專利名稱：慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及快速檢測(cè)食品中氨基糖苷類抗生素慶大霉素殘留的試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
自2008年以來(lái)，乳制品的安全問(wèn)題在全國(guó)乃至全世界造成了巨大的影響，不僅廣大消費(fèi)者的權(quán)益受到了損害，整個(gè)乳制品行業(yè)包括眾多的奶農(nóng)的利益也受到了巨大損害。乳制品行業(yè)的食品安全問(wèn)題已經(jīng)嚴(yán)重關(guān)系到了我國(guó)的國(guó)計(jì)民生，急需解決。乳制品的安全，既需要從源頭開(kāi)始，通過(guò)各項(xiàng)規(guī)章制度對(duì)質(zhì)量進(jìn)行層層控制，也需 要各種檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行層層把關(guān)。由于乳制品生產(chǎn)涉及的原料數(shù)量巨大、來(lái)源眾多，因此如何 實(shí)現(xiàn)對(duì)大量原料奶樣品準(zhǔn)確快速的篩選，是目前檢測(cè)技術(shù)急需突破的難點(diǎn)之一。氨基糖苷類抗生素是奶牛常用藥物之一，包括鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素等，此類藥物均具有耳毒性和腎臟毒性，能損害腦神經(jīng)、耳蝸神經(jīng)，輕者聽(tīng)力下降，重者永久性耳聾，會(huì)對(duì)近端腎曲管有損害，造成血尿、腎功能衰退等。目前常用的檢測(cè)方法是液相色譜法、TTC法和酶聯(lián)免疫法，這三種方法均無(wú)法實(shí)現(xiàn)在現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)，難以滿足目前逐漸增大的檢測(cè)樣本量，以及對(duì)奶源的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)控制的需求。免疫層析測(cè)試技術(shù)是九十年代初發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，因其簡(jiǎn)便(不需要任何設(shè)備)、快速、直觀、敏感、特異，在臨床診斷等諸多領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，用于快速檢測(cè)血清或尿樣中的抗原成分；也可用于檢測(cè)樣品中的致病菌和其它有害成分等。該方法靈敏度高和特異性強(qiáng)，反應(yīng)快速，操作簡(jiǎn)便，不需任何特殊儀器設(shè)備，適用于快速篩查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供食品中慶大霉素快速檢測(cè)條及其檢測(cè)方法和應(yīng)用；發(fā)明主要目的在于克服傳統(tǒng)的檢測(cè)方法繁瑣，檢測(cè)耗時(shí)，在實(shí)際工作中應(yīng)用局限性大等缺陷，而提供一種更加快速、簡(jiǎn)捷、安全的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。食品中慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條，所述檢測(cè)條由樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順次搭接黏貼在底襯上，在樣品墊處貼上MAX線。金標(biāo)抗體結(jié)合墊上包被膠體金顆粒標(biāo)記的慶大霉素單克隆抗體，硝酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線和控制線，所述檢測(cè)線中含有慶大霉素-蛋白偶聯(lián)物，所述控制線內(nèi)放置有羊抗鼠單克隆抗體。所述蛋白偶聯(lián)物是牛血清白蛋白；結(jié)合墊上包被的膠體金顆粒直徑為25nm，ImL膠體金顆粒標(biāo)記慶大霉素單克隆抗體的量為3ng,形成膠體金-抗體復(fù)合物,在結(jié)合點(diǎn)墊上膠體金顆粒的包被量為2mL/30cm。所述檢測(cè)線上慶大霉素-蛋白偶聯(lián)物的包被量為I y L/cm ；控制線上羊抗鼠抗體包被量為I U L/cm ；羊抗鼠抗體濃度為lmg/mL ；一種慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條的制備方法闡述如下
I)金標(biāo)抗體結(jié)合墊的制備a.空白膠體金溶液的制備采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，在三角燒瓶中加入97. 5ml雙蒸水加熱至沸騰后加入I. 5ml檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱5min后加入Iml 1%氯金酸，持續(xù)加熱煮沸至液體呈現(xiàn)桔紅色，保持沸騰狀態(tài)IOmin后將燒瓶置于室溫，充分冷卻后，冷藏保存；b 膠體金標(biāo)記抗體的制備取空白膠體金溶液100ml，加入0. IM碳酸鉀150 200ul來(lái)調(diào)節(jié)溶液的pH值。在磁力攪拌下逐滴加入濃度為0. 2mg/ml的慶大霉素單克隆抗體,使終濃度為3ng/ml,繼續(xù)攪拌30min, 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘后，吸除上清,用金標(biāo)抗體重懸液將沉淀金標(biāo)抗體充 分重懸；c.金標(biāo)抗體結(jié)合墊的制備將重懸好的金標(biāo)抗體包被于預(yù)先切割好的尺寸為lcmX30cm的玻璃纖維素膜上，包被量為2ml/30cm，37°C干燥過(guò)夜，取出自封袋密封避光干燥處保存；2)硝酸纖維素膜上T、C線的包被a.慶大霉素-蛋白偶聯(lián)物的制備稱取40mg慶大霉素硫酸鹽和IOmg牛血清白蛋白(BSA)，分別溶解于Iml的蒸餾水中，將BSA溶液逐滴加入到慶大霉素溶液中，室溫下于磁力攪拌器上攪拌2h以上。取120mgEDC. HCl溶于Iml蒸餾水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室溫下繼續(xù)攪拌Ih以上，然后于4°C放置過(guò)夜。用PBS透析3天后，分裝，_20°C貯存。b.T、C線的包被調(diào)試好二維噴點(diǎn)平臺(tái)，將合適濃度的慶大霉素蛋白偶聯(lián)物通過(guò)劃線的方式包被在硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線，同時(shí)進(jìn)行羊抗鼠單克隆抗體的包被作為控制線，37°C干燥2h，密封，避光干燥處保存；3)試紙條的組裝按權(quán)I中的要求將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊按序搭接黏貼在PVC底板上，并在樣品墊和金標(biāo)抗體結(jié)合墊的表面覆上MAX線，最后將貼好的底板在切條機(jī)上切割成寬為4mm的試紙條。結(jié)合墊上包被膠體金顆粒直徑為25nm，ImL膠體金顆粒標(biāo)記慶大霉素單克隆抗體的量為3ng,形成膠體金-抗體復(fù)合物,在結(jié)合點(diǎn)墊上膠體金顆粒的包被量為2mL/30cm。硝酸纖維素膜上檢測(cè)線包被慶大霉素-蛋白偶聯(lián)物，濃度為0. 13mg/mL,包被量為
Iu L/cm ;控制線上包被羊抗鼠抗體濃度為lmg/mL，包被量為I y L/cm。金標(biāo)抗體重懸液配方組成如下
材料TrisBSA!!糖ddH20
標(biāo)準(zhǔn)量1.2114g丨 IOg50g1000ml
pHI 8.2應(yīng)用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)食品中慶大霉素殘留，包括以下步驟一、檢測(cè)樣本I.原料奶
一取所需數(shù)量的酶標(biāo)板微孔，置于微孔板上；一向每個(gè)微孔中依次加入100 U L樣品稀釋液和100 U L待測(cè)奶樣，混勻。一向每孔中插入金標(biāo)檢測(cè)條，等待5分鐘觀察結(jié)果，30分鐘后結(jié)果無(wú)效。2.奶粉一稱取I. 2g奶粉樣品，加入8. 8mL蒸餾水溶解；一取所需數(shù)量的微孔，置于微孔板上；一向每個(gè)微孔中依次加入100 U L樣品稀釋液和100 u L待測(cè)奶樣，混勻。一向每孔中插入金標(biāo)檢測(cè)條，等待5分鐘觀察結(jié)果，30分鐘后結(jié)果無(wú)效。3.非乳酸類液態(tài)成品奶(白奶、高端奶、花色奶、兒童奶等)—取所需數(shù)量的微孔，置于微孔板上；一向每個(gè)微孔中依次加入140 U L樣品稀釋液和70 ii L待測(cè)奶樣，混勻。一向每孔中插入金標(biāo)檢測(cè)條，等待5分鐘觀察結(jié)果，30分鐘后結(jié)果無(wú)效。4.乳酸類液態(tài)成品奶(酸牛奶、乳飲品等)一取所需體積的樣品稀釋液，加入添加劑至濃度為2%，振蕩溶解(以48次檢測(cè)為例，可取7. 5mL樣品稀釋液，加入0. 15g添加劑)；一取所需數(shù)量的微孔，置于微孔板上；一取待測(cè)奶樣，3000g離心IOmin ；一取70uL上清液至微孔中，再加入140uL添加了 2%添加劑的樣品稀釋液，混勻；一向每孔中插入金標(biāo)檢測(cè)條，等待5分鐘觀察結(jié)果，10分鐘后結(jié)果無(wú)效。注I)添加劑溶解很慢，需要較長(zhǎng)時(shí)間，在振蕩溶解過(guò)程中，如添加劑結(jié)塊，可用槍頭將其挑碎，以加速溶解；如有恒溫加熱器，也可在35°C左右加熱助其溶解。2)乳飲品離心后，上層可能仍為渾濁狀態(tài)，可直接吸取最上層的液體，用于檢測(cè)即可。二、結(jié)果判斷讀取結(jié)果時(shí)，檢測(cè)條應(yīng)如圖所示擺放方式置于觀察者的正面。請(qǐng)勿從檢測(cè)條側(cè)面或倒置檢測(cè)條進(jìn)行結(jié)果觀察。 陰性T線(檢測(cè)線，靠近樣品溶液的一端)和C線(對(duì)照線)均顯色，判斷為陰性，表示牛奶樣品中慶大霉素濃度低于IOOppb或不含慶大霉素殘留。 陽(yáng)性僅C線顯色，而T線無(wú)顯色，判斷為陽(yáng)性，表示牛奶樣品中慶大霉素濃度高于 IOOppb ； 無(wú)效:C線未顯色，表明不正確的操作過(guò)程或檢測(cè)條已失效。在此情況下，應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)，并用新的檢測(cè)條重新測(cè)試。如問(wèn)題仍然存在，應(yīng)停止使用此批號(hào)產(chǎn)品，并與當(dāng)?shù)毓?yīng)商聯(lián)系。三、特異性本產(chǎn)品與鏈霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷類抗生素交叉反應(yīng)率〈O. 1%，與P -內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素、磺胺類和喹諾酮類等其他種類藥物交叉反應(yīng)率〈O. 1%。本發(fā)明試劑盒的技術(shù)原理如下根據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理，進(jìn)行抗體膠體金的有效標(biāo)記，同時(shí)在硝酸纖維素膜上劃制慶大霉素-蛋白偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物與樣本中的慶大霉素殘留物共同競(jìng)爭(zhēng)金標(biāo)記慶大霉素單克隆抗體形成有效的競(jìng)爭(zhēng)抵制反應(yīng)作為檢測(cè)線，羊抗鼠抗體作為控制線。在層析過(guò)程中陽(yáng)性樣本中的目標(biāo)物與金標(biāo)結(jié)合墊上金標(biāo)復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合，當(dāng)層析到檢測(cè)線時(shí)，游離的金標(biāo)抗體與與檢測(cè)線上蛋白偶聯(lián)物相結(jié)合，同時(shí)由于抗原抗體的反應(yīng)為可逆反應(yīng)，蛋白偶聯(lián)物還競(jìng)爭(zhēng)已與目標(biāo)物結(jié)合的金標(biāo)抗體從而被檢測(cè)線捕獲顯色，樣本中目標(biāo)物越多檢測(cè)線顯色就越淺，當(dāng)樣本中的目標(biāo)物達(dá)到一定濃度時(shí)，檢測(cè)線由于捕獲不到金標(biāo)抗體不再顯色；多余的金標(biāo)復(fù)合物繼續(xù)層析，達(dá)到控制線時(shí)與包被有羊抗鼠抗體的控制線捕獲顯色。
有益效果該試劑盒是將小分子獸藥氨基糖苷類藥物中最常見(jiàn)的慶大霉素通過(guò)膠體金免疫層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)乳制品中慶大霉素殘留物的快速檢測(cè)，通過(guò)對(duì)樣本簡(jiǎn)單的前處理，在10-20min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)慶大霉素的殘留檢測(cè)。該試劑盒具有以下特點(diǎn)I.前處理簡(jiǎn)單只需通過(guò)離心或添加就可實(shí)現(xiàn)對(duì)乳制品的檢測(cè)；2.檢測(cè)時(shí)間短在10-20min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)慶大霉素殘留檢測(cè)；3.檢測(cè)成本低相對(duì)于儀器和ELISA檢測(cè)，單個(gè)樣本所需檢測(cè)費(fèi)用更低；4.適用范圍廣由于試劑盒對(duì)操作環(huán)境要求不高同時(shí)無(wú)昂貴儀器要求，可用于實(shí)驗(yàn)室和野外以及現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)；5.人員要求低由于在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中需用的儀器及試劑較少，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)要求不高，整個(gè)操作過(guò)程簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果肉眼就能進(jìn)行判讀；6.安全性較高試劑盒內(nèi)無(wú)任何有毒有害物質(zhì)。本發(fā)明所研究的慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳制品中慶大霉素殘留檢測(cè)，其檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)成本低，檢測(cè)范圍廣；檢測(cè)靈敏度符合國(guó)家和歐盟標(biāo)準(zhǔn)。因此，它符合國(guó)家對(duì)食品安全與出入境檢驗(yàn)檢疫中檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展要求，有利于提高食品安全與出入境檢驗(yàn)檢疫工作的效率與準(zhǔn)確率，有利于保證食品安全與進(jìn)出口貿(mào)易，從而在公共安全領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。


圖I :檢測(cè)條檢測(cè)結(jié)果判定方法；圖2 :檢測(cè)條結(jié)果判定；圖中所示0、12. 5、25、50和100為添加濃度，單位為ng/ml，前4個(gè)添加濃度檢測(cè)結(jié)果為陰性，最后一個(gè)為陽(yáng)性結(jié)果；圖3 :檢測(cè)條結(jié)構(gòu)示意圖其中IPVC底板，2樣品墊，3金標(biāo)結(jié)合墊，4NC硝酸纖維素膜，5檢測(cè)線T，6質(zhì)控線C，7吸水墊。
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的的具體實(shí)施說(shuō)明，實(shí)施例I試劑盒的靈敏度實(shí)驗(yàn)取5份經(jīng)儀器檢測(cè)(GB/T 22969-2008國(guó)標(biāo)方法和農(nóng)業(yè)部1163號(hào)公告-7-2009方法)不含氨基糖苷類抗生素的牛奶樣本，進(jìn)行不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的添加(表I)。每份樣品重復(fù)測(cè)定5次，以95%出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最低濃度作為試劑盒的檢測(cè)靈敏度。5份奶樣不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品添加的靈敏度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表I。結(jié)果表明，慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條，100ng/mL添加濃度的奶樣，75次檢測(cè)中僅有I份為陰性，陽(yáng)性檢出率為98. 7%，因此，該試劑盒的靈敏度可以達(dá)到100ng/mL。表I慶大霉素靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條，所述檢測(cè)條由樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順次搭接黏貼在底襯上，在樣品墊處貼MAX線；金標(biāo)抗體結(jié)合墊上包被膠體金顆粒標(biāo)記的慶大霉素單克隆抗體，硝酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線和控制線，所述檢測(cè)線中含有慶大霉素-蛋白偶聯(lián)物，所述控制線內(nèi)放置有羊抗鼠單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條，其特征在于，所述慶大霉素-蛋白偶聯(lián)物是牛血清白蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條，其特征在于，所述金標(biāo)抗體結(jié)合墊上包被的膠體金顆粒直徑為25nm，ImL膠體金顆粒標(biāo)記慶大霉素單克隆抗體的量為3ng。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條，其特征在于，所述結(jié)合點(diǎn)墊上膠體金顆粒的包被量為2mL/30cm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條，其特征在于，所述檢測(cè)線上慶大霉素-蛋白偶聯(lián)物的包被量為I U L/cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條，其特征在于，所述控制線上羊抗鼠抗體包被量為I U L/cm,羊抗鼠抗體濃度為lmg/mL。
7.—種如權(quán)1-6所述慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條的制備方法，包括如下步驟 1)金標(biāo)抗體結(jié)合墊的制備 a.空白膠體金溶液的制備 采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，在三角燒瓶中加入97. 5ml雙蒸水加熱至沸騰后加入I. 5ml檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱5min后加入Iml 1%氯金酸，持續(xù)加熱煮沸至液體呈現(xiàn)桔紅色，保持沸騰狀態(tài)IOmin后將燒瓶置于室溫，充分冷卻后，冷藏保存； b.膠體金標(biāo)記抗體的制備 取空白膠體金溶液100ml，加入0. IM碳酸鉀150 200ul來(lái)調(diào)節(jié)溶液的pH值。在磁力攪拌下逐滴加入濃度為0. 2mg/ml的慶大霉素單克隆抗體,終濃度為3ng/ml ;繼續(xù)攪拌30min, 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘后，吸除上清,用金標(biāo)抗體重懸液將沉淀金標(biāo)抗體充分重懸； c.金標(biāo)抗體結(jié)合墊的制備 將重懸好的金標(biāo)抗體包被于預(yù)先切割好的尺寸為lcmX30cm的玻璃纖維素膜上，包被量為2ml/30cm，37°C干燥過(guò)夜，取出自封袋密封避光干燥處保存； 2)硝酸纖維素膜上T、C線的包被 a.慶大霉素-蛋白偶聯(lián)物的制備 稱取40mg慶大霉素硫酸鹽和IOmg牛血清白蛋白，分別溶解于Iml的蒸餾水中，將BSA溶液逐滴加入到慶大霉素溶液中，室溫下于磁力攪拌器上攪拌2h以上。取120mg EDC. HCl溶于Iml蒸餾水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室溫下繼續(xù)攪拌Ih以上，然后于4°C放置過(guò)夜。用PBS透析3天后，分裝，-20°C貯存。
b.T、C線的包被 調(diào)試好二維噴點(diǎn)平臺(tái)，將慶大霉素蛋白偶聯(lián)物通過(guò)劃線的方式包被在硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線，同時(shí)進(jìn)行羊抗鼠單克隆抗體的包被作為控制線，37°C干燥2h，密封避光干燥處保存； 3)試紙條的組裝按權(quán)I中的要求將樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊按序搭接黏貼在PVC底板上，并在樣品墊和金標(biāo)抗體結(jié)合墊的表面覆上MAX線，將貼好的底板在切條機(jī)上切割成寬為4mm的試紙條。
8.—種如權(quán)利要求7所述慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條的制備方法，其特征在于所述控制線上包被羊抗鼠抗體濃度為lmg/mL，包被量為I ii L/cm。
9.一種如權(quán)1-6所述慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條在奶制品檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條及其制備方法和應(yīng)用，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明是將慶大霉素抗體和抗原通過(guò)膠體金免疫層析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)乳制品中慶大霉素殘留的快速檢測(cè)。本發(fā)明主要包括慶大霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條，所述檢測(cè)條是由樣品墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊及MAX線組成；所述金標(biāo)結(jié)合墊是膠體金標(biāo)記的慶大霉素單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜中部包被檢測(cè)線和控制線，檢測(cè)線是能與金標(biāo)慶大霉素單克隆抗體進(jìn)行特異性結(jié)合的慶大霉素-蛋白偶聯(lián)物，控制線是羊抗鼠IgG單克隆抗體。本發(fā)明采取插條方式，操作簡(jiǎn)單、攜帶方便、結(jié)果判定快速、準(zhǔn)確、整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需10分鐘，能夠用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本的定性篩查。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102749451SQ20121023831
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者于重楠, 何艷玲, 唐慧林, 李瑾, 王麗哲 申請(qǐng)人:北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司