專利名稱：一種測定生鮮冷卻牛肉中生物胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)分析領(lǐng)域，特別涉及生鮮冷卻牛肉中6種常見生物胺的測定方法。
背景技術(shù)：
牛肉營養(yǎng)豐富，是深受人們喜愛的肉制品之一，其高營養(yǎng)高水分的特點(diǎn)使之成為極易腐敗的食品。微生物的生長繁殖是導(dǎo)致腐敗變質(zhì)的主要原因，腐敗產(chǎn)物主要是生物胺。生物胺是一類由氨基酸脫羧或醛和酮氨基化形成的低分子含氮有機(jī)化合物的總稱，包括脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等)、芳香族(酪胺、苯乙胺等)和雜環(huán)族(組胺、色·胺等)。八種常見生物胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下。
oT. 9 Ce::
IIHOH丨,
組胺色鑛鑛*2-笨乙K雛
續(xù)胺fim#.11胺微量生物胺是生物體內(nèi)的正?；钚猿煞?，在調(diào)節(jié)生長、代謝、控制血壓、消除自由基等方面具有顯著作用。適量的生物胺攝入對人體健康有益，但當(dāng)積累到一定程度時(shí)便會產(chǎn)生毒性作用，引起呼吸紊亂、腹瀉、頭痛等癥狀。食品基質(zhì)復(fù)雜，有必要研究各類食品中生物胺的檢測方法。目前紅酒、香腸、奶酪、魚類等食品中生物胺的檢測方法報(bào)道較多，但牛肉中生物胺的檢測方法鮮有報(bào)道。用于測定生物胺的方法主要有氣相色譜法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、酶生物傳感器法等。目前高效液相色譜法最為常用，方法回收率高、實(shí)用性強(qiáng)，但存在衍生條件苛刻、耗時(shí)長等缺點(diǎn)。已有國外學(xué)者選擇HPLC-MS/MS方法檢測了奶酪中的尸胺、組胺等7種生物胺，無需柱前衍生，且方法可靠、經(jīng)濟(jì)效益好，國內(nèi)對此類方法的研究未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生鮮冷卻牛肉中生物胺的測定方法，解決現(xiàn)有生物胺測定方法中前處理復(fù)雜、衍生耗時(shí)的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種生鮮冷卻牛肉中生物胺的測定方法，步驟包括I.前處理 (I)提取取牛肉樣品與三氯乙酸水溶液混合勻漿后提取2 3次，離心取上清液，合并得到上清液III;用正己烷萃取，取下層液體即為樣品提取液；提取方法為，牛肉樣品與三氯乙酸水溶液混合勻漿后離心取上清液I ;濾渣再與三氯乙酸水溶液混合進(jìn)行第二次提取，取上清液；需要時(shí)再提取一次，所得到的上清液與上清液I合并得到上清液III ;優(yōu)選的，每次提取中，牛肉樣品與三氯乙酸水溶液用量比為Ig :3 5ml，優(yōu)選為Ig 4ml ;上清液III與正己烷體積比為I :0. 8 I. 2，優(yōu)選為I :1 ;所述的三氯乙酸水溶液濃度為4wt% 6wt%,優(yōu)選為5wt% ；(2)凈化步驟(I)的樣品提取液過混合型陽離子交換固相萃取柱，洗脫后取洗脫液干燥，溶解于乙腈甲醇溶液，并過濾；具體步驟為，混合型陽離子交換固相萃取柱活化后，
取步驟(I)的樣品提取液上柱，用水和醇依次洗滌后用氨水甲醇溶液洗脫；洗脫液吹干后加入乙腈甲醇溶液混合均勻，過濾；氨水甲醇溶液中，氨的體積濃度為4% 6%，優(yōu)選為5% ；II. HPLC-MS/MS 測定(A)色譜條件為選用親水作用色譜柱(如Atlantis HILIC);流速0. 15 0. 3mL/min,優(yōu)選0. 2mL/min ;進(jìn)樣量8 12 y L,優(yōu)選10 y L ;分析時(shí)間12 15min,優(yōu)選15min ；柱溫35°C;流動相A相為水相(乙酸銨和甲酸的水溶液，其中乙酸銨含量I. 5 2. 5mmol/L,優(yōu)選2mmol/L，甲酸含量0. 05wt% 0. 15wt%，優(yōu)選為0. 1% )，B為乙腈；梯度洗脫條件水相的體積百分比變化為0 5min，由30%勻速變?yōu)?0% ；5 8min為洗脫，60% ；8 8. Imin,由60%變?yōu)?0% ；8. I 15min為平衡，水相30% ；(B)質(zhì)譜條件離子源溫度116 122°C，優(yōu)選離子源溫度120°C，優(yōu)選采用電噴霧離子源(ESI);脫溶劑溫度295 310°C，優(yōu)選300°C ;脫溶劑氣和錐孔氣N2，脫溶劑氣流速450 520L/h，優(yōu)選500L/h ;錐孔氣流速48 53L/h，優(yōu)選50L/h ;碰撞氣體為氬氣；毛細(xì)管電壓為2. 80 3. 20kV，優(yōu)選為3. OOkV ;掃描方式為正離子掃描，駐留時(shí)間45 60ms，優(yōu)選為50ms，監(jiān)測模式為MRM (多反應(yīng)監(jiān)測)模式。外標(biāo)法進(jìn)行質(zhì)譜定量分析，根據(jù)酪胺、組胺、腐胺、尸胺、色胺和苯乙胺混合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測生鮮牛肉中的生物胺含量；還可采用加標(biāo)的方法進(jìn)行檢測。本發(fā)明采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS )法，可以同時(shí)測定牛肉中的六種生物胺(酪胺、組胺、腐胺、尸胺、色胺和苯乙胺)。根據(jù)以上技術(shù)方案測定牛肉中的生物胺，在0 I. Omg/L范圍內(nèi)線性良好(r > 0. 994)，平均回收率為82. 4% 116. 7%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為5. 3% 8. 7%，檢出下限為IOii g/kg。本發(fā)明方法簡便可行，符合測定需求。用普通高效液相色譜法來檢測食品中的生物胺，僅衍生時(shí)間就需約30min ;而本方法前處理時(shí)間約35min,分析時(shí)間僅需15min,需要的時(shí)間少,檢測方法簡便準(zhǔn)確。


圖I為六種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，從上到下依次為色胺、酪胺、苯乙胺、組胺、尸胺和腐胺圖2為色胺的質(zhì)譜3為酪胺的質(zhì)譜4為苯乙胺的質(zhì)譜5為組胺的質(zhì)譜圖
圖6為尸胺的質(zhì)譜7為腐胺的質(zhì)譜圖
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例I前處理(I)提取稱取5g樣品與20ml三氯乙酸水溶液(5wt% )混合，勻漿3min (IOOOOr/min),離心5min(5000r/min),收集上清液置于50ml容量瓶中；濾洛與20ml三氯乙酸(5% )混合，超聲IOmin,離心5min,上清液合并至50ml容量瓶中，用三氯乙酸定容。取20ml上清液與20ml正己烷混合，靜置3min，下層即為樣品層。 針對牛肉纖維較粗的特點(diǎn)，選用勻漿提取的方法，有利于牛肉中生物胺的溶出，利·用超聲二次提取使生物胺溶出更加徹底，減少前處理中生物胺損失。牛肉中富含油脂，這對回收率影響較大，本發(fā)明采用正己烷萃取，使回收率提高約15%。(2)凈化分別用3mL甲醇、3mL水依次活化混合型陽離子交換固相萃取柱(60mg，3mL)，準(zhǔn)確移取5mL樣品液上柱，控制流動速度在lmL/min以內(nèi)。再用3mL水和3mL甲醇依次洗滌混合型陽離子交換固相萃取柱，抽近干后用2mL氨水甲醇(5v/v%)溶液洗脫。洗脫液50°C氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入2mL乙腈甲醇(20%)溶液，渦旋振蕩lmin，過0. 25 y m濾膜。與選擇C18固相萃取小柱凈化樣品相比，混合型陽離子交換固相萃取柱的使用使生物胺的回收率有所提高，而且凈化速度較快，降低了凈化時(shí)間。HPLC-MS/MS 測定(A)色譜條件Atlantis HILIC色譜柱(長150. Ommx內(nèi)徑2. Imm,填料顆粒粒徑3 u m);流速0. 2mL/min ;進(jìn)樣量=IOuL ;分析時(shí)間15min ;柱溫35°C;流動相A相為水相(含2mmol/L乙酸銨，0. lwt%甲酸)，B相為乙腈，梯度洗脫條件見表I。表I梯度洗脫參數(shù)
時(shí)_ (Hiin)A相(v/v%)B相(v/v%)梯度曲線
03070I (:勻速改變)5bO406 (不變)
8 bU 40 I 8.I 30 70 I _15_30_70_I經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn),Atlantis HILIC色譜柱(150. 0mmx2. 1mm, 3 ii m填料粒徑)對強(qiáng)極性的生物胺的保留效果比C18色譜柱(50mmx2. lmm, 3. 5 ii m)好。考察了使用比例不同的甲醇-水和乙腈-水的多種流動相體系，流動相為乙腈-水(2mmol/L乙酸銨，0. 1%甲酸)時(shí)，六種生物胺的分離效果較好。乙酸銨和甲酸的加入可提高離子化效率，使溶出時(shí)間較早的物質(zhì)峰型尖銳，靈敏度較高。按照表I的梯度洗脫條件洗脫，6種生物胺峰型效果良好，與生物胺標(biāo)準(zhǔn)品(見圖2，從上到下依次為色胺、酪胺、苯乙胺、組胺、尸胺和腐胺)的色譜圖一致。(B)質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源(ESI)，離子源溫度120°C，脫溶劑溫度300°C ;脫溶劑氣和錐孔氣隊(duì)，脫溶劑氣流速500L/h，錐孔氣流速50L/h，碰撞氣體為氬氣；毛細(xì)管電壓為3. OOkV ;掃描方式為正離子掃描，駐留時(shí)間50ms ;監(jiān)測模式為MRM模式。對錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表2，質(zhì)譜圖見圖2 7，與標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖一致。表2多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下6種生物胺優(yōu)化后的質(zhì)譜條件
化介物分子式母子離子錐孔電壓碰撞能量~
(ra/z)(ra/z)(V)(eV)
酪胺(Tyr)C8HnNO137120.981510·
組胺(His)C6HbN311182.771510
腐胺(Put)C4H12N28871.771010
/nK(Cad)C5HnN210285.8715K)
色胺(Try)CwH1A16014,1.0620
苯乙胺(Phe)CA,N121104.911510實(shí)施例2方法的可行性分析(I)標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限以六種生物胺的混合標(biāo)準(zhǔn)液做線性試驗(yàn)，各單組中，每種生物胺的濃度分別為0、O. U0. 3,0. 5、I. Omg/L。按本方法測定，以定量離子的峰面積(Y)和對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)濃度(X)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，分別以S/N=3計(jì)算得出檢出限(表3)。表36種生物胺的線性關(guān)系和檢測限
化合物線性方程相關(guān)系數(shù)(I·2)檢出限LOD~
(μ g/kg)
TyrY=8888.82Χ+167.6290.99610HisY=13612X+77.95920.99910PutΥ=5398. 119Χ-15.4610.997IUCadΥ=6807.29Χ+1.323070.99 IUTryΥ=3337.53Χ+21. 16450.99610PheΥ=3 547.2Χ+240,0820.995106種生物胺的線性方程在0-1. Omg/L的線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于O. 994，檢出下限為10 μ g/kg,符合測定要求。(2)準(zhǔn)確度和精密度向?qū)嵤├齀所得的牛肉樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)液，加標(biāo)量為平均每kg牛肉樣品提取的樣品液中加入的每種生物胺為200 μ g，即200 μ g/kg, 3組平行，重復(fù)測量6次，扣除樣品中空白試驗(yàn)生物胺的含量，求得其回收率(如表4)。表4添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)
權(quán)利要求
1.一種生鮮冷卻牛肉中生物胺的測定方法，其特征在于，步驟包括 1.前處理 (1)提取取牛肉樣品與三氯乙酸水溶液混合勻漿后提取2 3次，離心取上清液，合并得到上清液III ;用正己烷萃取，取下層液體即為樣品提取液； (2)凈化步驟(I)的樣品提取液過混合型陽離子交換固相萃取柱，洗脫后取洗脫液干燥，溶解于乙腈甲醇溶液，并過濾；具體步驟為，混合型陽離子交換固相萃取柱活化后，取步驟(I)的樣品提取液上柱，用水和醇依次洗滌后用氨水甲醇溶液洗脫；洗脫液吹干后加入乙腈甲醇溶液混合均勻，過濾；氨水甲醇溶液中，氨的體積濃度為4% 6% ；II.HPLC-MS/MS 測定 (A)色譜條件為親水作用色譜柱；流速0.15 0. 3mL/min ;進(jìn)樣量8 12 y L ;分析時(shí)間12 15min ;柱溫34 36°C ;A相為水相，水相為乙酸銨和甲酸的水溶液，其中乙酸銨含量I. 5 2. 5mmol/L,甲酸含量0. 05wt% 0. 15wt%, B相為乙腈； 梯度洗脫條件水相的體積百分比變化為0 5min，30%勻速變?yōu)?0% ；5 8min為洗脫，60% ；8 8. Imin,由60%變?yōu)?0% ；8. I 15min為平衡，水相30% ； (B)質(zhì)譜條件離子源溫度116 122°C，脫溶劑溫度295 310°C;脫溶劑氣和錐孔氣N2，脫溶劑氣流速450 520L/h，錐孔氣流速48 53L/h，碰撞氣體為氬氣；毛細(xì)管電壓為2.80 3. 20kV ;掃描方式為正離子掃描，駐留時(shí)間45 60ms。
2.權(quán)利要求I所述生鮮冷卻牛肉中生物胺的測定方法，其特征在于，步驟(I)中，每次提取時(shí)，三氯乙酸水溶液與牛肉樣品用量比為3 5ml/g，上清液III與正己烷體積比為I :0.8 I. 2,所述的三氯乙酸水溶液濃度為4wt% 6wt%。
3.權(quán)利要求I所述生鮮冷卻牛肉中生物胺的測定方法，其特征在于，步驟(I)中，每次提取時(shí)，三氯乙酸水溶液與牛肉樣品用量比為4ml/g，上清液111與正己烷體積比為I : I，所述的三氯乙酸水溶液濃度為5wt%。
4.權(quán)利要求I所述生鮮冷卻牛肉中生物胺的測定方法，其特征在于，步驟(2)中，所述氨水甲醇溶液中，氨的體積濃度為5%。
5.權(quán)利要求I所述生鮮冷卻牛肉中生物胺的測定方法，其特征在于，所述色譜條件為，流速0. 2mL/min ;進(jìn)樣量10 y L ;分析時(shí)間15min ;柱溫35°C ;7jC相中乙酸銨含量2mmol/L,甲酸含量0. Iwt % o
6.權(quán)利要求I所述生鮮冷卻牛肉中生物胺的測定方法，其特征在于，所述的質(zhì)譜條件為采用電噴霧離子源，離子源溫度120°C ;脫溶劑溫度300°C ；;脫溶劑氣流速500L/h，錐孔氣流速50L/h ；;毛細(xì)管電壓為3. OOkV ;掃描方式為正離子掃描，駐留時(shí)間50ms ;監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測模式。
7.權(quán)利要求I所述生鮮冷卻牛肉中生物胺的測定方法，其特征在于，所述生物胺為酪胺、組胺、腐胺、尸胺、色胺和苯乙胺。
全文摘要
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，公開了一種測定生鮮冷卻牛肉中生物胺的方法。牛肉經(jīng)三氯乙酸提取和混合型陽離子交換固相萃取柱凈化后，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定牛肉中6種常見生物胺(尸胺，酪胺，色胺，腐胺，組胺，苯乙胺)。色譜部分采用親水作用色譜柱，水-乙腈梯度洗脫；質(zhì)譜部分采用電噴霧離子源正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測模式，外標(biāo)法進(jìn)行質(zhì)譜定量分析。本方法分析時(shí)間僅需15min，且在0-1.0mg/L范圍內(nèi)線性良好(r＞0.994)，檢出下限為10μg/kg，平均回收率82.4％-116.7％，標(biāo)準(zhǔn)偏差5.3％-8.7％。本方法操作簡便、快速準(zhǔn)確，為生鮮冷卻牛肉中生物胺的測定提供了一種方便快速的方法。
文檔編號G01N30/06GK102788857SQ20121027611
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者徐曉瑾, 歐杰, 王婧 申請人:上海海洋大學(xué)