專利名稱：一種電化學免疫傳感器、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種電化學免疫傳感器、其制備方法及其用途，更具體而言，本發(fā)明涉及一種基于Pd雜化SBA-15(介孔ニ氧化硅分子篩)的電化學免疫傳感器、其制備方法，以及由該方法制備的電化學免疫傳感器在測定人絨毛膜促性腺激素中的用途。
背景技術(shù)：
人絨毛膜促性腺激素(hCG)是ー種主要由胎盤組織的滋養(yǎng)層細胞分泌的涎糖蛋白。在正常情況下，健康的未孕人體內(nèi)的濃度很低，可能檢測不到。而異位妊娠、許多惡性非滋養(yǎng)細胞腫瘤以及非性腺腫瘤可產(chǎn)生異位hCG，因此hCG的檢測成為預(yù)報早孕及流產(chǎn)，幫助異位妊娠及其相關(guān)疾病診斷的常用手段。目前hCG的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫分析法、放射免疫測定法、時間分辨免疫熒光法等。但是這些方法在靈敏度、選擇性、穩(wěn)定性和可操作性方面都存在ー些局限性。近年來，電化學免疫傳感器受到了廣泛地關(guān)注，其分為夾心型電化學免疫傳感器和無標記型電化學免疫傳感器。與夾心型的電化學免疫傳感器相比，無標記型電化學免疫傳感器操作更為簡便，它不需要進行ニ抗的固定。SBA-15, 一種介孔ニ氧化硅分子篩，具有較好的生物相容性和可調(diào)的孔徑等優(yōu)點，因此被廣泛地用于生物傳感器的構(gòu)建。到目前為止，SBA-15已被用于葡萄糖氧化酶、細胞色素C、抗體的固定等。但是與SBA-15相比，Pd納米粒子引入到SBA-15的孔道中得到的Pd雜化SBA-15不僅保持了 SBA-15良好的生物相容性的優(yōu)點，而且又表現(xiàn)出Pd的很好的催化活性，進ー步提高電子的傳遞效率，所以可以更好地用于hCG抗體的固定。石墨烯具有極好的結(jié)晶性和非凡的電子學、熱力學和力學性能，因此是人們廣泛關(guān)注的焦點。在石墨烯的研究和應(yīng)用中，為了充分發(fā)揮其優(yōu)良性質(zhì)，必須對石墨烯進行功能化。也就是在石墨烯材料優(yōu)勢基礎(chǔ)上，進ー步對材料進行性能改性和優(yōu)化，合成水溶性良好的磺酸化石墨烯(HS03-GS)，從而達到更好固定修飾材料的目的。本發(fā)明將磺酸化石墨烯及硫堇的復(fù)合物滴涂到玻碳電極表面，形成具有高表面能和良好氧化還原活性的復(fù)合膜。硫堇作為電子媒介體，以戊ニ醛做交聯(lián)劑共價鍵合帶氨基的Pd雜化SBA-15介孔材料，制備了基于Pd雜化SBA-15的無標記型電化學免疫傳感器，測試結(jié)果顯示，上述方法制備的電化學免疫傳感器的靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性高，基于上述發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的是提供ー種電化學免疫傳感器，所述電化學免疫傳感器包括工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾磺酸化石墨烯及硫堇的復(fù)合物、戊ニ醛、Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液、牛血清蛋白和hCG抗原。本發(fā)明的再ー個目的在于提供ー種電化學免疫傳感器的制備方法，所述方法制備的傳感器靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡便，避免了傳統(tǒng)檢測方法的儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程、繁瑣等缺點。本發(fā)明的另一目的是提供所述電化學免疫傳感器在測定人絨毛膜促進腺激素中的用途。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下措施來實現(xiàn)的。本發(fā)明的電化學免疫傳感器包括工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾磺酸化石 墨烯及硫堇的復(fù)合物、戊ニ醛、Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液、牛血清蛋白和hCG抗原。所述工作電極與參比電極、對電極組成電化學免疫傳感器來檢測hCG抗原。所述參比電極為飽和甘汞電極，對電極為鉬絲電極。本發(fā)明的電化學免疫傳感器的制備方法包括以下步驟a、合成磺酸化石墨烯；b、制備Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液；C、制備電化學免疫傳感器工作電極；d、制作電化學免疫傳感器工作曲線。其中，步驟a的合成磺酸化石墨烯,具體包括以下步驟①預(yù)還原用硼氫化鈉在80°C預(yù)還原氧化石墨烯lh，以除去多數(shù)含氧官能團；②磺酸化用磺胺酸的芳基重氮鹽冰浴2h ；③徹底還原用肼再去還原(100°C，24h)，用以除去剩余的含氧官能團。步驟b的制備Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液，具體包括以下步驟 ①將SBA-15加入到含有3-氨丙基三こ氧基硅烷的無水甲苯中回流反應(yīng)20h，得到氨基功能化的SBA-15 ；②稱取PdCl2,向其中加入0. 2mol/L的HC1，用紅外燈烤干即得H2PdCl4 ；③將氨基功能化的SBA-15與H2PdCl4以質(zhì)量比I : I混合并用水稀釋成溶液，將混合物在室溫下攪拌24h ；④離心后用水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)溶液的pH小于2并攪拌至少30min。攪拌完之后，將50mmol/L的NaBH4溶液逐滴的加入到混合液中，直到所有的H2PdCl4都還原成金屬Pd ；⑤將上述混合液離心并真空干燥，即得所需的Pd雜化SBA-15 ；⑥將hCG抗體溶液加入到6 8mg/mL的Pd雜化SBA-15溶液中超聲，得到分散均勻的Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液。步驟c的制備電化學免疫傳感器工作電極的方法，具體包括以下步驟①將玻碳電極表面進行拋光處理使其表面光潔；②取一定濃度的磺酸化石墨烯和硫堇的復(fù)合物(體積比為2 : I I : I)均勻滴涂在上述玻碳電極表面，室溫下晾干；③滴涂Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體，清洗晾干；④將上述處理的電極放置在I % BSA溶液中溫育lh，用于封閉電極上的非特異性活性位點，最后修飾上hCG抗原，電極晾干井清洗。將制備好的免疫電極置于冰箱，在4. (TC下保存?zhèn)溆茫吹玫诫娀瘜W免疫傳感器的工作電極。步驟d的制作電化學免疫傳感器工作曲線,步驟如下①將參比電極-飽和甘汞電極、對電極-鉬絲電極和上述制備的工作電極正確連接在電化學工作站上；②pH 7.4的PBS緩沖溶液(含0. lmol/L KCl作為支持電解質(zhì))作為底液，采用循環(huán)伏安法分別測定不同hCG抗原濃度下電流值；繪制人絨毛膜促性腺激素傳感器工作曲線。本發(fā)明的另一方面提供上述方法制備的電化學免疫傳感器在測定人絨毛膜促進腺激素中的用途。本發(fā)明的有益成果(I)本發(fā)明的發(fā)明人首次將金屬納米粒子-介孔材料復(fù)合物(Pd雜化SBA-15)引入到人絨毛膜促進腺激素的電化學免疫傳感器的制備當中，利用納米材料的增效作用與介孔材料優(yōu)異的固載作用，使所制作的電極有更高的靈敏度和更寬的檢測范圍。
(2)在本發(fā)明的制備方法中，將hCG抗體與Pd雜化SBA-15直接孵化，減少了電極的修飾步驟，提高了傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。(3)由本發(fā)明的方法制備的電化學免疫傳感器，操作簡單，檢測速度快，可在短時間內(nèi)實現(xiàn)大量樣品的測定。(4)使用本發(fā)明的方法制備的電化學免疫傳感器，因在檢測液中加入了電子媒介體，使得電化學免疫傳感器具有更高的靈敏度。本發(fā)明的電化學免疫傳感器表現(xiàn)出了優(yōu)良的準確性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與高的靈敏度，免疫分析檢測迅速、方便，可用于臨床分析。


下面結(jié)合

和具體實施例對本發(fā)明做進ー步詳細描述。圖I為本發(fā)明的電化學免疫傳感器的工作曲線。
具體實施例方式本發(fā)明使用的人絨毛膜促性腺激素(hCG)和人絨毛膜促性腺激素抗體購自鄭州市博賽生物技術(shù)研究所，PdCl2、碳酸鈉和亞硝酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司，硼氫化鈉和對氨基苯磺酸購自中國上海試劑ー廠。除了玻碳電極用超純水清洗外，整個實驗過程用的均是二次水。CHI760D電化學工作站購自上海辰華儀器有限公司。實施例I(I)磺酸化石墨烯的合成將37. 5mg的氧化石墨分散到37. 5g的水中。然后超聲Ih后得到棕色的氧化石墨
烯懸浮液。預(yù)還原先用5wt%的碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)上述氧化石墨烯懸浮液的pH為9,將300mgNaBH4溶解到7. 5g水中，然后再將NaBH4溶液加到氧化石墨烯懸浮液中。將混合物在80°C條件下不斷攪拌lh。該還原過程在氮氣氣氛下進行。懸浮液由咖啡色變?yōu)楹谏Ｔ谶€原反應(yīng)結(jié)束后看到聚集，用水離心和清洗2 3次之后，經(jīng)過超聲，將部分還原的氧化石墨烯分散在37. 5g的水中，得到懸浮液；磺酸化23mg對氨基苯磺酸和9mg亞硝酸鈉在5g水和0. 25g lmol/LHCl中反應(yīng)，冰浴中形成重氮鹽。在冰浴且不斷攪拌的條件下，向部分還原的氧化石墨烯懸浮液中加入上述重氮鹽溶液，且保持冰浴2h。反應(yīng)混合物通入氮氣趕走氣泡。反應(yīng)結(jié)束后離心并用水清洗2 3次后，將磺酸化的氧化石墨烯分散到37. 5g水中，得到懸浮液；徹底還原在之后的還原步驟中，把Ig的肼(50% )滴到2. 5g水中并加入到磺酸化步驟得到的懸浮液中，且反應(yīng)混合物在不斷攪拌的條件下保持100°c，24h。之后向混合物中加入5wt%的碳酸鈉溶液用以沉淀磺酸化的石墨烯。在用水徹底清洗和真空干燥之后，得到磺酸化的石墨烯，通過超聲將其均·勻分散在水中以配制成2mg/mL的磺酸化石墨烯溶液。(2)制備Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液將Ig SBA-15加入到含有ImL 3_氨丙基三こ氧基硅烷的80mL無水甲苯中回流反應(yīng)20h，得到氨基功能化的SBA-15 ；稱取0. 0887g的PdCl2，向其中加入6mL 0. 2mol/L的HC1，用紅外燈烤干即得H2PdCl4 ；將氨基功能化的SBA-15與H2PdCl4以質(zhì)量比I : I混合并用水稀釋成溶液，將混合物在室溫下攪拌24h ；離心后用水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)溶液的pH小于2并攪拌至少30min。攪拌完之后，將50mmol/L的NaBH4溶液逐滴的加入到混合液中，直到所有的H2PdCl4都還原成金屬Pd；將上述混合液離心并真空干燥，即得所需的Pd雜化SBA-15 ；稱取上述制備的Pd雜化SBA-15固體將其溶解在水中配制成濃度為6mg/mL的Pd雜化SBA-15溶液；將5mL濃度為12ng/mL hCG抗體溶液加入到5mL濃度為6mg/mL Pd雜化SBA-15溶液中，在4°C恒溫振蕩箱中震蕩24h，得到分散均勻的Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液；(3)制備電化學免疫傳感器工作電極將4mm直徑的玻碳電極用I. 0,0. 3,0. 05 u m的三氧化ニ鋁拋光粉拋光處理，こ醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于0. 05mol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0. 2
0.6V掃描，使峰電位差小于IlOmV,用超純水清洗電極表面，吹干；固定上述步驟(I)制備的磺酸化石墨烯和硫堇溶液的濃度均為2mg/mL,將體積比為2 I的磺酸化石墨烯和硫堇混合溶液均勻滴涂在上述處理的玻碳電極表面，室溫下晾干;然后滴涂上述步驟⑵中制備的Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液，清洗晾干；將上述處理的電極放置在1% BSA溶液中溫育lh，用于封閉電極上的非特異性活性位點，最后修飾上hCG，電極晾干井清洗。將制備好的免疫電極置于冰箱，在4. (TC下保存?zhèn)溆?，即得電化學免疫傳感器的工作電極。(4)制作電化學免疫傳感器工作曲線打開電化學工作站，將參比電極-飽和甘汞電極、對電極-鉬絲電極和上述制備的工作電極正確連接在電化學工作站上；IOmL pH 7. 4的PBS緩沖溶液作為底液，分別測定不同hCG抗原濃度下氧化峰的電
流值；
根據(jù)所得氧化峰電流值與hCG抗原濃度呈線性關(guān)系，繪制工作曲線，如圖I所示。測定結(jié)果表明，hCG濃度在0.01 16.00ng/mL范圍內(nèi)成線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為
0.9991。檢出限為 8. 60pg/mL。實施例2(I)磺酸化石墨烯的合成將37. 5mg的氧化石墨分散到37. 5g的水中。然后超聲Ih后得到棕色的氧化石墨
烯懸浮液。預(yù)還原先用5wt%的碳酸鈉調(diào)節(jié)上述氧化石墨烯懸浮液的pH為10,將300mg NaBH4溶解到7. 5g水中，然后再將NaBH4溶液加到上述氧化石墨烯懸浮液中。將混合物在80°C條件下不斷攪拌lh。該還原過程在氮氣氣氛下進行。懸浮液由咖啡色變?yōu)楹谏?。在還原反應(yīng)結(jié)束后看到聚集，用水離心和清洗2 3次之后，經(jīng)過超聲，將部分還原的氧化石墨烯分散在37. 5g的水中，得到懸浮液；磺酸化23mg對氨基苯磺酸和9mg亞硝酸鈉在5g水和0. 25g lmol/LHCl中反應(yīng)，冰浴下形成重氮鹽。在冰浴且不斷攪拌的條件下，向部分還原的氧化石墨烯懸浮液中加入上述重氮鹽溶液，且保持冰浴2h。反應(yīng)混合物通入氮氣趕走氣泡。反應(yīng)結(jié)束后離心并用水清洗2 3次后，將磺酸化的氧化石墨烯分散到37. 5g水中，得到懸浮液；徹底還原在之后的還原步驟中，把Ig的肼(50% )滴到2. 5g水中并加入到磺酸化步驟得到的懸浮液中，且反應(yīng)混合物在不斷攪拌的條件下保持100°c，24h。之后向混合物中加入5wt%的碳酸鈉溶液用以沉淀磺酸化的石墨烯。在用水徹底清洗和真空干燥之后，得到磺酸化的石墨烯，通過超聲將其均勻分散在水中以配制成2mg/mL的磺酸化石墨烯溶液。(2)制備Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液將Ig SBA-15加入到含有ImL 3_氨丙基三こ氧基硅烷的80mL無水甲苯中回流反應(yīng)20h，得到氨基功能化的SBA-15 ；稱取0. 0887g的PdCl2，向其中加入6mL 0. 2mol/L的HC1，用紅外燈烤干即得H2PdCl4 ；將氨基功能化的SBA-15與H2PdCl4以質(zhì)量比I : I混合并用水稀釋成溶液，將混合物在室溫下攪拌24h ；離心后用水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)溶液的pH小于2并攪拌至少30min。攪拌完之后，將50mmol/L的NaBH4溶液逐滴的加入到混合液中，直到所有的H2PdCl4都還原成金屬Pd；將上述混合液離心并真空干燥，即得到所需的Pd雜化SBA-15 ；稱取一定量的Pd雜化SBA-15固體將其溶解在水中配制成濃度為8mg/mL的Pd雜化SBA-15溶液；將5mL濃度為12ng/mL hCG抗體溶液加入到5mL濃度為8mg/mL Pd雜化SBA-15溶液中，在4°C恒溫振蕩箱中震蕩24h，得到分散均勻的Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液；(3)制備電化學免疫傳感器工作電極將4mm直徑的玻碳電極用I. 0,0. 3,0. 05 U m的三氧化ニ鋁拋光粉拋光處理，こ醇
超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于0. 05mol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0. 2 0.6V掃描，使峰電位差小于IlOmV,用超純水清洗電極表面，吹干；固定上述制備的磺酸化石墨烯和硫堇溶液的濃度均為2mg/mL,將體積比為I : I的磺酸化石墨烯和硫堇混合溶液均勻滴涂在上述玻碳電極表面，室溫下晾干；然后滴涂上述Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液，清洗晾干；將上述處理的玻碳電極放置在 Iwt% BSA溶液中溫育lh，用于封閉電極上的非特異性活性位點，最后修飾上hCG，電極晾干井清洗。將制備好的免疫電極置于冰箱，在4. (TC下保存?zhèn)溆?，即得電化學免疫傳感器的工作電極。(4)制作電化學免疫傳感器工作曲線打開電化學工作站，將參比電極-飽和甘汞電極、對電極-鉬絲電極和上述制備的工作電極正確連接在電化學工作站上；對人血清中的hCG進行了測定，根據(jù)實施例I所得工作曲線，計算血清中hCG的含量。五次測定結(jié)果表明，人體血樣的五次測定結(jié)果分別為I. 54、I. 56、I. 52、I. 55、I. 51ng/mL，平均hCG含量為I. 54ng/mL，其結(jié)果與采用標準酶聯(lián)免疫法得到的結(jié)果I. 57ng/mL基本一致。同時采用標準加入法，hCG的加入量為5. 00ng/mL，得到的平均回收率為101%，相對標準偏差為1.4%。說明本發(fā)明的制備方法得到的電化學免疫傳感器具有較高的準確度和精密度。
權(quán)利要求
1.ー種電化學免疫傳感器，其包括工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾磺酸化石墨烯及硫堇的復(fù)合物、戊ニ醛、Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液、牛血清蛋白和hCG抗原。
2.—種電化學免疫傳感器的制備方法,所述方法包括 a、合成磺酸化石墨烯； b、制備Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液； C、制備電化學免疫傳感器的工作電極； d、制作電化學免疫傳感器的工作曲線。
3.如權(quán)利要求2中所述的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述的步驟a的 合成磺酸化石墨烯包括 (1)預(yù)還原用硼氫化鈉在80°C預(yù)還原氧化石墨烯lh，以除去多數(shù)含氧官能團； (2)磺酸化用磺胺酸的芳基重氮鹽冰浴2h； (3)徹底還原在100°C用肼再去還原24h，用以除去剰余的含氧官能團。
4.如權(quán)利要求2中所述的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述的步驟b的制備Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液包括 (1)將SBA-15加入到含有3-氨丙基三こ氧基硅烷的無水甲苯中回流反應(yīng)20h，得到氨基功能化的SBA-15 ； (2)稱取PdCl2,向其中加入0.2mol/L的HCl，用紅外燈烤干即得H2PdCl4 ； (3)將氨基功能化的SBA-15與H2PdCl4以質(zhì)量比I: I混合并用水稀釋成溶液，將混合物在室溫下攪拌24h ； (4)離心后用水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)溶液的pH小于2并攪拌至少30min;攪拌完之后，將50mmol/L的NaBH4溶液逐滴的加入到混合液中，直到所有的H2PdCl4都還原成金屬Pd； (5)將上述混合液離心并真空干燥，即得所需的Pd雜化SBA-15； (6)將hCG抗體的溶液加入到6 8mg/mL的Pd雜化SBA-15溶液中超聲，得到分散均勻的Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體溶液。
5.如權(quán)利要求2中所述的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述的步驟c的制備電化學免疫傳感器的工作電極包括 (1)將玻碳電極表面進行拋光處理使其表面光潔； (2)以體積比為2: I I : I取步驟a合成的磺酸化石墨烯和硫堇的復(fù)合物，均勻滴涂在所述玻碳電極表面，室溫下晾干； (3)滴涂步驟b制備的Pd雜化SBA-15孵化的hCG抗體，清洗晾干； (4)將上述處理的玻碳電極放置在Iwt% BSA溶液中溫育lh，用于封閉電極上的非特異性活性位點，最后修飾上hCG抗原，電極晾干井清洗，將制備好的免疫電極置于冰箱，在4.(TC下保存?zhèn)溆茫吹秒娀瘜W免疫傳感器工作電極。
6.如權(quán)利要求2中所述的電化學免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述的步驟d的制作電化學免疫傳感器工作曲線包括 (I)將參比電極、對電極和上述制備的工作電極正確連接在電化學工作站上，所述參比電極為飽和甘汞電極，所述對電極為鉬絲電極；(2)pH 7. 4的含0. lmol/L KCl作為支持電解質(zhì)的PBS緩沖溶液作為底液，采用循環(huán)伏安法分別測定不同hCG抗原濃度下電流值；繪制人絨毛膜促性腺激素電化學免疫傳感器エ作曲線。
7.權(quán)利要求I所述的電化學免疫傳感器在測定人絨毛膜促進腺激素中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種電化學免疫傳感器、其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明首次將金屬納米粒子-介孔材料復(fù)合物(Pd雜化SBA-15)引入到人絨毛膜促進腺激素(hCG)的電化學免疫傳感器的制備當中磺酸化石墨烯及硫堇的復(fù)合物滴涂到玻碳電極表面，形成具有高表面能和良好氧化還原活性的復(fù)合膜。硫堇作為電子媒介體，以戊二醛做交聯(lián)劑共價鍵合帶氨基的Pd雜化SBA-15介孔材料，制備了基于Pd雜化SBA-15的hCG電化學免疫傳感器，在最佳條件下繪制了工作曲線并實現(xiàn)了血清樣品中hCG的測定。本發(fā)明的電化學免疫傳感器在檢測hCG中表現(xiàn)出靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡便、快速的優(yōu)點，為其它腫瘤標志物的檢測提供了一條新的途徑。
文檔編號G01N27/26GK102735728SQ201210230340
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月5日
發(fā)明者吳丹, 張勇, 杜斌, 桑欣欣, 蔡燕燕, 馬洪敏, 魏琴 申請人:濟南大學