專利名稱:D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域,具體涉及一種D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條及其制備方法。
背景技術(shù):
D-二聚體是血液中的纖維蛋白原受凝血酶等作用而凝固形成的聚合物,是交聯(lián)纖維蛋白的特異性降解產(chǎn)物。在生理狀態(tài)下,人體正常D- 二聚體的水平一般在200 μ g/L 以下,機(jī)體保持著凝血與纖溶動(dòng)態(tài)平衡,以保證纖維蛋白及時(shí)形成和清除。如果這一平衡遭到破壞,血管內(nèi)凝血傾向增強(qiáng),纖維蛋白聚集,纖維蛋白降解產(chǎn)物增加,D-二聚體含量增力口。因此,D-二聚體水平的升高反映體內(nèi)凝血和纖溶系統(tǒng)的雙重激活,可作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的分子標(biāo)志物之一。D- 二聚體含量升高可檢測(cè)多種疾病的病程,如深靜脈血栓(DVT)、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)、心肌梗死、重癥肝炎、肺栓塞(PE)等疾病。因此血液中 D-二聚體含量檢測(cè)有助于血栓前狀態(tài)及血栓形成性疾病的診斷,療效觀察及預(yù)后判斷。
目前,D-二聚體檢測(cè)方法主要有乳膠凝集法、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法、熒光抗體檢測(cè)法、免疫金標(biāo)法和膠乳免疫比濁法等。膠乳凝集法只能定性檢測(cè),不能測(cè)定血漿中 D-二聚體含量的變化。酶聯(lián)免疫法操作容易受到酶活性變化的影響,結(jié)果不太準(zhǔn)確。免疫膠體金法容易受類風(fēng)濕因子、肝素及血脂的影響,結(jié)果準(zhǔn)確性差。膠乳比濁法反應(yīng)特異性不好,所需試劑比較復(fù)雜。中國(guó)專利201110051367. 2公開了一種D-二聚體時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒及其制備方法,該試劑盒由下述成分組成1)D-二聚體校準(zhǔn)品;2) D-二聚體單克隆抗體包被的微孔板;3)銪元素標(biāo)記的另一株D-二聚體單克隆抗體;4)洗滌液;5)增強(qiáng)液;6)分析緩沖液。該試劑盒采用銪元素標(biāo)記抗體,銪元素屬于鑭系稀土金屬元素,價(jià)格比較昂貴,且銪熒光壽命lms,在水中不穩(wěn)定,需要額外添加增強(qiáng)劑才能獲得穩(wěn)定的熒光。實(shí)施例中指出加入增強(qiáng)液之前,吸頭應(yīng)使用增強(qiáng)液洗兩次,加入過(guò)程中應(yīng)避免碰到小孔邊緣或其底部,以免產(chǎn)生污染。因此,測(cè)定結(jié)果容易受操作的影響而不準(zhǔn)確。另外,該發(fā)明中關(guān)于試劑盒的靈敏度、特異性等方面,只提供了結(jié)果,而沒有提供具體的數(shù)據(jù)。因此,不知道該發(fā)明的試劑盒是否真實(shí)可行。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不足,提供一種D- 二聚體熒光免疫試紙條。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種D- 二聚體熒光免疫試紙條的制備方法。本發(fā)明的目的可通過(guò)采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條,在底襯上依次搭接地粘貼樣品墊,結(jié)合墊,硝酸纖維素膜和吸水紙,所述結(jié)合墊上噴涂有熒光膠乳微球標(biāo)記的抗D- 二聚體抗體A,所述硝酸纖維素膜上有抗D- 二聚體抗體B為檢測(cè)線和兔抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線。所述膠乳微球粒徑范圍為50nm-500nm。
所述熒光膠乳微球是由膠乳微球吸附熒光標(biāo)記的鏈霉親和素制備得到的。所述突光為發(fā)射波長(zhǎng)在480nm-700nm自發(fā)突光物質(zhì),優(yōu)選異硫氰酸突光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、熒光素Cy5中的一種。 所述抗D- 二聚體抗體是抗D- 二聚體單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段或嵌合抗體。所述結(jié)合墊的材質(zhì)為聚酯膜或玻璃纖維素膜。D- 二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條的制備方法,包括如下步驟
I)包被熒光膠乳微球標(biāo)記D- 二聚體抗體A結(jié)合墊的制備
a.將熒光標(biāo)記的鏈霉親和素和膠乳微球吸附結(jié)合,制備得到熒光膠乳微球;
b.將生物素與抗D-二聚體抗體A結(jié)合,制備得到生物素化抗D- 二聚體A抗體;
c.將步驟a所得熒光膠乳微球和步驟b所得生物素化抗D-二聚體抗體A混合,即得熒光膠乳微球標(biāo)記抗D- 二聚體抗體A ;
d.將步驟c所得熒光膠乳微球標(biāo)記抗D-二聚體抗體A涂覆結(jié)合墊上。2)硝酸纖維素膜的制備
用包被緩沖液分別稀釋抗D- 二聚體抗體B和兔抗鼠IgG抗體,并將稀釋后的兩種抗體分別平行地噴于硝酸纖維素膜上,兩種抗體滲入硝酸纖維素膜后分別形成抗D- 二聚體抗體B檢測(cè)線和兔抗鼠IgG抗體包被的質(zhì)控線。3)在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙得到試紙板,按照要求切割成適當(dāng)寬度的試紙條。所述膠乳微球粒徑范圍為50nm-500nm。所述突光為發(fā)射波長(zhǎng)在480nm-700nm自發(fā)突光物質(zhì),優(yōu)選異硫氰酸突光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、熒光素Cy5中的一種。所述抗D- 二聚體抗體是抗D- 二聚體單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段或嵌合抗體。所述結(jié)合墊材質(zhì)為聚酯膜或玻璃纖維素膜。本發(fā)明有益效果
本發(fā)明的試紙條能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)人血漿中D-二聚體含量,具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)。
圖I為本發(fā)明D- 二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條結(jié)構(gòu)示意圖2為本發(fā)明實(shí)施例I所制備的試紙條的校準(zhǔn)曲線;
圖3為本發(fā)明實(shí)施例I所制備的試紙條的線性范圍相關(guān)性;
圖4為本發(fā)明實(shí)施例I所制備的試紙條與德國(guó)Siemens公司D- 二聚體試劑盒檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性比較;
其中,圖I :1、底襯;2、第一層樣品墊;3、第二層樣品墊;4、結(jié)合墊;5、硝酸纖維素膜;
6、吸水紙;7、檢測(cè)線;8、質(zhì)控線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條,在底襯I上依次搭接地樣品墊2、3,結(jié)合墊4, 硝酸纖維素膜5和吸水紙6,所述結(jié)合墊4上噴涂有熒光膠乳微球標(biāo)記的抗D- 二聚體單克隆抗體Ml,所述硝酸纖維素膜5上有包被抗D- 二聚體單克隆抗體M2為檢測(cè)線7和兔抗鼠 IgG抗體作為質(zhì)控線8。以上抗體均購(gòu)自羅氏公司。上述硝酸纖維素膜上檢測(cè)線7還可以是包被抗D-二聚體的多克隆抗體,所述多克隆抗體是采用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法免疫鼠獲得抗血清制備而得。進(jìn)一步所述的膠乳微球粒徑范圍為50nm-500nm。所述突光為發(fā)射波長(zhǎng)在480nm-700nm自發(fā)突光物質(zhì),優(yōu)選異硫氰酸突光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、熒光素Cy5中的一種。實(shí)施例I
D- 二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條制備方法如下
O突光膠乳微球的制備
熒光膠乳微球的制備用吸附緩沖液(50mM、pH5. 8的檸檬酸鹽緩沖液)稀釋粒徑為 IOOnm膠乳微球至終濃度20mg/ml,體積為5ml,制得膠乳微球懸浮液;添加適量的突光素Cy5標(biāo)記鏈霉親和素(購(gòu)自上海研晶生物科技有限公司)在吸附緩沖液里,終體積為5ml ; 將上述膠乳微球懸浮液加入到上述含有熒光素標(biāo)記鏈霉親和素的吸附緩沖液中,制得混合液;將所得混合液在室溫下溫浴1-2小時(shí),并不斷攪拌,然后離心,收集沉淀,沉淀用儲(chǔ)存緩沖液(含有O. 05%BSA的吸附緩沖液)溶解,放置4°C保存,備用。2)生物素化抗D- 二聚體抗體A的制備
將抗D- 二聚體單克隆抗體Ml用O. lmol/L、pH8. O碳酸氫鈉緩沖液稀釋至lmg/ml,交互用O. lmol/L、pH8. O碳酸氫鈉緩沖液對(duì)D-二聚體抗體Ml充分透析;用Iml DMSO溶解Img 的NHSB,得到NHSB溶液;向上述ImlD- 二聚體單克隆抗體Ml加入20 μ I NHSB溶液,室溫?cái)嚢?-4小時(shí),繼續(xù)室溫?cái)嚢?0分鐘,然后用20mM、pH7. 2 PBS緩沖液透析,即得生物素化抗D- 二聚體單克隆抗體Ml。3)熒光膠乳微球標(biāo)記D- 二聚體抗體A的制備
將步驟I)制得的熒光膠乳微球和步驟2)制得的生物素化D- 二聚體抗體Ml混合在一起,反應(yīng)30分鐘后離心,沉淀用用儲(chǔ)存緩沖液溶解,恢復(fù)至原體積。4)包被熒光膠乳微球標(biāo)記D- 二聚體抗體A結(jié)合墊4的制備
將步驟3)制得的熒光膠乳微球標(biāo)記抗D- 二聚體抗體Ml,按3. O μ 1/cm3的用量噴在玻璃纖維素膜4上。5)硝酸纖維素膜5的制備
a)包被緩沖液的制備將O.025M、pH7. 4的PBS,用O. 22 μ膜過(guò)濾,置于4°C備用,有效期7天;
b)封閉液的制備將含1%BSA,1%蔗糖,O. 025M、ρΗ7· 5的PBS,用O. 22 μ膜過(guò)濾,置于 4°C備用,有效期3天;
c)D-二聚體抗體檢測(cè)線7的制備將抗D- 二聚體單克隆抗體M2按2mg/ml的濃度,蠕動(dòng)泵授液量O. 4ml/min,劃線速度50m/20min,在干燥箱內(nèi)20°C鼓風(fēng)干燥12小時(shí);
d)質(zhì)控線8的制備將兔抗鼠IgG抗體按8mg/ml的濃度,螺動(dòng)泵授液量O.4ml/min,劃線速度50m/20min,在硝酸纖維素膜5上劃線,該線與檢測(cè)線7平行,放入干燥箱內(nèi)20°C鼓風(fēng)干燥12小時(shí);
e)用上述封閉液將含有檢測(cè)線7和質(zhì)控線8的硝酸纖維素膜5于37°C封閉60分鐘, 取出后置37°C下烘干處理兩個(gè)小時(shí),封袋備用。6)試紙條組裝
在底襯I上順次相互搭接地粘貼樣品墊2、3,玻璃纖維素膜4,硝酸纖維素膜5和吸水紙6得到試紙板,按照要求切割成適當(dāng)寬度的試紙條。實(shí)施例2
另一種D- 二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條制備方法如下 O突光膠乳微球的制備
熒光膠乳微球的制備用吸附緩沖液(50mM、pH5. 8的檸檬酸鹽緩沖液)稀釋粒徑為 400nm膠乳微球至終濃度30mg/ml,體積為6ml,制得膠乳微球懸浮液;添加適量的紅色突光素羅丹明標(biāo)記鏈霉親和素(購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)在吸附緩沖液里,終體積為 6ml ;將上述膠乳微球懸浮液加入到上述含有紅色熒光素羅丹明標(biāo)記鏈霉親和素的吸附緩沖液中,制得混合液;將所得混合液在室溫下溫浴1-2小時(shí),并不斷攪拌,然后離心,收集沉淀,沉淀用儲(chǔ)存緩沖液(含有O. 06%BSA的吸附緩沖液)溶解,放置4°C保存,備用。2)生物素化抗D- 二聚體抗體A的制備
將抗D- 二聚體單克隆抗體Ml用O. lmol/L、pH8. O碳酸氫鈉緩沖液稀釋至lmg/ml,交互用O. lmol/L、pH8. O碳酸氫鈉緩沖液對(duì)D-二聚體抗體Ml充分透析;用Iml DMSO溶解Img 的NHSB,得到NHSB溶液;向上述ImlD- 二聚體單克隆抗體Ml加入25 μ I NHSB溶液,室溫?cái)嚢?-4小時(shí),繼續(xù)室溫?cái)嚢?0分鐘,然后用20mM、pH7. 2 PBS緩沖液透析,即得生物素化抗D- 二聚體單克隆抗體Ml。3)熒光膠乳微球標(biāo)記D- 二聚體抗體A的制備
將步驟I)制得的熒光膠乳微球和步驟2)制得的生物素化D- 二聚體抗體Ml混合在一起,反應(yīng)30分鐘后離心,沉淀用用儲(chǔ)存緩沖液溶解,恢復(fù)至原體積。4)涂覆熒光膠乳微球標(biāo)記D- 二聚體抗體A結(jié)合墊4的制備
將步驟3)制得的熒光膠乳微球標(biāo)記抗D- 二聚體抗體,按2 μ 1/cm3的用量噴在聚酯膜 4上。5)硝酸纖維素膜5的制備
a)包被緩沖液的制備將O.025M、pH7. 4的PBS,用O. 22 μ膜過(guò)濾,置于4°C備用,有效期7天;
b)封閉液的制備將含1%BSA,1%蔗糖,O. 025M、ρΗ7· 5的PBS,用O. 22 μ膜過(guò)濾,置于 4°C備用,有效期3天;
c)D- 二聚體抗體檢測(cè)線7的制備將抗D- 二聚體多克隆抗體按3mg/ml的濃度,蠕動(dòng)泵授液量O. 4ml/min,劃線速度50m/20min,在干燥箱內(nèi)20°C鼓風(fēng)干燥12小時(shí);
d)質(zhì)控線8的制備將兔抗鼠IgG抗體按8mg/ml的濃度,螺動(dòng)泵授液量O.4ml/min,劃線速度50m/20min,在硝酸纖維素膜5上劃線,該線與檢測(cè)線7平行,放入干燥箱內(nèi)20V鼓風(fēng)干燥12小時(shí);
e)用上述封閉液將含有檢測(cè)線7和質(zhì)控線8的硝酸纖維素膜5于37°C封閉60分鐘,取出后置37°C下烘干處理兩個(gè)小時(shí),封袋備用。6)試紙條組裝
在底襯I上順次相互搭接地粘貼樣品墊2、3,聚酯膜4,硝酸纖維素膜5和吸水紙6得到試紙板,按照要求切割成適當(dāng)寬度的試紙條。實(shí)施例3 D- 二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條定量檢測(cè)
3.I繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
在按實(shí)施例I制備好的D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條樣品墊上加入不同濃度 D- 二聚體抗原標(biāo)準(zhǔn)品(取七個(gè)不同濃度,分別為O、O. I、O. 5、I、2、5、10mg/L,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)),10分鐘后,通過(guò)南京基蛋生物科技有限公司的熒光免疫定量分析儀GeteinllOO讀取檢測(cè)線7和質(zhì)控線8信號(hào),實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見表I :
表I D-二聚體標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條,在底襯上依次搭接地粘貼樣品墊,結(jié)合墊,硝酸纖維素膜和吸水紙,其特征在于所述的結(jié)合墊上包被有熒光膠乳微球標(biāo)記的抗D-二聚體抗體A,所述的硝酸纖維素膜上包被有抗D- 二聚體抗體B為檢測(cè)線和兔抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條,其特征在于所述膠乳微球粒徑范圍為50nm-500nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條,其特征在于所述的熒光膠乳微球是由膠乳微球吸附熒光標(biāo)記的鏈霉親和素制備得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或3所述的D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條,其特征在于所述的突光為發(fā)射波長(zhǎng)在480nm-700nm自發(fā)突光物質(zhì),為異硫氰酸突光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、熒光素Cy5中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條,其特征在于抗D- 二聚體抗體是抗D-二聚體單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段或嵌合抗體。
6.一種如權(quán)利要求I所述D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條的制備方法,包括如下步驟1)包被熒光膠乳微球標(biāo)記D-二聚體抗體A結(jié)合墊的制備a.將熒光標(biāo)記的鏈霉親和素和膠乳微球吸附結(jié)合,制備得到熒光膠乳微球;b.將生物素與抗D-二聚體抗體A結(jié)合,制備得到生物素化抗D- 二聚體A抗體;c.將步驟a所得熒光膠乳微球和步驟b所得生物素化抗D-二聚體抗體A混合,即得熒光膠乳微球標(biāo)記抗D- 二聚體抗體A ;d.將步驟c所得熒光膠乳微球標(biāo)記抗D-二聚體抗體A噴涂在結(jié)合墊上;2)硝酸纖維素膜的制備用包被緩沖液分別稀釋抗D- 二聚體抗體B和兔抗鼠IgG抗體,并將稀釋后的兩種抗體分別平行地噴于硝酸纖維素膜上,兩種抗體滲入硝酸纖維素膜后分別形成抗D- 二聚體抗體B檢測(cè)線和兔抗鼠IgG抗體包被的質(zhì)控線;3)在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙得到試紙板, 按照要求切割成適當(dāng)寬度的試紙條。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條的制備方法,其特征在于所述的膠乳微球粒徑范圍為50nm-500nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條的制備方法,其特征在于所述的突光為發(fā)射波長(zhǎng)在480nm-700nm自發(fā)突光物質(zhì),為異硫氰酸突光素、四乙基羅丹明、 四甲基異硫氰酸羅丹明、熒光素Cy5中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條的制備方法,其特征在于所述的抗D- 二聚體抗體是抗D- 二聚體單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段或嵌合抗體。
10.權(quán)利要求I中所述的試劑條在檢測(cè)D-二聚體中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條,包括在底襯上依次搭接地粘貼樣品墊,結(jié)合墊,硝酸纖維素膜和吸水紙。樣品墊為兩層樣品墊,結(jié)合墊上包被有熒光膠乳微球標(biāo)記的抗D-二聚體抗體A,硝酸纖維素膜上包被有抗D-二聚體抗體B為檢測(cè)線和兔抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線;熒光膠乳微球是由膠乳微球吸附熒光標(biāo)記的鏈霉親和素制備得到。本發(fā)明試紙條能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)人血漿中D-二聚體含量,具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102692504SQ201210212130
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月26日
發(fā)明者周超, 涂策, 王勇, 蘇恩本, 陳偉, 黃力 申請(qǐng)人:南京基蛋生物科技有限公司