專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于汞離子檢測(cè)的電化學(xué)傳感器及其制作方法和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種基于寡核苷酸鏈的汞離子電化學(xué)傳感器制作及其應(yīng)用方法，屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
汞是高毒的全球性環(huán)境污染物，尤其是其具有高遷移性、持久性、甲基化作用性、生物富集性及食物鏈放大性的特點(diǎn)，即便是極微量的存在于環(huán)境中，對(duì)動(dòng)植物及人類(lèi)的健康也是極大的威脅。全世界的汞一年的排放量約I. 5萬(wàn)噸，主要來(lái)源于汞礦、冶金、氯堿エ業(yè)、電器エ業(yè)和礦物燃料的燃燒。汞以多種形式存在與環(huán)境中，水溶性的ニ價(jià)汞離子(Hg2+)是汞污染最常見(jiàn)和最穩(wěn)定的形式之一。如何有效地進(jìn)行環(huán)境中汞離子含量的測(cè)定，仍是廣大分析工作者面臨的挑戰(zhàn)。目前傳統(tǒng)的汞離子檢測(cè)方法主要有原子(吸收，發(fā)射，熒光)光譜法及電感耦合等離子質(zhì)譜儀(Inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)。盡管能夠得到比較精石角的檢測(cè)結(jié)果，但這些方法依賴(lài)大型儀器設(shè)備、耗費(fèi)耗時(shí)、需進(jìn)行樣品預(yù)處理，需要專(zhuān)門(mén)的技術(shù)人員進(jìn)行操作，檢測(cè)成本高，很難滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。因此，迫切需要更加簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的可以用于現(xiàn)場(chǎng)分析檢測(cè)汞離子的方法。而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)汞離子進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方法還不多，多數(shù)在靈敏度和專(zhuān)ー性上不能夠滿(mǎn)足要求。近來(lái)的研究表明，汞離子能特異性地與兩個(gè)胸腺嘧啶堿基(T)共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)?；诠x子的這ー特殊的性質(zhì)，已發(fā)展了各種Hg2+檢測(cè)方法如熒光法(A. Ono, H. Togashi, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2004,43,4300.)、納米金聚集比色法(J. S. Lee, M. S. Han, C. A. Mirkin, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2007，46，4093.)，生物芯片法(J. S. Lee, C. A. Mirkin,，Anal. Chem. 2008，80，6805.)等。這些方法普遍具有選擇性好、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但檢測(cè)靈敏度普遍不高，操作繁瑣，且多不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。電化學(xué)DNA傳感器是近幾年迅速發(fā)展起來(lái)的ー種生物傳感器，這種傳感器以功能性的核酸鏈為識(shí)別分子，通過(guò)靶標(biāo)存在時(shí)電信號(hào)的特征性變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)。其主要特點(diǎn)是靈敏度高、響應(yīng)快、操作簡(jiǎn)單和便攜式，非常適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。汞離子的電化學(xué)DNA傳感技術(shù)近些年來(lái)也有報(bào)道如基于酶反應(yīng)放大信號(hào)的電化學(xué)DNA傳感器(Zhang，Z. ；Tang, A. ；Liao, S. ;Chen, P. ；ffu, Z. ；Shen, G. ；Yu, R. Biosens. Bioelectron. 2011, 26,3320-4.)基于結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的電化學(xué) DNA 傳感器(ffu, D. ；Zhang, Q. ；Chu, X. ；ffang, H. ；Shen,G. ；Yu, R. Biosens. Bioelectron. 2010，25，1025-1031.)和基于形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的電化學(xué) DNA傳感器(Tang, X. ；Liu, H. ；Zou, B. ；Tian, D. ；Huang, H. Analyst 2012,137, 309-11.) 這些傳感器在靈敏度和選擇性上有了很大的提高，但這些方法大多在檢測(cè)時(shí)還需額外添加試齊U，并不是一步檢測(cè)的簡(jiǎn)單方法，靈敏度不夠高或者檢測(cè)范圍窄
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于結(jié)合汞離子能特異性地與兩個(gè)胸腺嘧啶堿基(T)共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定的T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的這ー特性以及電化學(xué)DNA傳感器的優(yōu)點(diǎn)，提供一種基于寡核苷酸鏈的Hg2+檢測(cè)電化學(xué)傳感器及其制作方法和檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+低成本、高靈敏、準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面是提供一種用于汞離子檢測(cè)的電化學(xué)傳感器，其中，該傳感器為ー種金電極，該金電極具有固定在其上的化學(xué)修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈及與該全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈互補(bǔ)的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈。進(jìn)ー步，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈固定在該金電極的表面上，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈為標(biāo)記ニ茂鐵的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈。進(jìn)ー步，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈包被到納米金表面。進(jìn)ー步，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈為探針A，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互
補(bǔ)鏈為探針B，其中所述探針A為5’ -SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTT-3’，所述探針B 為5’-Fe- (CH2) 6-AAAAAAAAAAAAAAA-3，。進(jìn)ー步，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈為探針C，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈為探針D，其中所述探針C為5’ _TTTTTTTTTTTTTTT_ (CH2) 6-SH-3’，所述探針D為5’ -FC- (CH2) 6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA- (CH2) 6_SH_3，。進(jìn)ー步，所述探針C的密度為I. OXlOll-L OXlO13鏈/cm2。本發(fā)明的第二方面是提供一種用于汞離子檢測(cè)的電化學(xué)傳感器的制作方法，其中，包括如下步驟第一步驟將化學(xué)修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈固定在金電極上；第二步驟將固定有全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的金電極浸泡到含有與該全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈互補(bǔ)的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈的雜交液中。進(jìn)ー步，在第一步驟中，所述化學(xué)修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈固定在金電極的表面上，在第二步驟中，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈為標(biāo)記ニ茂鐵的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈。進(jìn)ー步，在第二步驟中，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈包被到納米金表面。進(jìn)ー步，利用探針A和探針B制作該電化學(xué)傳感器，其中所述探針A為5’ -sH-(CH2)6-mmTnTnTTT-3’，所述探針 B 為 5’ -Fe-(CH2) 6-AAAAAAAAAAAAAAA-3 ’。進(jìn)ー步，利用探針C和探針D制作該電化學(xué)傳感器，其中所述探針C為5，_xxxxxxxxxxxxxxx_ (CH2) 6-SH-3，，所述探針 D 為 5 ’ -Fe- (CH2) 6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA_(CH2)6-SH-3’。進(jìn)ー步，在第一步驟中，IuM的末端巰基修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈在IOOiI M 三[2-羧こ基]膦(TCEP)，IOmM Tris，I. OMNaCl，pH = 8. 0 中室溫下還原 lh，將未經(jīng)修飾的干凈的金電極浸泡到其中，室溫下過(guò)夜自組裝，組裝后的電極用IOmM Tris, I. OMNaCl，pH = 8.0沖洗兩遍，然后將電極放到含ImM巰基己醇(MCH)的水溶液中封閉30分鐘，再用IOmM Tris, I. OM NaCl,pH = 8. 0沖洗三遍,吹干備用；在第二步驟中，標(biāo)記ニ茂鐵的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈用雜交液1/15M PB，0. 3M NaCl，pH = 7.4稀釋成50nM，將組裝好全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的金電極浸泡到其中，25°C，反應(yīng)3h，然后用1/15M PB，0. 3MNaCl, pH = 7. 4洗三次,從而得到該傳感器。進(jìn)ー步，在第一步驟中，IuM的末端巰基修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈在IOOiI M 三[2-羧こ基]膦(TCEP)，IOmM Tris，I. OMNaCl，pH = 8. 0 中室溫下還原 lh，將未經(jīng)修飾的干凈的金電極浸泡到其中，室溫下過(guò)夜自組裝，組裝后的電極用IOmM Tris, I. OMNaCl, pH = 8. 0沖洗兩遍，然后將電極放到含ImM巰基己醇(MCH)的水溶液中封閉30分鐘，再用IOmM Tris, I. OM NaCl, pH = 8.0沖洗三遍,吹干備用；在第二步驟中，將標(biāo)記ニ茂鐵的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈互補(bǔ)的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈，溶入到50mM ニ硫蘇糖醇(DTT)，2%三こ胺(TEA)的水溶液中，室溫，反應(yīng)20min。使用NAP-5column過(guò)柱純化，然后通過(guò)在260nm處紫外可見(jiàn)吸收峰值對(duì)全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈定量，加入到粒徑為13nm的9nM納米金溶液使DNA鏈與納米金摩爾比例為100 1，在室溫下靜置老化16小時(shí)，老化后在分子雜交儀中振蕩下分多次加入IM PB, IM NaCl, pH = 7. 4使NaCl終濃度為0. 3M，振蕩16h后，9000rpm離心20min，10mM PB，pH = 7. 4洗滌三次，制得包被了標(biāo)記ニ茂鐵的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈的納米金，置于4°C下備用；該納米金用雜交液1/15MPB，0. 3M NaCl,pH = 7. 4稀釋成2nM，將組裝好全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的金電極浸泡到其中，25°C，反應(yīng)3h，然后用1/15M PB，0. 3M NaCl，pH = 7. 4洗三次，從而得到該傳感器。進(jìn)ー步，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈為探針A，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互
補(bǔ)鏈為探針B，其中所述探針A為5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTT-3’，所述探針B為5’-FC- (CH2) 6-AAAAAAAAAAAAAAA-3，。進(jìn)ー步，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈為探針C，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈為探針D，其中所述探針C為5’ _TTTTTTTTTTTTTTT_ (CH2) 6-SH-3’，所述探針D為5’ -FC- (CH2) 6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA- (CH2) 6_SH_3，。本發(fā)明的第三方面是提供一種使用前述的用于汞離子檢測(cè)的電化學(xué)傳感器的檢測(cè)方法，其中，包括如下步驟將電化學(xué)傳感器浸泡在待測(cè)樣品中，取出電化學(xué)傳感器，用溶液清洗，用恒電位儀進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。進(jìn)ー步，將電化學(xué)傳感器浸泡在待測(cè)樣品中30min，用1/15M PB,0. IM NaCl，pH =7. 4的溶液清洗電化學(xué)傳感器3次，用多通道恒電位儀進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。本發(fā)明是首次利用Hg2+可特異性地與兩條相鄰全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈上的T堿基共價(jià)結(jié)合，形成穩(wěn)定的分子間T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，進(jìn)而誘導(dǎo)與全T寡核苷酸鏈雜交的互補(bǔ)鏈全腺嘌呤(A)寡核苷酸鏈的釋放。由于利用了兩條相鄰全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈上的T堿基與汞離子的配位，大幅減小了探針的長(zhǎng)度，減小了分子識(shí)別的空間位阻，提高了檢測(cè)方法設(shè)計(jì)上的靈活性。具體的說(shuō)，將合成的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈通過(guò)自組裝固定在金電極上；然后ニ茂鐵標(biāo)記的全腺嘌呤(A)的互補(bǔ)鏈與固定在電極上的全T寡核苷酸鏈雜交，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，即制備好Hg2+檢測(cè)傳感器；再浸入待測(cè)樣品一段時(shí)間，檢測(cè)電化學(xué)信號(hào)。若待測(cè)樣品中含Hg2+吋，則Hg2+能特異性地與全T寡核苷酸鏈上的T堿基共價(jià)結(jié)合，介導(dǎo)兩條全T寡核苷酸鏈間形成穩(wěn)定的分子間T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，從而誘導(dǎo)帶有ニ茂鐵基團(tuán)的全A互補(bǔ)鏈的釋放，導(dǎo)致方波伏安(SWV)掃描時(shí)的ニ茂鐵氧化峰峰值電流的減小。從而可以通過(guò)峰值電流的變化來(lái)定量分析汞離子的濃度。由于空間位阻的大幅減小，還可以用ニ茂鐵修飾的全腺嘌呤(A)寡核苷酸鏈修飾的納米金探針來(lái)替代ニ茂鐵標(biāo)記的全腺嘌呤(A)探針來(lái)大幅提高檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明基于寡核苷酸鏈的Hg2+檢測(cè)電化學(xué)傳感器的制作方法及其應(yīng)用方法，具有如下的技術(shù)效果
I、本發(fā)明基于寡核苷酸鏈的Hg2+檢測(cè)傳感器的制作方法簡(jiǎn)單、易行。2、本發(fā)明基于寡核苷酸鏈的Hg2+檢測(cè)傳感器具有檢測(cè)靈敏度很高(IOpM)、專(zhuān)ー性高(對(duì)常見(jiàn)其它金屬離子均無(wú)明顯響應(yīng))、檢測(cè)的濃度范圍極寬(0. OlnM-IOOiiM)的優(yōu)點(diǎn)。3、應(yīng)用本發(fā)明基于寡核苷酸鏈的Hg2+檢測(cè)傳感器檢測(cè)Hg2+時(shí)，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需額外添加試劑，可以實(shí)現(xiàn)ー步檢測(cè)。4、由于利用了兩條相鄰全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈上的T堿基與汞離子的配位，與現(xiàn)有技術(shù)中使用分子內(nèi)T-Hg2+-T配位不同，大幅減小了探針的長(zhǎng)度，減小了分子識(shí)別的空間位阻，提高了檢測(cè)方法設(shè)計(jì)上的靈活性。比如本發(fā)明中可以使用方便地使用納米金探針來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度。5、本發(fā)明提出的汞離子檢測(cè)方法的電信號(hào)變化的百分比與全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈在電極上的密度密切相關(guān)，高探針密度下有利于相鄰全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈上的T堿基與汞離子的配位，電信號(hào)變化的百分比顯著高于低探針密度的情況。但是由于解 鏈或其它因素造成的電化學(xué)信號(hào)的降低，具有不同密度的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的傳感器應(yīng)該有類(lèi)似的電信號(hào)變化。因此上述在相同汞離子濃度電信號(hào)變化的百分比受探針密度影響的現(xiàn)象可以用于排除汞離子檢測(cè)時(shí)假陽(yáng)性的情況，從而解決了信號(hào)減(turn-off)的電化學(xué)傳感器可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況。6、應(yīng)用本發(fā)明檢測(cè)的結(jié)果用普通的恒電位儀掃描及分析即可，不需要復(fù)雜昂貴的大型設(shè)備，有利于實(shí)現(xiàn)分析的微型化，使現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)更方便、易行。


圖I (A)-圖I (B)是金電極上基于寡核苷酸鏈電化學(xué)檢測(cè)汞離子的原理圖。圖2是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中基于寡核苷酸鏈電化學(xué)檢測(cè)InM汞離子的時(shí)間動(dòng)力學(xué)。縱坐標(biāo)是扣除了基線(xiàn)電流值之后的峰值電流。圖3(A)-圖3(B)是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中基于寡核苷酸鏈電化學(xué)檢測(cè)的傳感器(基于方法A)檢測(cè)Hg2+的SffV峰型圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(0. I-IOOnM范圍內(nèi)R2 = 0. 999)。SffV峰型圖中氧化峰對(duì)應(yīng)的Hg2+濃度自上而下依次是:0,0. InM, InM, IOnM, IOOnM, I u M, 10 u M,50 u MjIOOuM0標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的縱坐標(biāo)是扣除了基線(xiàn)電流值之后的峰值電流。圖4(A)-圖4(B)是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中基于寡核苷酸鏈電化學(xué)檢測(cè)的傳感器檢(基于方法B)測(cè)Hg2+SWV峰型圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(R2 = 0. 99)。SWV峰型圖中氧化峰對(duì)應(yīng)的Hg2+濃度自上而下依次是:0,0. OlnM, 0. 05nM, 0. InM, InM, IOnM, 50nM, IOOnM, I u M, 10 u M, 100 u M。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的縱坐標(biāo)是扣除了基線(xiàn)電流值之后的峰值電流。圖5(A)-圖5(B)是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中基于寡核苷酸鏈電化學(xué)檢測(cè)的傳感器(基于方法B)考察電極表面探針密度對(duì)其檢測(cè)Hg2+的電信號(hào)輸出的影響。圖5(A)中a是全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈自組裝30min構(gòu)建的傳感器對(duì)不同濃度Hg2+的峰值電流變化，b是全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈過(guò)夜自組裝構(gòu)建的傳感器對(duì)不同濃度Hg2+的峰值電流變化。曲線(xiàn)的縱坐標(biāo)是扣除了基線(xiàn)電流值之后的峰值電流。圖5(B)中■是全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈自組裝30min構(gòu)建的傳感器對(duì)不同濃度Hg2+的電流信號(hào)減小的百分比，^■是全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈過(guò)夜自組裝構(gòu)建的傳感器對(duì)不同濃度Hg2+的電流信號(hào)減小的百分比。
圖6是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中基于寡核苷酸鏈電化學(xué)檢測(cè)的傳感器(基于方法B)檢測(cè)Hg2+和其他可能存在的干擾離子的結(jié)果。離子濃度是Hg2+濃度分別IOOnM和Iii M，(圖中是IOuM)其他離子濃度均為10 PM。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的用于汞離子檢測(cè)的電化學(xué)傳感器為ー種金電極，化學(xué)修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈固定在該金電極的表面上，同時(shí)，該金電極具有固定在其上的與該全胸腺!1密啶(T)寡核苷酸鏈互補(bǔ)的標(biāo)記ニ茂鐵的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈。所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈可以包被到納米金表面。為了制作上述用于汞離子檢測(cè)的電化學(xué)傳感器，有兩種方法，第一種方法A包括兩個(gè)步驟，其中第一步驟是將化學(xué)修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈固定在金電極上，在該第一步驟中，所述化學(xué)修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈固定在金電極的表面上，即
I U M的末端巰基修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈在100 ii M三[2-羧こ基]膦(TCEP)，IOmM Tris, I. OM NaCl, pH = 8. 0中室溫下還原lh，將未經(jīng)修飾的干凈的金電極浸泡到其中，室溫下過(guò)夜自組裝。組裝后的電極用IOmM Tris, I. OM NaCl, pH = 8. 0沖洗兩遍，然后將電極放到含ImM巰基己醇(MCH)的水溶液中封閉30分鐘，再用IOmM Tris, I. OM NaCl,pH = 8. 0沖洗三適，吹干備用；第二步驟是將固定有全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的金電極浸泡到含有與該全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈互補(bǔ)的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈的雜交液中，即全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈與全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的雜交，將標(biāo)記ニ茂鐵的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈用雜交液1/15M PB，0. 3M NaCl,pH = 7. 4稀釋成50nM，將組裝好全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的金電極浸泡到其中，25°C，反應(yīng)3h，然后用1/15M PB，
0.3MNaCl, pH = 7. 4洗三次，得到傳感器。最好，得到的傳感器使用前于4°C下保存。制作上述用于汞離子檢測(cè)的電化學(xué)傳感器的第二種方法B如下其包括兩個(gè)步驟，其中第一步驟與上述第一種方法的第一步驟相同，是將化學(xué)修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈固定在金電極上，在該第一步驟中，所述化學(xué)修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈固定在金電極的表面上，即IuM的末端巰基修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈在IOOiiM三[2-羧こ基]膦(TCEP)，IOmM Tris, I. OM NaCl,pH = 8. 0中室溫下還原lh，將未經(jīng)修飾的干凈的金電極浸泡到其中，室溫下過(guò)夜自組裝。組裝后的電極用IOmM Tris, I. OM NaCl,pH = 8. 0沖洗兩遍，然后將電極放到含ImM巰基己醇(MCH)的水溶液中封閉30分鐘，再用IOmM Tris, I. OM NaCl，pH = 8. 0沖洗三遍，吹干備用；第二步驟是將固定有全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的金電極浸泡到含有與該全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈互補(bǔ)的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈的雜交液中，在第二步驟中，將標(biāo)記ニ茂鐵的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈互補(bǔ)的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈，溶入到50mM ニ硫蘇糖醇(DTT)，2%三こ胺(TEA)的水溶液中，室溫，反應(yīng)20min。使用NAP_5column過(guò)柱純化,然后通過(guò)在260nm處紫外可見(jiàn)吸收峰值對(duì)全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈定量，加入到粒徑為13nm的9nM納米金溶液使DNA鏈與納米金摩爾比例為100 1，在室溫下靜置老化16小時(shí)，老化后在分子雜交儀中振蕩下分多次加入 IM PB, IM NaCl，pH = 7. 4 使 NaCl 終濃度為 0. 3M，振蕩 16h 后，9000rpm 離心 20min,IOmM PB, pH = 7. 4洗滌三次，制得包被了標(biāo)記ニ茂鐵的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈的納米金，置于4°C下備用；該納米金用雜交液1/15M PB，0.3M NaCl，pH = 7. 4稀釋成2nM，將組裝好全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的金電極浸泡到其中，25°C，反應(yīng)3h，然后用1/15M PB，
0.3M NaCl, pH = 7. 4洗三次，從而得到傳感器。最好，得到的傳感器使用前于4°C下保存。具體來(lái)說(shuō)，前述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈為探針A，前述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈為探針B。前述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈也可以為探針C，前述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈為探針D。下面的表I為本發(fā)明中使用的核酸探針序列。表I
權(quán)利要求
1.ー種用于汞離子檢測(cè)的電化學(xué)傳感器，其特征在干，該傳感器為ー種金電極，該金電極具有固定在其上的化學(xué)修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈及與該全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈互補(bǔ)的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈固定在該金電極的表面上，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈為標(biāo)記ニ茂鐵的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈包被到納米金表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈為探針A，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈為探針B ，其中所述探針A為5’ -SH-(CH2)6-mmTnTnTTT-3’，所述探針 B 為 5’ -Fc-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的電化學(xué)傳感器，其特征在于，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈為探針C，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈為探針D，其中所述探針C為5’ -TITITITITITITIT-(CH2)6-SH-3’，所述探針 D 為 5’ -Fe-(CH2) 6_AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-(CH2)6-SH-3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的電化學(xué)傳感器，其特征在干，所述探針C的密度為I. OXlO12-L OXlO13 鏈/cm2。
7.ー種用于汞離子檢測(cè)的電化學(xué)傳感器的制作方法，其特征在于，包括如下步驟 第ー步驟將化學(xué)修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈固定在金電極上；第ニ步驟將固定有全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的金電極浸泡到含有與該全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈互補(bǔ)的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈的雜交液中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的電化學(xué)傳感器的制作方法，其特征在于，在第一步驟中，所述化學(xué)修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈固定在金電極的表面上，在第二步驟中，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈為標(biāo)記ニ茂鐵的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的電化學(xué)傳感器的制作方法，其特征在于，在第二步驟中，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈包被到納米金表面。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的電化學(xué)傳感器的制作方法，其特征在于，利用探針A和探針B制作該電化學(xué)傳感器，其中所述探針A為5’-SH-(CH2)6-TTTTTTTTTTTTTTT-3’，所述探針 B 為 5’ -Fe- (CH2) 6-AAAAAAAAAAAAAAA-3’。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的電化學(xué)傳感器的制作方法，其特征在于，利用探針C和探針D制作該電化學(xué)傳感器，其中所述探針C為5’ -TTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-SH-3’，所述探針D 為 5 ’ -Fe-(CH2)6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-(CH2)6-SH-3，。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的電化學(xué)傳感器的制作方法，其特征在于，在第一步驟中，I U M的末端巰基修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈在100 ii M三[2-羧こ基]膦(TCEP)，IOmM Tris, I. OM NaCl, pH = 8. 0中室溫下還原lh，將未經(jīng)修飾的干凈的金電極浸泡到其中，室溫下過(guò)夜自組裝，組裝后的電極用IOmM Tri s，I. OM NaCl, pH = 8. 0沖洗兩遍，然后將電極放到含ImM巰基己醇(MCH)的水溶液中封閉30分鐘，再用IOmM Tris, I. OM NaCl,pH = 8. 0沖洗三遍，吹干備用；在第二步驟中，標(biāo)記ニ茂鐵的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈用雜交液1/15M PB，0. 3M NaCl,pH =7.4稀釋成50nM，將組裝好全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的金電極浸泡到其中，25°C，反應(yīng)3h，然后用1/15M PB，0.3M NaCl, pH = 7.4洗三次，從而得到該傳感器。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的電化學(xué)傳感器的制作方法，其特征在于，在第一步驟中，I U M的末端巰基修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈在100 ii M三[2-羧こ基]膦(TCEP)，IOmM Tris, I. OM NaCl, pH = 8. 0中室溫下還原lh，將未經(jīng)修飾的干凈的金電極浸泡到其中，室溫下過(guò)夜自組裝，組裝后的電極用IOmM Tris, I. OM NaCl，pH = 8. 0沖洗兩遍，然后將電極放到含ImM巰基己醇(MCH)的水溶液中封閉30分鐘，再用IOmM Tris, I. OM NaCl,pH =8.0沖洗三遍，吹干備用；在第二步驟中，將標(biāo)記ニ茂鐵的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈互補(bǔ)的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈，溶入到50mM ニ硫蘇糖醇(DTT)，2%三こ胺(TEA)的水溶液中，室溫，反應(yīng)20min。使用NAP_5column過(guò)柱純化,然后通過(guò)在260nm處紫外可見(jiàn)吸收峰值對(duì)全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈定量，加入到粒徑為13nm的9nM納米金溶液使DNA鏈與納米金摩爾比例為100 1，在室溫下靜置老化16小時(shí)，老化后在分子雜交儀中振蕩下分多次加入 IM PB, IMNaCl，pH = 7. 4 使 NaCl 終濃度為 0. 3M，振蕩 16h 后，9000rpm 離心 20min,IOmM PB，pH = 7. 4洗滌三次，制得包被了標(biāo)記ニ茂鐵的全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈的納米金，置于4°C下備用；該納米金用雜交液1/15M PB，0.3M NaCl，pH = 7. 4稀釋成2nM，將組裝好全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的金電極浸泡到其中，25°C，反應(yīng)3h，然后用1/15M PB，0.3M NaCl，pH = 7. 4洗三次，從而得到該傳感器。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的電化學(xué)傳感器的制作方法，其特征在于，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈為探針A，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈為探針B，其中所述探針A為5，-SH- (CH2) 6-TTTTTTTTTTTTTTT-3，，所述探針 B 為 5 ’ -Fe- (CH2) 6_AAAAAAAAAAAAAAA_3，。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的電化學(xué)傳感器的制作方法，其特征在于，所述全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈為探針C，所述全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈為探針D，其中所述探針C為5’ -TITITITITITITIT-(CH2)6-SH-3’，所述探針 D 為 5’ -Fe-(CH2) 6_AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-(CH2)6-SH-3，。
16.ー種使用權(quán)利要求1-6中任ー權(quán)利要求所述的用于汞離子檢測(cè)的電化學(xué)傳感器的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟將電化學(xué)傳感器浸泡在待測(cè)樣品中，取出電化學(xué)傳感器，用溶液清洗，用恒電位儀進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的檢測(cè)方法，其特征在于，將電化學(xué)傳感器浸泡在待測(cè)樣品中30min，用1/15M PB，0. IM NaCl，pH = 7.4的溶液清洗電化學(xué)傳感器3次，用多通道恒電位儀進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于寡核苷酸鏈的汞離子電化學(xué)傳感器及其制作和檢測(cè)方法，屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域。該傳感器的制作方法為將化學(xué)修飾的全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈固定在金電極上；將固定有全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈的金電極浸泡到含有全腺嘌呤(A)寡核苷酸互補(bǔ)鏈的雜交液中。本發(fā)明利用了Hg2+能特異性地與兩條相鄰全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈上的T堿基共價(jià)結(jié)合，形成穩(wěn)定的分子間T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，進(jìn)而誘導(dǎo)與全胸腺嘧啶(T)寡核苷酸鏈雜交的互補(bǔ)鏈全腺嘌呤(A)寡核苷酸鏈的釋放。汞離子會(huì)導(dǎo)致互補(bǔ)鏈的釋放，使電化學(xué)信號(hào)降低，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)汞離子的電化學(xué)檢測(cè)。本發(fā)明大幅提高了檢測(cè)靈敏度，具有很好的離子選擇性。
文檔編號(hào)G01N27/416GK102778492SQ20121024415
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月13日
發(fā)明者婁新徽, 趙滔 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)