專利名稱：用拉曼光譜法對(duì)待測(cè)樣品中高鐵血紅蛋白含量MetHb%進(jìn)行測(cè)定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)血液保存或血液代用品中高鐵血紅蛋白(MetHb)含量的測(cè)定方法，特別是涉及一種用拉曼光譜法測(cè)定高鐵血紅蛋白(MetHb)含量的方法。
背景技術(shù)：
目前，供血短缺的情況日益凸顯，血液代用品的研發(fā)勢(shì)在必行，高鐵血紅蛋白(MetHb)含量這一指標(biāo)在血液代用品質(zhì)量控制中必不可少。其中，基于血紅蛋白的氧載體(HBOCs)是目前研究較多的一類血液代用品，美國(guó)FDA已將高鐵血紅蛋白(MetHb)含量作為HBOCs產(chǎn)品必檢指標(biāo)?，F(xiàn)有對(duì)血液或血液代用品中MetHb含量的測(cè)定方法主要都是利用可見光或紫外光光源產(chǎn)生的光譜測(cè)定，主要有氰化物法、計(jì)算分光光度法和等吸 收點(diǎn)法(闞雪梅，et al.，高鐵血紅蛋白含量測(cè)定方法研究進(jìn)展.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，(04) :p. 385-388.)。血液代用品制備過程中會(huì)涉及到血紅蛋白的改構(gòu)，改構(gòu)的血紅蛋白光學(xué)性質(zhì)改變，并且其粒徑小于可見光波長(zhǎng)，測(cè)量時(shí)引起光散射，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。以上方法用于血液代用品質(zhì)控時(shí)分別存在以下缺陷氰化物法測(cè)定原理是利用弱酸性條件下加入氰化物與MetHb結(jié)合形成MetHb -CN,從而使MetHb的特征吸收峰消失。加入氰化物前后吸收值的變化與MetHb的含量成正比。本測(cè)定方法基于吸收值的變化，除MetHb外其他成分在加入氰化物前后吸收值不發(fā)生變化，方法準(zhǔn)確度不受溶液中其他成分的影響。氰化物法適用于幾乎所有紅細(xì)胞和無基質(zhì)血紅蛋白樣品(血紅蛋白溶液)，不受種屬差異的限制。對(duì)于HbV (微囊包裹的血紅蛋白)等容易引起光散射或膜難以破壞不能完全釋放血紅蛋白的樣品，不能使用以血紅蛋白光學(xué)吸收特性為基礎(chǔ)的測(cè)定方法，包括氰化物法。氰化物遇酸或紫外線照射可產(chǎn)生劇毒的HCN氣體，試劑保存時(shí)間短，所以，氰化物法不適合HBOCs (血紅蛋白氧載體)的在線檢測(cè)。計(jì)算分光光度法是利用物質(zhì)在一定波長(zhǎng)處吸收值與濃度之間呈線性關(guān)系及多組分物質(zhì)在某波長(zhǎng)處吸收值等于各組分吸收值之和建立的。利用分光光度計(jì)直接測(cè)定樣品在多個(gè)波長(zhǎng)處的吸收值來計(jì)算MetHb含量，主要有三波長(zhǎng)法、四波長(zhǎng)法和連續(xù)波譜法。計(jì)算分光光度法原理多被各種血?dú)夥治鰞x采用。計(jì)算分光光度法易受血紅蛋白種屬來源和溶液PH影響。它是將紅細(xì)胞溶血后釋放血紅蛋白，測(cè)定樣品在某些波長(zhǎng)處的吸收值，操作簡(jiǎn)單、快速、安全，但是計(jì)算公式推導(dǎo)過程相對(duì)復(fù)雜。在推算MetHb含量計(jì)算公式時(shí)需要特定條件下各成分的消光系數(shù)ε，對(duì)于文獻(xiàn)中無法查到的ε需要實(shí)驗(yàn)計(jì)算，相對(duì)麻煩。等吸收點(diǎn)法是相同濃度的兩種物質(zhì)在某波長(zhǎng)處的吸收值相同，該波長(zhǎng)稱為這兩種物質(zhì)的等吸收點(diǎn)。如文獻(xiàn)(高鐵血紅蛋白簡(jiǎn)易測(cè)定法，劉蘭廷，黃如衡，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院干IJ，1986年第10卷第3期，229-233)報(bào)導(dǎo)，使用兔血進(jìn)行實(shí)驗(yàn)得到，相同濃度的O2Hb (氧和血紅蛋白)和MetHb吸收曲線在某波長(zhǎng)處相交，即兩者的消光系數(shù)相同，當(dāng)樣品總濃度相同，O2Hb與MetHb比例不同，在該波長(zhǎng)處的吸收值仍相同。等吸收點(diǎn)法是利用等吸收點(diǎn)和郎伯比爾定律得到MetHb含量的計(jì)算公式
權(quán)利要求
1.用拉曼光譜法對(duì)待測(cè)樣品中高鐵血紅蛋白含量MetHb%-行測(cè)定的方法，包括以下步驟 I)針對(duì)待測(cè)樣品的種類制備不同高鐵血紅蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液將質(zhì)量濃度為10%的K3Fe(CN)6溶液以不同體積分別與待測(cè)樣品混合，得到含有不同高鐵血紅蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用已知的檢測(cè)方法定值標(biāo)準(zhǔn)溶液中高鐵血紅蛋白的質(zhì)量濃度MetHb% ； 2 )用顯微共焦拉曼光譜儀對(duì)上述含有不同高鉄血紅蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定范圍在1200-1300(^1之間，得到含有不同高鐵血紅蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液的拉曼光譜；并對(duì)該拉曼光譜進(jìn)行基線校準(zhǔn)后再曲線順滑； 3)確定拉曼光譜法的測(cè)定公式按算式1 =レllW xlOO計(jì)算含有不同高鐵血紅蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液的PR值，其中I1215為拉曼光譜在拉曼頻率為1215cm—1處的峰強(qiáng)度 值，I1227為拉曼光譜在拉曼頻率為1227cm—1處的峰強(qiáng)度值；依據(jù)PR值與步驟I)定值的MetHb%值確定線性關(guān)系式PR=kl MetHb%+a, kl為斜率，a為截距，再反推確定拉曼光譜法PR-MetHb%推導(dǎo)算式； 4)按步驟2)的操作測(cè)定待測(cè)樣品的拉曼光譜，并按步驟3)的操作得到待測(cè)樣品的PR值，代入步驟3)確定的拉曼光譜法PR_MetHb%推導(dǎo)算式，得到待測(cè)樣品的MetHb%結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品為無基質(zhì)血紅蛋白、血液代用品或血液，待測(cè)樣品形式為液體原樣或袋裝樣品，所述種類為動(dòng)物或人；步驟3)線性關(guān)系PR=kl MetHbW+a中的kl和a的數(shù)值需要通過測(cè)定相應(yīng)種類已知高鐵血紅蛋白含量的樣品確定。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述方法，其特征在于，所述步驟2)中用origins.0軟件對(duì)拉曼光譜進(jìn)行基線校準(zhǔn)和曲線順滑。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述方法，其特征在于，所述步驟I)中所述已知的檢測(cè)方法包括氰化物法、計(jì)算分光光度法、血?dú)夥治龇ê偷任拯c(diǎn)法。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述方法，其特征在于，針對(duì)牛血紅蛋白溶液中的高鐵血紅蛋白含量MetHb%-行測(cè)定，所述步驟I)用等吸收點(diǎn)法定值標(biāo)準(zhǔn)溶液中高鐵血紅蛋白的質(zhì)量濃度MetHb% ;所述等吸收點(diǎn)法包括在比色皿中加入50 u I不同高鐵血紅蛋白含量的溶液和3mL緩沖液1/60M pH6. 6PBS，用紫外/可見分光光度計(jì)測(cè)量A590和A630的吸光度，代入MetHb含量的計(jì)算公式= 式中，Ex、E分別為630nm與590nm的吸光度；R為100%高鐵血紅蛋白在630nm和590nm吸光度的比例常數(shù)，為1.27±0.01，r為100%血紅蛋白在630nm和590nm吸光度的比例常數(shù)，為0. 05±0. 01，定值得到高鐵血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)溶液中高鐵血紅蛋白的質(zhì)量濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，步驟3)確定的線性關(guān)系式為 PR=O. 427MetHb%+17. 2，確定的 PR_MetHb% 推導(dǎo)算式為MetHb%=(0. 0233PR-0. 397)X100%。
7.一種針對(duì)牛血紅蛋白溶液中的高鐵血紅蛋白質(zhì)量濃度MetHb%進(jìn)行測(cè)定的方法，包括以下步驟 I)用顯微共焦拉曼光譜儀對(duì)待測(cè)牛血紅蛋白溶液樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)范圍設(shè)置為1200-1300(^-1,得到樣品的拉曼光譜；用origins. O軟件對(duì)該拉曼光譜進(jìn)行基線校準(zhǔn)后再曲線順滑； 2)讀取樣品的11215、I1227數(shù)據(jù)，I1215為在拉曼頻率為1215CHT1處的峰強(qiáng)度值，I1227為在拉曼頻率為1227cm—1處的峰強(qiáng)度值代入算式
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述牛血紅蛋白溶液樣品為沒有包裝的溶液或有透明包裝的袋裝溶液。
9.一種針對(duì)牛血紅蛋白溶液中的高鐵血紅蛋白含量進(jìn)行實(shí)時(shí)在線檢測(cè)的方法，包括以下步驟 1)在線取需檢測(cè)的牛血紅蛋白溶液樣品； 2)用顯微共焦拉曼光譜儀對(duì)牛血紅蛋白溶液樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)范圍設(shè)置為1200-1300(^-1,得到樣品的拉曼光譜；用origins. O軟件對(duì)該拉曼光譜進(jìn)行基線校準(zhǔn)后再曲線順滑； 3)讀取樣品的11215、I1227數(shù)據(jù)，I1215為在拉曼頻率為1215CHT1處的峰強(qiáng)度值，I1227為在拉曼頻率為1227cm—1處的峰強(qiáng)度值代入算式
10.一種針對(duì)袋裝保存的血液代用品牛血紅蛋白溶液中的高鐵血紅蛋白含量進(jìn)行無損檢測(cè)的方法，包括以下步驟 1)直接將袋裝保存的牛血紅蛋白溶液作為檢測(cè)樣品； 2)用顯微共焦拉曼光譜儀隔袋對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)范圍設(shè)置為1200-1300(^'得到樣品的拉曼光譜；用origins. O軟件對(duì)該拉曼光譜進(jìn)行基線校準(zhǔn)后再曲線順滑； 3)讀取樣品的11215、I1227數(shù)據(jù)，I1215為在拉曼頻率為1215CHT1處的峰強(qiáng)度值，I1227為在拉曼頻率為1227cm—1處的峰強(qiáng)度值代入算式
全文摘要
本發(fā)明公開了用拉曼光譜法對(duì)待測(cè)樣品中高鐵血紅蛋白含量MetHb%進(jìn)行測(cè)定的方法，通過確定拉曼光譜法PR-MetHb%推導(dǎo)算式，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)并得到其高鐵血紅蛋白含量MetHb%。本發(fā)明具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單、分析速度快、試劑無污染、安全的優(yōu)點(diǎn)，甚至樣品無需進(jìn)行提前處理，隔著包裝即可直接進(jìn)行檢測(cè)，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)原位無損檢測(cè)。本發(fā)明可針對(duì)無基質(zhì)血紅蛋白、血液代用品或血液中高鐵血紅蛋白含量的測(cè)定，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)G01N21/65GK102854177SQ201210335419
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者周虹, 趙蓮, 王瑛, 郭延軍, 盧明子, 闞雪梅, 尤國(guó)興, 陳贛, 羅鑫, 張寧 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所