子的熒光進(jìn)行測(cè)定的工序； (3)使用所述對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值對(duì)所述試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值進(jìn)行校正的工序， 其中，所述熒光粒子為結(jié)合有下述(i)和(ii)的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子 (i)能夠與所述測(cè)物質(zhì)結(jié)合的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)； ( )能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與所述待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)， 在所述對(duì)照區(qū)上固定有相對(duì)于所述第I結(jié)合物質(zhì)可結(jié)合的所述第2結(jié)合物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定方法，其中，在所述試驗(yàn)區(qū)上固定有所述待測(cè)物質(zhì)、或者具有針對(duì)所述第I結(jié)合物質(zhì)的抗原決定部位的所述待測(cè)物質(zhì)的類似化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定方法，其中，在所述工序(I)中，使接觸于基板的所述待測(cè)物質(zhì)與固定在基板的所述試驗(yàn)區(qū)上的所述待測(cè)物質(zhì)或者該待測(cè)物質(zhì)的類似化合物相對(duì)于所述結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求廣3中任一項(xiàng)所述的待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定方法，其中， 所述第I結(jié)合物質(zhì)為能夠與所述待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的抗體， 固定在所述對(duì)照區(qū)的所述第2結(jié)合物質(zhì)是能夠與作為所述第I結(jié)合物質(zhì)的抗體和不與所述待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的所述第3結(jié)合物質(zhì)分別結(jié)合的抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求Γ3中任一項(xiàng)所述的待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定方法，其中，所述第3結(jié)合物質(zhì)是能夠與所述第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與所述待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定方法，其中，所述第3結(jié)合物質(zhì)是能夠與所述第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與所述待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求廣3中任一項(xiàng)所述的待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定方法，其中，所述熒光粒子為熒光膠乳粒子。
8.根據(jù)權(quán)利要求廣3中任一項(xiàng)所述的待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定方法，其中，在工序(2)中，通過利用表面等離子體激發(fā)的熒光檢測(cè)法或者利用落射激發(fā)的熒光檢測(cè)法來(lái)對(duì)熒光進(jìn)行測(cè)定。
9.一種待測(cè)物質(zhì)測(cè)定芯片，其在基板上具有試驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)，并用于待測(cè)物質(zhì)測(cè)定，該待測(cè)物質(zhì)測(cè)定包含使各個(gè)區(qū)域與含有待測(cè)物質(zhì)和熒光粒子的待測(cè)試樣接觸，并使熒光粒子與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，測(cè)定各個(gè)區(qū)域的所述熒光粒子的熒光，使用所述對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值對(duì)所述試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值進(jìn)行校正， 其中，所述熒光粒子為結(jié)合有下述(i)和(ii)的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子 (i)能夠與所述測(cè)物質(zhì)結(jié)合的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)； (ii)能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與所述待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)， 在對(duì)照區(qū)上固定有相對(duì)于所述第I結(jié)合物質(zhì)可結(jié)合的所述第2結(jié)合物質(zhì)。
10.一種待測(cè)物質(zhì)測(cè)定試劑盒，其由待測(cè)物質(zhì)測(cè)定芯片和待測(cè)試樣中使用的熒光粒子構(gòu)成，所述待測(cè)物質(zhì)測(cè)定芯片在基板上具有試驗(yàn)區(qū)和對(duì)照區(qū)，并用于待測(cè)物質(zhì)測(cè)定，該待測(cè)物質(zhì)測(cè)定包含使各個(gè)區(qū)域與含有待測(cè)物質(zhì)和所述熒光粒子的所述待測(cè)試樣接觸，并使所述熒光粒子與所述待測(cè)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，測(cè)定各個(gè)區(qū)域的所述熒光粒子的熒光，使用所述對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值對(duì)所述試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值進(jìn)行校正，其中，所述熒光粒子為結(jié)合有下述(i)和(ii)的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子 (i)能夠與所述測(cè)物質(zhì)結(jié)合的I種以上的第I結(jié)合物質(zhì)；( )能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與所述待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)，在所述對(duì)照區(qū)上固定有相對(duì)于所述第I結(jié)合物質(zhì)可結(jié)合的所述第2結(jié)合物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種待測(cè)物質(zhì)的測(cè)定方法，其在利用了調(diào)整由溫度導(dǎo)致的信號(hào)變化率的校正系統(tǒng)的免疫熒光分析中對(duì)照區(qū)的信號(hào)值與試驗(yàn)區(qū)的信號(hào)值的溫度依賴性差異小，其包含(1)使待測(cè)物質(zhì)和熒光粒子與存在于基板上的試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)接觸并使熒光粒子與待測(cè)物質(zhì)反應(yīng)的工序；(2)除去未反應(yīng)的熒光粒子的工序；(3)測(cè)定試驗(yàn)區(qū)及對(duì)照區(qū)的熒光粒子的熒光的工序；(4)使用對(duì)照區(qū)的熒光信號(hào)值校正試驗(yàn)區(qū)的熒光信號(hào)值的工序，其中熒光粒子為結(jié)合有(i)能夠與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的1種以上的第1結(jié)合物質(zhì)和(ii)能夠與第2結(jié)合物質(zhì)結(jié)合但不與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合的第3結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合物質(zhì)標(biāo)記熒光粒子，在對(duì)照區(qū)上固定有相對(duì)于第1結(jié)合物質(zhì)可結(jié)合的第2結(jié)合物質(zhì)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103033492SQ20121036399
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者渡邊裕也, 笠置典之 申請(qǐng)人:富士膠片株式會(huì)社