專利名稱：基于抗體功能化磁性納米材料和上轉(zhuǎn)換熒光納米材料檢測(cè)癌胚抗原的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米材料與生物技術(shù)領(lǐng)域，為一種基于抗體功能化磁性納米材料和上轉(zhuǎn)換熒光納米材料并結(jié)合抗原-抗體特異性反應(yīng)對(duì)癌胚抗原(CEA)進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒。特點(diǎn)在于抗-CEA第一抗體(捕獲抗體)功能化的磁性納米材料對(duì)樣本中抗原進(jìn)行分離富集，使得檢測(cè)靈敏度提高；同時(shí)利用抗-CEA第二抗體(檢測(cè)抗體)修飾的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料NaYa78F4: Yba2tl, Hoatl2作為標(biāo)記物通過檢測(cè)激光誘導(dǎo)上轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度。
背景技術(shù)：
抗原，是指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物——抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體內(nèi)外結(jié)合，發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。腫瘤相關(guān)抗原指在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加，而在正常細(xì)胞中僅微量合成的抗原分子。癌胚抗原(CEA)是最常用的腫瘤相關(guān)抗原，它是一種酸性糖蛋白，胚胎期在小腸、肝臟、胰腺合成，在正常人血清中僅微量存在。CEA最早被認(rèn)為是大腸癌的標(biāo)志物(60% -90%患者升高)，但以后發(fā)現(xiàn)胰腺癌( 80% )、胃癌( 60%)、肺癌( 75%)和乳腺癌( 60%)患者血清中也有較高的CEA表達(dá)。CEA作為一個(gè)廣譜性腫瘤標(biāo)志物，對(duì)消化道腫瘤和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測(cè)和預(yù)后估計(jì)據(jù)均具有重要價(jià)值。血清CEA檢測(cè)目前已經(jīng)成為使用最為廣泛的腫瘤輔助診斷及預(yù)后判斷手段。利用抗原-抗體特異性反應(yīng)原理開發(fā)抗原、抗體的檢測(cè)方法是目前免疫學(xué)檢測(cè)的基本思路，也是包括CEA在內(nèi)的各種腫瘤相關(guān)抗原檢測(cè)的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的CEA檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫分析(ELISA)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析、放射免疫分析等方法。這些方法在光學(xué)性能、穩(wěn)定性、敏感性、安全性、檢測(cè)時(shí)間或者儀器要求等方面均存在各自不足。如ELISA分析靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均欠佳；電化學(xué)發(fā)光免疫分析盡管提高了檢測(cè)靈敏度，但存在功能性電極制備困難及操作時(shí)間長等不足；而放射免疫分析則因?yàn)樾栎椛浞雷o(hù)的缺陷限制了其大規(guī)模推廣。所以有必要發(fā)展一種快速方便，穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、使用成本低的新型檢測(cè)方法。近年來納米材料與免疫學(xué)技術(shù)之間的關(guān)系越來越緊密，新型納米材料在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)中的發(fā)展前景也越來越廣闊。其中上傳換熒光納米材料和磁性納米材料其獨(dú)特的特性備受人們關(guān)注。在稀土摻雜的無機(jī)納米材料中，有一類特殊的發(fā)光材料，它能夠通過多光子機(jī)制把長波輻射(近紅外光)轉(zhuǎn)換成短波輻射，發(fā)射出比激發(fā)光波長短的熒光(紫外可見光)，即上轉(zhuǎn)換熒光。上轉(zhuǎn)換材料具有如下諸多優(yōu)點(diǎn)光化學(xué)穩(wěn)定，檢測(cè)背景低，穿透性強(qiáng)，并可以通過選擇不同的基質(zhì)材料和摻雜離子來調(diào)節(jié)納米粒子發(fā)射不同的上轉(zhuǎn)換熒光，真正實(shí)現(xiàn)單激發(fā)多發(fā)射，從而有利于同時(shí)檢測(cè)多組分。鑒于上述優(yōu)點(diǎn)，上轉(zhuǎn)換納米材料目前已成為一種優(yōu)秀的生物標(biāo)記材料。同時(shí)，在有些生物樣品的檢測(cè)中，由于被測(cè)目標(biāo)物質(zhì)含量很低，標(biāo)記與檢測(cè)中的分離步驟復(fù)雜，標(biāo)記樣品的分離與富集效率將直接影響檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。Fe3O4是應(yīng)用最為廣泛的磁性材料，在液體中以磁流體形式存在的Fe3O4磁性顆粒能夠在外在磁場(chǎng)的作用下，發(fā)生定向移動(dòng)。而且Fe3O4磁性磁性納米粒子性能穩(wěn)定，較易制備，經(jīng)過表面修飾可以和多種生物分子連接，可在外加磁場(chǎng)的作用下，實(shí)現(xiàn)這些分子的固定化或富集濃縮。因此，利用磁性納米材料和上轉(zhuǎn)換納米材料可快速有效地分離與富集目標(biāo)物質(zhì)，具有特異性高、分離快、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明首先合成得到了表面生物功能化的Fe3O4磁性納米材料和NaYa78F4 = Yba2tl,Ho0.02上轉(zhuǎn)換熒光納米材料，再通過磁性納米材料結(jié)合的抗-CEA第一抗體(捕獲抗體)利用抗原-抗體反應(yīng)特異性捕獲待測(cè)樣本中的CEA，并通過磁分離加以富集分離，再與抗-CEA第二抗體(檢測(cè)抗體)標(biāo)記的上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子結(jié)合形成CEA捕獲抗體/CEA/CEA檢測(cè)抗體三明治結(jié)構(gòu)樣的納米顆粒復(fù)合物。以980nm激光激發(fā)誘導(dǎo)上轉(zhuǎn)換熒光為檢測(cè)信號(hào)，以不同濃度CEA標(biāo)準(zhǔn)品的建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在980nm激光誘導(dǎo)下，NaY0.78F4: Yb0.20, Hoatl2上轉(zhuǎn)換熒光納米材料產(chǎn)生的發(fā)光信號(hào)(波長為542nm)與CEA的量正相關(guān)，以達(dá)到對(duì)含CEA樣品進(jìn)行定量檢測(cè)的目的。該發(fā)明可用于人血清樣本中CEA含量的測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為一種基于抗體功能化磁性納米材料磁分離-上轉(zhuǎn)換熒光納米材料標(biāo)記檢測(cè)CEA的試劑盒，所述試劑盒包括作為抗原捕獲和磁分離試劑的抗-CEA第一抗體(捕獲抗體)功能化的磁性納米材料；表面修飾了抗-CEA第二抗體(檢測(cè)抗體)的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料構(gòu)成的熒光探針；陽性對(duì)照；陰性對(duì)照；抗原標(biāo)準(zhǔn)品。CEA標(biāo)準(zhǔn)品為已知質(zhì)量的CEA抗原凍干粉，陽性對(duì)照為含有一定濃度(1-lOng/mL) CEA的人血清，陰性對(duì)照為PBS緩沖液(pH = 7. 4)。分別制備得到NaYa78F4 = Yba2t^Hoatl2上轉(zhuǎn)換熒光納米材料和氨基化的Fe3O4磁性納米球，對(duì)納米粒子進(jìn)行表面功能化修飾，隨后將氨基化的Fe3O4磁性納米球與抗-CEA第一抗體結(jié)合，用作捕獲和磁分離試劑，而將NaYa78F4 = Ybtl, Ho0.02上轉(zhuǎn)換熒光納米材料與抗-CEA第二抗體(檢測(cè)抗體)結(jié)合，構(gòu)成標(biāo)記的檢測(cè)探針。當(dāng)向CEA捕獲抗體功能化磁性納米材料體系中加入CEA時(shí)，兩者通過抗原-抗體反應(yīng)發(fā)生特異性結(jié)合，經(jīng)洗滌和磁分離步驟并除去上清后,加入CEA檢測(cè)抗體標(biāo)記的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料，CEA檢測(cè)抗體標(biāo)記的磁性納米材料通過抗原-抗體反應(yīng)與CEA檢測(cè)抗體標(biāo)記的熒光探針結(jié)合形成CEA捕獲抗體/CEA/CEA檢測(cè)抗體三明治結(jié)構(gòu)樣的納米顆粒復(fù)合物，經(jīng)洗滌和磁分離后，再以980nm激光誘導(dǎo)NaY0.78F4:Yb0.20,Ho0.02上轉(zhuǎn)換熒光納米材料發(fā)光。在一定范圍內(nèi)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度與CEA含量相關(guān)，基于此對(duì)CEA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以達(dá)到對(duì)含CEA樣品進(jìn)行定量檢測(cè)的目的。有益效果(I)本發(fā)明利用980nm激光誘導(dǎo)上轉(zhuǎn)換熒光為檢測(cè)信號(hào)，無背景光及自發(fā)熒光干擾，解決了 FITC、RB200標(biāo)記抗體的免疫學(xué)分析技術(shù)的背景光干擾及選擇性不佳的缺點(diǎn)，大大減低了信噪比，提高了檢測(cè)穩(wěn)定性和特異性。(2)本發(fā)明利用CEA抗體功能化的磁性納米球?qū)悠分心繕?biāo)抗原進(jìn)行分離富集濃縮，檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)周期短，且操作簡(jiǎn)單。


圖I :基于抗體功能化磁性納米材料磁分離-上轉(zhuǎn)換熒光納米材料標(biāo)記檢測(cè)CEA的實(shí)驗(yàn)原理2 : (a) =NaY0.78F4: Yb0.20，Ho0.02 上轉(zhuǎn)換熒光納米材料電鏡圖；(b) NaY0.78F4: Yb0.20，Ho0.02, SiO2上轉(zhuǎn)換熒光納米材料電鏡圖。圖3 : (a):抗-CEA—抗(0. lmg/mL)及其修飾后磁性納米材料的紫外吸收光譜,其中A為抗-CEA —抗，B為抗-CEA —抗修飾后磁性納米材料；(b):抗-CEA 二抗(0. 15mg/mL)及其修飾后上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的紫外吸收光譜，其中A為抗-CEA 二抗，B為抗-CEA 二抗修飾后上轉(zhuǎn)換熒光納米材料。圖4 :抗體與納米顆粒結(jié)合后的紫外吸收光譜。a :抗-CEA —抗與磁性納米顆粒(2mg mL—1)結(jié)合，b :抗-CEA 二抗與上轉(zhuǎn)換突光納米材料(2mg mL—1)結(jié)合。圖5 :CEA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，濃度范圍在2. 5 X IO^12-I X IO^8g mL_具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :表面修飾的磁性納米材料和上轉(zhuǎn)換納米顆粒的制備(I)運(yùn)用水熱-溶劑熱技術(shù)制備NaYa78F4 = Yba2tl, Hoatl2上轉(zhuǎn)換納米顆粒，并對(duì)其做表面修飾。稱取 0. 18g Y2O3 (28% ),0. 788g Yb2O3 (70% )和 0. 022g Er2O3 (2% )混合物加入硝酸中加熱溶解，揮發(fā)掉多余硝酸后得到稀土元素的硝酸鹽粉末，將其溶解在SmL去離子水中，再加入I. 0635g二水合乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)，并調(diào)節(jié)pH至弱堿性，形成澄清透明的EDTA-Ln溶液。取25mL乙二醇，加入3mL HF和0. 4g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，邊攪拌邊加入8mL上述EDTA-Ln溶液，得到白色乳狀膠體。最后加入5. 5mL濃硝酸，攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移到50mL帶聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，195°C反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，讓其在空氣中自然冷卻至室溫，棄上層液體，釜底的固體用熱水沖洗到燒杯中，超聲10分鐘，然后靜置數(shù)分鐘，棄去上層液體，再加入熱水超聲，重復(fù)3次。然后加乙醇超聲分散，最后離心所得固體置于70°C烘箱干燥10h，固體粉末儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2)利用改進(jìn)的StSber法對(duì)上轉(zhuǎn)換納米粒子進(jìn)行表面氨基化修飾。將60mg處理后的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料加入盛有60mL異丙醇的250mL錐形瓶中，超聲40min達(dá)到完全分散。在快速磁力攪拌下依次加入20mL蒸懼水、2. 5mL 25%的氨水，封口。在35°C下,磁力攪拌IOmin后加入逐滴加入20mL異丙醇和50 y L正娃酸乙酯的混合溶液。反應(yīng)3h后，再逐滴加入30mL異丙醇和200 y L的3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液，繼續(xù)反應(yīng)Ih后停止攪拌，室溫下陳化2h。最后將產(chǎn)物離心分離，水洗多次，60°C烘干12h，得到表面有氨基修飾的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料NaYa78F4 = Yba2tl, Hoatl2t5(3)采用一步法制備表面氨基化的磁性納米顆粒。向30mL乙二醇中，加入6. 5gl，6_己二胺、2. Og無水醋酸鈉(CH3COONa)和l.Og六水合三氯化鐵(FeCl3. 6H20)。然后加熱至50°C，攪拌形成均勻的膠體溶液。將所得溶液轉(zhuǎn)移到50mL帶聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，在198°C件下反應(yīng)6h。取出反應(yīng)釜后，在室溫下自然冷卻，棄釜內(nèi)上層液體，下層黑色固體用去離子水沖洗至燒杯中，然后利用磁分離收集。超聲條件下，再用水分散，然后磁分離收集，按上面方法再用乙醇洗滌2次，所得黑色固體在50°C條件下干燥5-1 Oh。(4)磁性納米顆粒與抗-CEA第一抗體(捕獲抗體)的結(jié)合。將IOmg表明氨基化的Fe3O4磁性納米顆粒加入到5mL IOmM PBS緩沖液(pH7. 4)，超聲分散20分鐘后，加入I. 25mL 25%戊二醛和IOOmg NaBH40將混合溶液在室溫下緩慢搖晃lh，反應(yīng)結(jié)束后磁性納米材料經(jīng)過磁分離，得到的固體粉末用IOmM PBS洗3次以徹底去除戊二醛。粉末再用IOmM PBS溶解，超聲分散開，加入5mL 0. Img -m^1的抗-CEA—抗，此溶液在室溫下緩慢搖晃6h，反應(yīng)結(jié)束后清洗多次，棄上清。所得沉淀物，即磁性納米顆粒/抗-CEA —抗復(fù)合物(捕獲探針)，用5mL0. OlM PBS緩沖液重懸，在4°C條件下保存?zhèn)溆谩?5)上轉(zhuǎn)換納米顆粒與抗-CEA第二抗體(檢測(cè)抗體)的結(jié)合。將IOmg氨基修飾的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料加入到5mL IOmM PBS緩沖液(pH7. 4)，超聲分散20分鐘后，加入1.25mL 25%戊二醛和IOOmg NaBH4。將混合溶液在室溫下緩慢搖 晃lh，反應(yīng)結(jié)束后磁性納米材料經(jīng)過磁分離，得到的固體粉末用IOmM PBS洗3次以徹底去除戊二醛。粉末再用IOmM PBS溶解，超聲分散開，加入5mL 0. 15mg mL—1的抗-CEA 二抗，此溶液在室溫下緩慢搖晃6h，反應(yīng)結(jié)束后清洗多次，棄上清。所得沉淀物，即上轉(zhuǎn)換納米顆粒/抗-CEA 二抗復(fù)合物(捕獲探針)，用5mL IOmM PBS緩沖液重懸，在4°C條件下保存?zhèn)溆?。?shí)施例2 :標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用PBS 緩沖液配制不同濃度(lX10_12、5X10_12、lX10_n、5X10_n、lX10_1C1、5X10_1Q、lX10_9、5X10_9、lX10_8g .rnL-1)的 CEA 標(biāo)準(zhǔn)品，分別取 IOOy L 不同濃度 CEA 標(biāo)準(zhǔn)品與等體積0. Img ^mL-1CEA抗體標(biāo)記的磁性納米顆粒充分混合,磁分離5分鐘去除上清液，重懸磁性納米顆粒并用PBS緩沖液洗滌、磁分離3次以徹底去除未結(jié)合的CEA分子。再加入上轉(zhuǎn)換納米顆粒/抗-CEA 二抗復(fù)合物，充分混勻并孵育30min后再經(jīng)過磁分離棄上清，清洗3遍以保證徹底去除未結(jié)合的檢測(cè)探針。用100 u L0. OlM PBS緩沖液重懸沉淀，在980nm激光激發(fā)下得到542nm處的上轉(zhuǎn)換熒光信號(hào)，熒光信號(hào)(I)隨著CEA濃度的增加而逐步增強(qiáng)。根據(jù)熒光強(qiáng)度與對(duì)應(yīng)的CEA標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本檢測(cè)方法在2. 5X 10_12-1 X 10_8g Hir1CEA濃度區(qū)間內(nèi)得到良好線性關(guān)系。實(shí)施例3 血清樣品中CEA的檢測(cè)取7例臨床血清標(biāo)本及CEA抗原標(biāo)準(zhǔn)品，血清標(biāo)本用PBS緩沖液稀釋10倍，CEA標(biāo)準(zhǔn)品用 PBS 緩沖液配成不同濃度(I X 1(T12、5X 10-12、1 X l(Tn、5X l(Tn、l X 1(T10、5 X 1(T10、IX 1(T9、5X 10'1X l(T8g mr1)。利用本試劑盒和電化學(xué)發(fā)光試劑盒(Roche診斷公司產(chǎn)品)分別測(cè)定這些標(biāo)本中CEA的含量，結(jié)果見表一，將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性比較，兩者無顯著差異，結(jié)果具有很高相關(guān)性(R = 0. 9929，P < 0. 0001)。說明本發(fā)明的CEA檢測(cè)試劑盒與國外知名廠家生產(chǎn)的類似產(chǎn)品相比，技術(shù)指標(biāo)大致相當(dāng)，但本試劑盒檢測(cè)快速可靠，靈敏度更高，穩(wěn)定性更好，適合用于臨床血清樣品中CEA的檢測(cè)。表一臨床血清樣品CEA檢測(cè)，本發(fā)明方法與電化學(xué)發(fā)光方法對(duì)比
權(quán)利要求
1.一種癌胚抗原(CEA)檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括 作為抗原捕獲和磁分離試劑的捕獲抗體功能化的磁性納米材料；表面修飾了檢測(cè)抗體的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料構(gòu)成的熒光探針；陽性對(duì)照；陰性對(duì)照；抗原標(biāo)準(zhǔn)品。
2.如權(quán)利要求I所述的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述抗原捕獲和磁分離試劑是Fe3O4磁性納米微球與抗-CEA第一抗體共價(jià)結(jié)合組裝得到的CEA捕獲抗體功能化的磁性納米材料。
3.如權(quán)利要求I所述的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述熒光探針是NaY0.78F4: Yb0.20, Ho0.02上轉(zhuǎn)換熒光納米材料和抗-CEA第二抗體結(jié)合組裝得到的表面修飾了CEA檢測(cè)抗體的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料。
4.如權(quán)利要求I所述的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)抗體標(biāo)記的熒光探針是以980nm激光誘導(dǎo)NaYa78F4 = Yba2tl, Hoatl2上轉(zhuǎn)換熒光獲得檢測(cè)信號(hào)。
5.如權(quán)利要求I所述的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于，抗-CEA第一抗體濃度為O.Img · πι Λ其與Fe3O4磁性納米微球的質(zhì)量比例為I 100。
6.如權(quán)利要求I所述的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于，抗-CEA第二抗體濃度為O. 15mg · mL-1，與NaYa78F4: Yb0.20，Hoa02上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的質(zhì)量比例為3 200。
7.如權(quán)利要求I所述的癌胚抗原檢測(cè)試劑盒，其特征在于抗原標(biāo)準(zhǔn)品CEA抗原凍干粉；陽性對(duì)照為含有一定濃度CEA的人血清；陰性對(duì)照為PBS緩沖液，pH = 7. 4。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用抗體功能化磁性納米材料和上轉(zhuǎn)換熒光納米材料及抗原-抗體反應(yīng)對(duì)癌胚抗原(CEA)進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒。本發(fā)明利用抗-CEA第一抗體(捕獲抗體)功能化的磁性納米材料對(duì)樣本中的CEA進(jìn)行富集和分離；同時(shí)利用上轉(zhuǎn)換熒光納米材料激光誘導(dǎo)熒光的高靈敏度和有效避免樣本生物背景熒光干擾的特點(diǎn)，用抗-CEA第二抗體(檢測(cè)抗體)標(biāo)記上轉(zhuǎn)換熒光納米材料NaY0.78F4:Yb0.20，Ho0.02作為檢測(cè)探針，并將這兩種納米材料與抗原-抗體特異性反應(yīng)原理相結(jié)合建立一種高度靈敏、穩(wěn)定、快速的CEA檢測(cè)方法。該試劑盒可用于臨床或科研中檢測(cè)CEA的含量，用以腫瘤的輔助診斷、指導(dǎo)治療及提示預(yù)后。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102636649SQ20121006266
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月4日
發(fā)明者華東, 吳世嘉, 王周平, 黃朝暉 申請(qǐng)人:無錫市第四人民醫(yī)院, 江南大學(xué)