專利名稱：一種檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，同時(shí)還涉及ー種該試驗(yàn)盒在檢測樣品中銅離子含量方面的應(yīng)用，屬于酶聯(lián)免疫檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
銅在土壌中和農(nóng)作物中積累，會污染糧食籽粒，進(jìn)而銅在農(nóng)畜等產(chǎn)品中有不同程度的殘留，造成農(nóng)畜產(chǎn)品中銅污染超標(biāo)，嚴(yán)重影響我國農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量和國際競爭力，而且還嚴(yán)重危害人類的身體健康。因此，世界各國都十分重視環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品重金屬污染的控制和監(jiān)測。傳統(tǒng)的重金屬銅檢測方法如原子吸收光譜分析、電感耦合等離子發(fā)射光譜分析等需要大型的昂貴的分析儀器，無法用于現(xiàn)場檢測，難以適應(yīng)環(huán)境及農(nóng)畜產(chǎn)品的現(xiàn)場抽查及產(chǎn)品進(jìn)出口快速通關(guān)的要求。因此，需要發(fā)明ー種新的重金屬銅檢測方法以解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種快速檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒。同時(shí)，本發(fā)明的目的還提供了一種試驗(yàn)盒在檢測樣品中銅離子含量方面的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了 ー種快速檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括銅離子特異性抗體、銅離子-載體蛋白偶聯(lián)物和酶標(biāo)ニ抗，其中銅離子特異性抗體為鼠抗銅離子的單克隆抗體，可用銅離子與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原通過免疫動物(例如鼠)制得。所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或鑰孔銅蘭蛋白(KLH)、鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、兔血清蛋白或人血清白蛋白等常用載體蛋白。所述銅離子與載體蛋白的偶聯(lián)物可通過將銅離子與雙功能螯合劑螯合后再與載體蛋白采用化學(xué)方法偶聯(lián)得到。所述酶標(biāo)ニ抗的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。所述酶標(biāo)ニ抗可以用商品化的辣根過氧化物酶酶標(biāo)ニ抗，也可以通過過碘酸鈉法或戊ニ醛法將辣根過氧化物酶或堿性磷酸酸酶與ニ抗偶聯(lián)制得。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酶標(biāo)ニ抗為羊抗鼠IgG抗體。用于制備所述酶標(biāo)板的固相材料，包括聚苯こ烯、聚こ烯、聚丙烯；載體的形式是微量反應(yīng)板凹孔。為了方便現(xiàn)場檢測和大量樣本篩查，所述試劑盒還可以進(jìn)一歩包括銅離子抗原或抗銅離子特異性抗體的酶標(biāo)板、銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。所述的洗滌液為O. 05% -0.5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑由顯色劑A液和顯色劑B液組成(例如，體積比為1:1)，顯色劑A液為過氧化氫或過氧化脈，顯色劑B液為鄰苯ニ胺或四甲基聯(lián)苯胺。所述的濃縮樣品稀釋液為含O. 1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
所述當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，底物顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化服，所述顯色液B液為鄰苯ニ胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為l-2mol硫酸；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酶時(shí)，顯色液為對硝基苯磷酸緩沖液，終止液為l-2mol/L氫氧化鈉溶液。所用的封閉液含有10%兔血清，O. 1%。疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為用包被緩沖液將包被原稀釋O. 05-0. I μ g/ml，每孔加入100 μ 1，37°C溫育2h，再4°C過夜，傾去包被液,用洗滌液洗滌2次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200川封閉液，37°C溫育l_2h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真
空密封保存。另ー方面，本發(fā)明還提供了一種檢測水、牛奶等樣品中銅離子含量的方法，包括步驟 (I)樣品前處理；(2)用、試劑盒進(jìn)行檢測，向包被有銅離子抗原的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，再加入抗銅離子多克隆抗體，孵育后洗滌拍干，加入酶標(biāo)記ニ杭，孵育后洗滌拍干，顯色、終上，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；(3)分析檢測結(jié)果。本發(fā)明中抗原的合成過程為I.銅離子完全抗原的制備將銅離子先與雙功能螯合劑通過羧基發(fā)生螯合，再與載體蛋白反應(yīng)，通過硫脲基偶聯(lián)得到完全抗原。銅離子是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須先與雙功能螯合劑通過羧基發(fā)生螯合再與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。2.銅離子鼠單克隆抗體的制備動物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動物，以銅離子與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原，得到較好的多克隆抗體，取出脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合與克隆化取免疫BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選細(xì)胞株，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明抗體的制備過程羊抗鼠抗抗體是以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病菌體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。本發(fā)明試劑盒的檢測原理為將銅離子抗原吸附于固相載體上，加入樣本或銅離子標(biāo)準(zhǔn)品溶液并加入銅離子抗體工作液，待測樣品中銅離子和固相載體上包被的銅離子抗原競爭銅離子抗體，再加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行酶活性的放大作用，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中銅離子的量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出銅離子濃度范圍。本發(fā)明檢測銅離子的試劑盒主要采用間接競爭酶聯(lián)免疫測定法定性或定量樣品中銅離子含量；該試劑盒采用高特異性的銅離子單克隆抗體，可以靈敏、快速、準(zhǔn)確，主要用于大批樣品的篩查；試劑盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確性、高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，可快速檢測水及畜產(chǎn)品中殘留的銅離子，為使用者節(jié)省時(shí)間并降低因操作步驟冗繁造成的誤差。本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高精確度、高準(zhǔn)確度、對儀器要求低、試劑保存時(shí)間長、無放射性同位素污染，能同時(shí)快速檢測大批樣品等優(yōu)點(diǎn)，可在水、飼料及動物源性產(chǎn)品檢測中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒本發(fā)明的試劑盒在使用時(shí)具有快速、廉價(jià)、簡便、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)，可便攜而進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)測，克服了傳統(tǒng)檢測方法的缺點(diǎn)。通過制備針對Cu2+特異性的單克隆抗體，建立重金屬銅免疫學(xué)檢測方法。該方法的完成將解決Cu2+螯合、偶聯(lián)、單克隆抗體的制備等關(guān)鍵技術(shù)，為建立Cu2+免疫學(xué)檢測技術(shù)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的試劑盒不僅為食品安全檢測，而且為我國農(nóng)產(chǎn)品等的出入境檢測、環(huán)境監(jiān)測部門的水域監(jiān)測提供有效的技術(shù)手段和檢測方法。對我國農(nóng)產(chǎn)品的可持續(xù)健康發(fā)展、解決食品安全問題具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和重要的社會、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖I為銅離子抑制曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I本實(shí)施例的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒包括銅離子特異性抗體，銅離子-載體蛋白偶聯(lián)物和酶標(biāo)ニ抗，還設(shè)置有包被了銅離子抗原或抗銅離子特異性抗體的酶標(biāo)板，銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，底物顯色劑，洗滌液，終止液和濃縮樣品稀釋液。本實(shí)施例的試劑盒各原料的制備方法如下I、完全抗原制備及鑒定取O. 5 IOmg水溶性銅鹽溶于50 μ L超純水，配制2. O 80mg/mL的Cu2+溶液；取O. 8 20mg雙功能螯合劑p-SCN-Bn-DOTA溶于50 μ L ニ甲基亞砜，配制16 400mg/mL的p-SCN-Bn-DOTA溶液；取2. O 20. Omg載體蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)及牛血清白蛋白(BSA)溶于ImL HEPES緩沖溶液或碳酸鹽緩沖液，配制2 20mg/mL的載體蛋白溶液；將配制的50 μ L 2. O 80mg/mL的Cu2+溶液逐滴加入到50 μ L p-SCN-Bn-DOTA溶液中，于15 55°C>pH4. 5 6. 5、振蕩條件下反應(yīng)15min 3h形成半抗原溶液；再將此半抗原溶液逐滴加入到ImL 2 20mg/mL的載體蛋白溶液中，于4°C或室溫、pH7. 5 10. 5條件下振蕩反應(yīng)24h ;用超濾或透析的方法去除未反應(yīng)的低分子物質(zhì)，得Cu2+的完全抗原。以完全抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-KLH為免疫抗原；以完全抗原Cu2+-p-SCN-Bn-DOTA_BSA為包被抗原。對制備的完全抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測、紫外分光光度法檢測及Cu2+含量檢測以鑒定抗原是否制備成功。2、小鼠免疫將步驟(I)制備的免疫抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-KLH免疫6 8周齡BALB/c小鼠。在第l、14、21、35d給小鼠腹腔注射，每次免疫抗原用量為SOyg/只。初次免疫用等量弗氏完全佐劑混合乳化，自第2次免疫起改用等量弗氏不完全佐劑混合乳化。自第3次免疫起，每次免疫后IOd從小鼠尾靜脈采血，以間接ELISA法測小鼠血清抗體效價(jià)。3、細(xì)胞融合選擇血清效價(jià)高并且差異率高的小鼠，于細(xì)胞融合前3d進(jìn)行沖擊免疫，免疫抗原用量為IOOyg/只。將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以3 10 I混合，Imin內(nèi)加入O. 7 1.2mL 50%聚こニ醇融合，靜置90s，然后在5min內(nèi)加入25mL無血清RPMI 1640培養(yǎng)液，終止融合反應(yīng)，800 1200rpm/min離心lOmin，以含2% HAT的完全RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，將細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在融合后7d內(nèi)用HAT培養(yǎng)液，第7 14d改用HT培養(yǎng)液，第14d后用完全RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。4、雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆間接ELISA法檢測。以雜交瘤細(xì)胞上清/骨髓瘤細(xì)胞上清血清> 2. 1，并且OD值> O. 2判斷為陽性。選擇陽性值高并且差異率高的細(xì)胞株，以有限稀釋法進(jìn)行克隆。5、單克隆抗體的鑒定通過間接ELISA初篩的陽性克隆上清進(jìn)ー步用間接競爭ELISA法確定所分泌的 抗體是否針對Cu2+，而不與螯合劑反應(yīng)。具體步驟如下抗原Cu2+-P-SCN-Bn-DOTA-BSA包被ELISA板，4°C放置過夜；用含O. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；用20%兔血清作為封閉液，100 μ L/孔，37°C作用I. 5h ;用系列濃度的p-SCN-Bn-DOTA溶液(l、2、5、10、20、50、100mM)與初篩呈陽性的雜交瘤上清等體積混勻，100 μ L/孔，37°C作用Ih ;用含O. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；加入用含O. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST) 5000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的羊抗鼠ニ抗，100 μ L/孔，37°C作用Ih ;用含O. 5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌，3minX3次；鄰苯ニ胺(OPD)顯色，100 μ L/孔，37°C避光反應(yīng)IOmin;加入5(^し/孔的211 H2SO4終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀上490nm讀數(shù)。以雜交瘤細(xì)胞上清/骨髄瘤細(xì)胞上清血清> 2. 1，并且OD值> 0. 2判斷為陽性。結(jié)果在螯合劑p-SCN-Bn-DOTA濃度最高達(dá)5mM時(shí)抗體與螯合劑不發(fā)生反應(yīng)。6、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成IX IO6個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。7、單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 4ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5 X IO5個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸按法進(jìn)行純化，純化后的腹水放入_20°C環(huán)境保存。實(shí)施例2檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備方法，使其包含下述組分(I)包被銅離子偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板；(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；(3)銅離子單抗體濃縮液；(4)銅離子標(biāo)準(zhǔn)品溶液 6 瓶，濃度分別為 0. 25mmol/L、0. 125mmol/L、0. 0625mmol/L、0. 03125mmol/L、0. 015625mmol/L、0. 0078125mmol/L。(5)底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；(6)終止液為2mol/L鹽酸或硫酸；
(7)洗滌液為O. 01M, pH為7. 4，含有O. 05% -O. 5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液；(8)濃縮樣品液為O. I %吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。實(shí)施例3樣品中銅離子殘留的檢測樣品前處理準(zhǔn)確量取5ml牛奶于IOOml燒杯中。加入20mlHCl,浄置lh,4000rpm離心15min,取上清，加入螯合劑，靜置O. 5h，4000rpm離心15min，取上清。用試劑盒進(jìn)行檢測

向銅離子-螯合劑-BSA偶聯(lián)物包被的酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液50 μ 1，再加入抗體工作液50 μ 1，室溫反應(yīng)lh。倒出孔中液體，每孔加入300 μ I洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板3次，用吸水紙拍干。每孔加入酶標(biāo)記抗抗體100μ 1，暗室溫孵育30min。底物顯色液A液(過氧化脲)50 μ 1，再加B液(四甲基聯(lián)苯胺)50 μ 1，輕輕振蕩混勻，室溫避光顯色10-15min，每孔加入終止液(2mol/L鹽酸)50 μ 1，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測定每孔吸光度值(0D值)。3. 3結(jié)果分析計(jì)算百分吸光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相對應(yīng)每一個(gè)樣品中銅離子的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，也可以用回歸方程法計(jì)算出在樣本中銅離子的含量。利用專業(yè)電腦軟件更便于大量的樣本的快速分析。根據(jù)酶標(biāo)板上的樣本顏色的深淺與系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液顔色的比較，可以判斷出樣本中銅離子的濃度范圍。實(shí)驗(yàn)例4試劑盒精密度試驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)例為標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)。具體操作為從每批實(shí)施例2或3中的方法制備的酶標(biāo)板中，各抽取10個(gè)孔，測定
O.03125mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD)，重復(fù)3次，計(jì)算變異系數(shù)CV%。結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在8. 8-15. 6%之間，符合了變異系數(shù)小于20/%的規(guī)定，說明本試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品精密度達(dá)到了要求。實(shí)驗(yàn)例5試劑盒的回收率試驗(yàn)取兩個(gè)濃度的銅離子標(biāo)樣，對樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算回收率。結(jié)果表明牛奶中的添加回收率為89.9-102.6%。實(shí)驗(yàn)例6試劑盒穩(wěn)定性試驗(yàn)試劑盒保存條件為2_8°C，經(jīng)過6個(gè)月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零添加)、50%抑制濃度、銅離子添加實(shí)際測定值均在正常范圍之內(nèi)。將試劑盒在37°C保存條件下放置兩周，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求。將試劑盒放入-20°C冰箱冷凍5d，測定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8°C保存12個(gè)月以上。
權(quán)利要求
1.一種檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在干包括銅離子特異性抗體，銅離子-載體蛋白偶聯(lián)物和酶標(biāo)ニ抗，還設(shè)置有包被了銅離子抗原或抗銅離子特異性抗體的酶標(biāo)板，銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，底物顯色劑，洗滌液，終止液和濃縮樣品稀釋液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的銅離子特異性抗體為單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的載體蛋白為牛血清白蛋白，卵清蛋白或鑰孔血蘭蛋白(KLH)，鼠血清蛋白，甲狀腺蛋白，兔血清蛋白或人血清白蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)ニ抗中的酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)ニ抗為羊抗鼠IgG抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的洗滌液為含有O. 05% -O. 5%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為過氧化氫或過氧化服，顯色劑B為鄰苯ニ胺或四甲基聯(lián)苯胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的終止液為氫氧化鈉溶液或硫酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的濃縮樣品稀釋液為含O. 1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
10.ー種采用權(quán)利要求I所述試驗(yàn)盒在檢測樣品中銅離子含量方面的應(yīng)用，其特征在于具體包括以下步驟 (1)樣品前處理； (2)用試劑盒進(jìn)行檢測，向包被有銅離子抗原的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，再加入抗銅離子單克隆抗體，孵育后洗滌拍干，加入酶標(biāo)記ニ抗，孵育后洗滌拍干，顯色、終上，用酶標(biāo)儀測定吸光度值； (3)分析檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用，其中試劑盒包括銅離子特異性抗體，銅離子-載體蛋白偶聯(lián)物和酶標(biāo)二抗，還設(shè)置有包被了銅離子抗原或抗銅離子特異性抗體的酶標(biāo)板，銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，底物顯色劑，洗滌液，終止液和濃縮樣品稀釋液。本發(fā)明的檢測銅離子的酶聯(lián)免疫試劑盒靈敏、快速、準(zhǔn)確，主要用于大批樣品的篩查；試劑盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確性、高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，可快速檢測水及畜產(chǎn)品中殘留的銅離子。
文檔編號G01N33/531GK102680691SQ20121001152
公開日2012年9月19日 申請日期2012年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月15日
發(fā)明者周變?nèi)A, 孔濤, 常景周, 張才, 李嘉嘉, 李潤樂, 楊自軍, 王振華, 趙振升, 郝雪琴, 魏迎軍 申請人:河南科技大學(xué)