專利名稱：一組用于結核分枝桿菌實時熒光pcr檢測的引物探針及其使用方法
技術領域：
本發(fā)明針對結核分枝桿菌(M. Tuberculosis, MTB) IS6110序列設計并篩選出的一組特異引物和探針，用于結核分枝桿菌實時熒光PCR檢測，屬于生物技術領域。
背景技術：
TB是由MTB感染引起的一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病。MTB可以在人體內(nèi)潛伏感染長達數(shù)年乃至終生，全球人口的三分之一(約20億)被認為感染了潛伏態(tài)的TB，中國人群中約44. 6%有潛伏TB感染，而且其中超過10%的人在他們的一生中會發(fā)展成活動性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO) 2010年全球TB控制報告，2009年全球因TB死亡約170萬，新增TB病人約940萬。這些病人大多集中在診斷治療技術落后、缺乏資金支持的發(fā)展中國家。我國的TB病人數(shù)居世界第二位，僅次于印度，每年發(fā)病發(fā)病人數(shù)約130萬，成為我國急需關注的公共衛(wèi)生問題和社會問題。體內(nèi)潛伏MTB被激活以及肺結核(Pulmonary Tuberculosis, PTB)病源傳染是導致大多數(shù)PTB發(fā)病的主要原因。提高檢測陽性率和及早診斷治療MTB感染者是控制TB傳播的最直接有效的手段之一。及早發(fā)現(xiàn)活動性PTB病人，及時采取隔離和治療措施，則能顯著降低發(fā)病率、死亡率和傳染率。目前常見TB診斷方法有結核菌菌數(shù)皮試試驗(PPD)、計算機斷層掃描(CT)、痰涂片法和痰培養(yǎng)法。PPD因為特異性差，容易出現(xiàn)假陽性結果而不能作為診斷依據(jù)；CT靈敏度低，只有在有出現(xiàn)肺部病灶時才能被診斷，達不到早期診斷效果，而且肺結核與其他肺部疾病難以區(qū)分，且不能作為確診診斷；痰涂片法簡單快速，但靈敏度不高，不能區(qū)分MTB和其他抗酸分支桿菌；培養(yǎng)法被譽為TB診斷“金標準”，可以鑒定MTB與其他分支桿菌，但診斷周期長，通常需要4 8周，且靈敏性低，延誤病人治療。近十年來興起的TB分子診斷技術如實時熒光PCR(Real Time PCR, RT PCR)等，提高了 TB診斷的靈敏度和特異性。RT PCR利用一對MTB特異性引物和特異性熒光探針，配以PCR反應液、耐熱DNA聚合酶(Taq emzyme)、4種脫氧核酸苷酸(dNTP)等成分，用體外熱循環(huán)擴增法檢測MTB基因片段，通過檢測熒光強度變化來判斷標本中是否存在MTB DNA。RTPCR檢測對象為病原體基因保守序列，不受細胞表型和耐藥性影響，可提高陽性檢出率和結果準確性，而且在數(shù)小時內(nèi)即可報告結果?，F(xiàn)有的RT PCR雖然能提高TB檢測靈敏性和特異性，但其在痰涂片陰性病人(包括菌陰病人)檢測陽性率依然有待提高。目前涂片陰性病人在總TB病人數(shù)60%左右，該部分病人因痰液中MTB菌量不高而難以被檢測。雖然涂陰病人吐菌量不高，但他們是TB重要傳染源之一。據(jù)報道，約20%受檢查的涂陰病人密切接觸者最終被確診為TB。因此如何提高TB涂陰病人中檢測陽性率，是RT PCR亟需解決的問題。RT PCR體系中引物和探針的選擇和設計是提高RT PCR檢測效率的有效辦法，本發(fā)明針對MTB復合群基因組重復性因子插入序列IS6110設計和篩選出一組用于熒光PCR的高特異性和靈敏度的引物和探針序列及其使用方法。本發(fā)明方法采用熒光PCR檢測法，應用TaqMan熒光探針原理，加入一對TB復合群的特異性引物和一條特異性熒光雙標記探針，兩端分別標記一個報告熒光基團(FAM)和一個淬滅熒光基團(Taqman-MGB)。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5' -3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，通過檢測熒光信號的增加來判斷結果陽性，提示標本含有TB DNA。本發(fā)明方法具有以下特點<i>靈敏度高；<ii>兼容性好；<iii>高通量；<iv>特異性高。由本發(fā)明設計的引物探針序列建立的TB實時熒光PCR檢測方法能明顯提高RT PCR檢測效率，通過臨床標本檢測證實其在涂陰病人標本和血標本檢測陽性率高于其他RT PCR檢測。此外，本發(fā)明可用于對TB藥物治療效果評價、指導用藥和病情進展等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于設計一組高敏感和特異性的引物探針序列，用于結核分枝桿菌熒光PCR檢測，進一步提高熒光PCR檢測靈敏度。本發(fā)明設計的引物探針以及基于該引物探針所建立的熒光PCR能有效提高臨床上結核涂陰病人和血標本的檢出率。作為本發(fā)明的核心，所述的一組用于MTB實時熒光PCR檢測的核苷酸序列SEQ ID NO. 1 :GTC CAC GCC GCC AAC TACSEQ ID NO. 2 :ATG CCC TCA CGG TTC AGGSEQ ID NO. 3 =FAM-CCG CAAAGT GTG GCT A-MGB其中，SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2為實時熒光PCR檢測結核分枝桿菌的引物對；SEQ ID N0. 3是實時熒光PCR檢測結核分枝桿菌的探針序列。基于上述引物探針序列，本發(fā)明對所述的熒光PCR反應體系進行優(yōu)化，其中體系各組分濃度如20mM Tris-HCl (pH8. 0), 20mM KCl，5mM (NH4) SO4，2mM MgCl2, 0. 2mM dNTP(dATP,dCTP, dUTP, dGTP 或 dTTP)，0. 4mM 引物 1，0. 4mM 引物 2，0. 2mM 探針，1. 5U Hot Start Taqemzyme 禾口 0. IUUNG 酶；上述PCR反應體系中的引物1、2分別對應為SEQ ID NO. 1、2 ；探針為SEQ ID N0. 3。針對上述引物探針序列和PCR反應體系，設置的PCR反應參數(shù)為第一步^TC 5分鐘；第二步％°C 10分鐘；第三步％°C 15秒，迎。C M秒40個循環(huán)。迎。C時設置FAM熒光通道采集熒光。


圖1 為應用本發(fā)明設計的引物探針所建立的實時熒光PCR特異性實驗檢測圖。圖2 為應用本發(fā)明設計的引物探針所建立的實時熒光PCR敏感性實驗檢測圖。圖3 為應用本發(fā)明設計的引物探針所建立的實時熒光PCR對涂片陰性痰標本檢測圖。圖4 為應用本發(fā)明設計的引物探針所建立的實時熒光PCR對血標本檢測圖。
具體實施例方式實施例1 :MTB實時熒光PCR檢測法的引物和探針設計
從MTB基因組DNA中選擇一條高度保守多拷貝數(shù)的IS6110基因(GenebankNo.NC_000962)，針對該基因，用多種軟件，根據(jù)引物的退火溫度在55_65°C的原則，篩選出28組引物，經(jīng)PCR比較結果后，選擇了引物SEQ ID NO. 1和NO. 2, Blast同源性分析顯示確認，選擇的引物為TB復合群特異性序列，與其他序列無同源性。根據(jù)引物退火溫度為60°C，探針退火溫度高于引物退火溫度10°C左右的原則，探針SEQ ID NO. 3。擴增產(chǎn)物長度為70bp。探針5’端標記FAM發(fā)光熒光基團，3’端標記Taqman-MGB淬滅熒光基團。PCR引物、探針序列見序列表。實施例2 本發(fā)明MTB實時熒光PCR檢測臨床標本具體操作1)配制反應液根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容2所述，在試劑準備區(qū)配制PCR反應，各物質濃度如下:20mM Tr i s-HCl (pH8.0),20mM KCl，5mM (NH4) SO4，2mM MgCl2,0. 2mM dNTP，0.4mM 引物1，0· 4mM 引物 2，0· 2mM 探針，1. 5U Hot Start Taq emzyme 和 0. IU UNG ；配制反應液時，應包含2個對照管的反應液，包括陰性對照和陽性對照。2)加模板在樣本區(qū)，每個反應加2ul模板DNA，陰性對照用無菌生理鹽水，陽性對照用結核分枝桿菌標準株H37Rv基因組DNA。蓋上反應管蓋或96孔板膜。3) PCR檢測在檢測區(qū)，將配制好的PCR反應管放到ABI 7500熒光PCR儀上，按照實驗設計設定陰陽性對照孔，循環(huán)程序參數(shù)設定為第一步^TC 5分鐘；第二步迆。C 10分鐘；第三步迆。C 15秒，迎。C M秒:40個
循環(huán)。迎。C時設置FAM熒光通道采集熒光。4)結果解釋將背景熒光設置為None，閾值基線設定為6至lOcycles，閾值設定為閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線及背景信號的最高點為準，并落在陽性對照擴增曲線對數(shù)增長區(qū)段。Ct值顯示為None的樣本為陰性樣本，Ct值小于或等于38的樣本為陽性。Ct值大于38的樣本可重復一次PCR實驗，若仍出現(xiàn)Ct值，即可判斷為陽性。 實施例3 =MTB實時熒光PCR檢測法特異性研究選擇MTB熒光PCR檢測試劑盒國家標準品中陰性參考品的15種非結核分枝桿菌DNA作為模板，包括鳥分枝桿菌、土地分枝桿菌、施氏分枝桿菌、堪薩斯分支桿菌、亞洲分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌、龜膿分枝桿菌、偶然分枝桿菌、草分枝桿菌、巴西諾卡氏菌、北京棒桿菌、肺炎球菌、嗜肺軍團菌、百日咳博德特氏菌。以MTB標準株H37Rv DNA作為本次實驗陽性對照。用本發(fā)明RT PCR檢測，模板量均為2ul，每個反應3個重復。結果顯示，只有MTB標準株H37Rv DNA檢測為陽性，其他均為陰性，證實本發(fā)明的引物與探針特異性極好。結果見附圖1，擴增曲線為陽性對照。實施例4 =MTB實時熒光PCR檢測法靈敏度研究為考察本發(fā)明MTB實時熒光PCR檢測法靈敏性，本實驗根據(jù)MTB基因組大小，用TE buffer將提取的MTB基因組DNA稀釋成8個系列濃度，分別相當于為5 X 106、5 X 105、5X104、5X103、5X102、50、5jP0. 5，單位為菌數(shù)/ul。應用本發(fā)明設計的MTB實時熒光PCR對8個系列濃度的MTB基因組DNA檢測，以及TE buffer為模板的陰性對照，每個濃度設3個重復，模板量為2ul，即每個反應中加入DNA量為1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X IO4、1 X 103、100、10和1個結核菌基因組DNA量。本發(fā)明的MTB實時熒光PCR檢測法靈敏度可達1個結核菌基因組DNA量。結果見附圖2，為應用本發(fā)明設計的引物探針所建立的實時熒光PCR敏感性實驗檢測圖。實施例5 由本發(fā)明設計的引物探針建立的MTB實時熒光PCR檢測法檢測臨床標本結果與RTPCR試劑盒比較為進一步證實MTB實時熒光PCR檢測法在TB臨床標本檢測靈敏性，本實驗選擇了國內(nèi)已上市的TB診斷被認為較好的RT PCR檢測試劑盒作為對比試劑，共同對由廣州市胸科醫(yī)院收集的病人痰標本和血標本進行檢測。入選標本分為3個隊列1、痰涂片陽性組，100例；2、痰涂片陰性組，150例；3、健康人和其他肺部疾病對照組，150例。其中隊列1和隊列2為臨床診斷為TB。最終的結果比較如表1 :表1兩種RT PCR結果比較(例)
權利要求
1.一種用于結核分枝桿菌實時熒光PCR檢測方法，其特征在于，所述的結核分枝桿菌實時熒光PCR檢測方法包括以結核桿菌復合群IS6110序列為目標序列設計并篩選的一組引物探針序列、基于該組引物探針序列所建立的熒光PCR反應體系以及PCR熱循環(huán)參數(shù)。
2.根據(jù)權利要求1所述的一組用于結核分枝桿菌實時熒光PCR檢測方法的核苷酸序列，其特征在于，序列表SEQ ID NO. 1至序列SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列SEQ ID NO. 1 :GTC CAC GCC GCCAAC TACSEQ ID NO. 2 :ATG CCC TCA CGG TTC AGGSEQ ID NO. 3 =FAM-CCG CAA AGT GTG GCT A-MGB其中，EQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2為熒光PCR檢測結核分枝桿菌的引物對；SEQ ID NO. 3 是熒光PCR檢測結核分枝桿菌的探針序列。
3.根據(jù)權利要求1所述的基于本發(fā)明設計的引物探針序列所建立的熒光PCR反應體系，其特征在于，反應體系的各組分濃度為20mM Tris-HCl (pH8. 0), 20mM KCl，5mM(NH4) SO4，2mM MgCl2,0. 2mM dNTP(dATP, dCTP, dUTP，dGTP 或 dTTP)，0. 4mM 引物 1，0. 4mM 引物 2，0. 2mM 探針，1. 5U Hot Start Taq emzyme 和 0. IU UNG 酶；上述PCR反應體系中的引物1、2分別對應為SEQ ID NO. 1、2 ；探針為SEQ ID N0. 3。
4.根據(jù)權利要求3所述的熒光PCR反應體系所設置的熱循環(huán)參數(shù)，其特征在于 第一步^TCg分鐘；第二步分鐘；第三步:95°C 15秒，60°C 60秒40個循環(huán)。迎。C時設置FAM熒光通道采集熒光。
全文摘要
本發(fā)明公開了針對結核分枝桿菌(M.Tuberculosis，MTB)IS6110序列設計并篩選出的一組特異引物和探針及其使用方法，用于結核分枝桿菌DNA檢測的實時熒光PCR，PCR反應體系包括防污染的UNG酶，屬于生物技術領域。應用本發(fā)明引物和探針建立的實時熒光PCR檢測靈敏度高，特異性強，尤其在MTB載量低的痰涂片陰性痰標本和血標本中的檢測陽性率高于其他同類檢測方法。
文檔編號G01N21/64GK102559905SQ20121002338
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月2日 優(yōu)先權日2012年2月2日
發(fā)明者TuofuZhu(朱托夫) 申請人:廣州海力特生物科技有限公司