專利名稱：利用免疫色譜法的測定法、免疫色譜測試條和用于免疫色譜法的測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過免疫色譜法測量樣品中分析物的測量方法，用于通過免疫色譜法測量樣品中分析物的免疫色譜測試條，和用于免疫色譜法的測量試劑盒，其包括免疫色譜測試條和稀釋溶液。本發(fā)明特別涉及通過使用免疫色譜法測量血紅蛋白濃度和源自血液的同一樣品中的第二分析物的濃度并使用獲自血紅蛋白測量值的血細(xì)胞比容校正所述第二分析物的測量值的技術(shù)。
背景技術(shù)：
在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域等中，必須測量血液中的某些成分(諸如血清清蛋白、免疫球蛋白、肝炎病毒、類風(fēng)濕因子和C反應(yīng)蛋白)，且為了該目的已經(jīng)開發(fā)和實(shí)施了多種測量方法。在這些方法中的常用方法中，免疫學(xué)測定成為主流且，在免疫學(xué)測定中，對(duì)由患者或受試者收集和獲得的血液(下文中稱為全血)進(jìn)行離心，以獲得上清(血清或血漿)，所述上清使用合適的緩沖溶液稀釋，并且使用與分析物特異性反應(yīng)的抗體來檢測血清或血漿中的分析物。這樣的測定包括作為定性測試的，使用多克隆抗體的，基于單一射線的免疫擴(kuò)散方法。膠乳凝集免疫測定和免疫濁度法作為代表性的定量測試包括在其中?！霸跈z查患者的過程中希望進(jìn)行多種測試”的需要近期甚至在門診部和小醫(yī)院中越來越多，且測試日益作為即時(shí)檢驗(yàn)(POCT),而非常規(guī)轉(zhuǎn)包(subcontract)檢驗(yàn)來進(jìn)行。這樣的POCT試劑的代表性實(shí)例包括免疫色譜法的側(cè)向流動(dòng)測試條。由于由血液中分離血漿和血清的操作很麻煩且需要POCT領(lǐng)域的技巧，使用全血的檢驗(yàn)是理想的。通過使用免疫色譜法測量全血液樣品中分析物的測定公開為，例如，使用裝配有血細(xì)胞分離膜的測試條的方法以及試劑和試劑盒(專利文獻(xiàn)I)。然而，當(dāng)通過該程序分離的血漿直接用于通過基于夾心式免疫反應(yīng)原則的免疫色譜法的測量時(shí)，如果分析物過量存在，則有問題，即“鉤狀現(xiàn)象”(也稱為“前帶現(xiàn)象”)發(fā)生并導(dǎo)致數(shù)值的明顯減小，盡管樣品中存在高度濃縮的分析物。因此，全血通常是溶解的和稀釋的，以用于測量，由此保持在預(yù)定的測量范圍內(nèi)。然而，在這種情況下，分析物的濃度通過血細(xì)胞體積稀釋并且測量值與血清或血漿樣品相比降低，因此，測量值必須通過使用血細(xì)胞比容值(紅細(xì)胞的體積百分比)來校正。利用血細(xì)胞比容值(紅細(xì)胞的體積百分比)校正測量值在下文中也將簡稱為血細(xì)胞比容校正。數(shù)值明顯減小的問題通常通過統(tǒng)一乘以獲自健康個(gè)體的平均血細(xì)胞比容值的校正系數(shù)來進(jìn)行校正。然而，血細(xì)胞比容值在個(gè)體之間變化并且其參考值范圍在男性中為39-52%，在女性中為35-48%。因此，精確的分析物濃度不能通過利用乘以統(tǒng)一的系數(shù)的校正來獲得。因此，為了進(jìn)行精確血細(xì)胞比容校正，必須使用通過利用用于測量分析物濃度的同一樣品分別測量的血細(xì)胞比容值進(jìn)行校正。血細(xì)胞比容值常規(guī)通過基于離心法的微量血細(xì)胞比容法或通過利用自動(dòng)化血細(xì)胞計(jì)數(shù)器通過由紅細(xì)胞數(shù)量和平均紅細(xì)胞體積進(jìn)行計(jì)算來獲得。另一方面，報(bào)告了另一種利用由全血測量結(jié)果轉(zhuǎn)化為在測量血清或血漿情況下的測量值的方法作為轉(zhuǎn)化血液測量結(jié)果的方法，在該方法中，測量全血的血紅蛋白濃度(g/L);采用通過使獲得的血紅蛋白濃度乘以約3/10獲得的數(shù)值作為血細(xì)胞比容值(％);并使用血細(xì)胞比容值將來自全血的測量結(jié)果轉(zhuǎn)化為測量血清或血漿情況下的測量值(專利文獻(xiàn)2)。然而，由于血紅蛋白濃度和血細(xì)胞比容值必須通過與免疫色譜法測定不同的方法來獲得，所以該方法很麻煩，需要時(shí)間和成本，并因此不能滿足POCT領(lǐng)域中測試的需求。因此，需要基于免疫色譜法的同時(shí)測量分析物和血紅蛋白的方法；然而，由于全血中的血紅蛋白濃度正常為數(shù)十g/L至200g/L，這是非常高的濃度，需要進(jìn)行10，000-至100，000-倍稀釋，以用于基于正常夾心式免疫測定原理的測定。在該方法中，需要大量稀釋溶液來進(jìn)行一步式稀釋，這導(dǎo)致測量精確性的破壞。利用多步式稀釋的方法存在缺乏用于POCT領(lǐng)域中測試方法的實(shí)用性的問題。為了解決這些問題，需要能夠測量的免疫色譜法測定，其中具有至多50-400倍的全血的溶血稀釋操作。引用列表專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:公開的PCT申請(qǐng)WO 2010/001598專利文獻(xiàn)2 :日本特開專利公開號(hào)2001-272403發(fā)明概述技術(shù)問題例如，C反應(yīng)蛋白(以下也稱為"CRP")的血液濃度在健康個(gè)體中等于或小于3mg/L，在手術(shù)后或在急性細(xì)菌感染的情形中至多約35mg/L，且在嚴(yán)重受傷個(gè)體中多至約1000mg/L。另一方面，血紅蛋白的血液濃度正常為數(shù)十g/L至200g/L，這與CRP在濃度上相差約50-67000倍，并且對(duì)于進(jìn)行免疫測定的分析物是非常高的濃度。因此，當(dāng)企圖在基于夾心式免疫色譜法原理的測定中測量CRP和血紅蛋白二者時(shí)，樣品的稀釋比率必須根據(jù)分析物而進(jìn)行相當(dāng)大的改變并且，因此，樣品(處于相同稀釋比率的樣品)中的測量非常困難。規(guī)定免疫測定測量范圍的最重要因素包括抗原和抗體之間的親合力(avidity)和影響其結(jié)合反應(yīng)多種環(huán)境因子。這些環(huán)境因子包括溫度、時(shí)間、pH、離子環(huán)境、和產(chǎn)生某些效果的試劑諸如表面活性劑和反應(yīng)促進(jìn)劑的添加。在同一樣品中同時(shí)測量CRP和血紅蛋白的濃度可以原則上通過以下過程來實(shí)現(xiàn)選擇具有不同親合力的抗體和獲得合適環(huán)境因子從而彌補(bǔ)顯著的濃度差距。然而，制備這樣的抗體組合和獲得所述合適的環(huán)境因子并不容易。實(shí)際上，當(dāng)本發(fā)明人最初考慮通過夾心式免疫色譜法同時(shí)測量CRP和血紅蛋白時(shí)，50-至200-倍稀釋足以測量CRP，而需要2000-至100，000-倍稀釋來測量血紅蛋白。因此，不能通過利用同一稀釋樣品測量CRP和血紅蛋白。本發(fā)明的目的是提供利用同一稀釋樣品，通過免疫色譜法測量同一樣品中分析物和血紅蛋白濃度的方法和通過利用血紅蛋白的測量值進(jìn)行分析物測量值血細(xì)胞比容校正的方法，以及提供用于在這些方法中使用的免疫色譜測試條和試劑盒。解決問題的方案本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血紅蛋白的數(shù)量可以通過利用這樣的現(xiàn)象通過免疫色譜測試條確定，所述現(xiàn)象是其中甚至在通過以約100倍稀釋和溶血獲得的樣品中，即甚至在樣品中血紅蛋白濃度等于或大于獲得血紅蛋白測量最大信號(hào)值時(shí)的濃度的范圍內(nèi)(下文中也稱為前帶現(xiàn)象區(qū))，在免疫色譜測試條的不溶性膜支持物上固定的一排抗血紅蛋白抗體捕獲的膠體金標(biāo)記物中，反射光強(qiáng)度隨著血紅蛋白濃度的增加而減?。徊⑶野l(fā)現(xiàn)CRP可以在稀釋樣品中測量，由此導(dǎo)致本發(fā)明的完成。"免疫色譜測試條(用于免疫色譜法的測試條)"指至少包括免疫色譜法所需的不溶性膜支持物和在需要時(shí)，還包括試劑成分、另外的膜等的那些測試條。本發(fā)明包括以下內(nèi)容。(I)通過免疫色譜法測量至少包含第一分析物的樣品的方法，其包括以下步驟A，其中樣品中第一分析物的濃度在等于或大于獲得所述第一分析物的最大信號(hào)值時(shí)的濃度的范圍(前帶現(xiàn)象區(qū))內(nèi)測量，A.利用下述I)和2)，通過競爭性免疫色譜法測量樣品中第一分析物的步驟I)綴合物，其中針對(duì)所述第一分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物；和2)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第一分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第一分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可以與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可以與所述第二抗體相同)。(2)根據(jù)⑴的方法，其中步驟A還使用下述3)和4)并且其中I)的綴合物包含在墊中，以形成綴合物墊并置于2)的不溶性膜支持物的上游側(cè)，3)樣品墊，其位于綴合物墊的上游側(cè)并供給以樣品，和4)吸收墊，其位于2)的不溶性膜支持物的下游側(cè)。(3)根據(jù)⑴或⑵的方法，其中所述第一分析物是血紅蛋白，且其中所述樣品通過對(duì)血液進(jìn)行稀釋和溶血以達(dá)到等于或大于獲得血紅蛋白測量的最大信號(hào)值時(shí)的濃度范圍的濃度范圍(前帶現(xiàn)象區(qū))內(nèi)來獲得。(4)通過免疫色譜法測量至少包含血紅蛋白，即所述第一分析物和第二分析物的樣品的方法，其包括以下步驟A至D :A.利用下述I)和2)，通過競爭性免疫色譜法測量樣品中第一分析物的步驟I)綴合物，其中針對(duì)所述第一分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物；和2)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第一分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第一分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可以與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可以與所述第二抗體相同)；B.利用下述5)和6)，通過免疫色譜法測量樣品中第二分析物的步驟5)綴合物，其中針對(duì)所述第二分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物；和6)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第二分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第二分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可以與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可以與所述第二抗體相同)；C.從步驟A獲得的第一分析物的測量值獲得樣品的血細(xì)胞比容值的步驟；和D.通過利用步驟C獲得的血細(xì)胞比容值校正步驟B獲得的第二分析物的測量值的步驟。(5)根據(jù)(4)的方法，其中步驟A和B是使用相同不溶性膜支持物的步驟。(6)根據(jù)(5)的方法，其中步驟A和B在相同流動(dòng)通道中進(jìn)行。(7)根據(jù)(4)至(6)中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二分析物是CRP。(8)用于通過免疫色譜法測量至少包含第一分析物和第二分析物的樣品的免疫色譜測試條，所述免疫色譜測試條包括以下E和F :E.用于測量所述第一分析物的測試條，其包括下述I)和2)，I)綴合物，其中針對(duì)所述第一分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物；和2)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第一分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第一分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可以與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可以與所述第二抗體相同)；和F.用于測量第二分析物的測試條，其包括下述5)和6)，5)綴合物，其中針對(duì)所述第二分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物；和6)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第二分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第二分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可以與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可以與所述第二抗體相同)。(9)根據(jù)⑶的免疫色譜測試條，其中E中I)和F中5)的綴合物包含在相同墊中，以形成綴合物墊，并且其中E中2)的不溶性膜支持物與F中5)不溶性膜支持物相同。(10)根據(jù)(9)的免疫色譜測試條，其中E和F置于相同流動(dòng)通道內(nèi)。(11)根據(jù)⑶至(10)中任一項(xiàng)的免疫色譜測試條，還包括以下G和H，其中E中I)和F中5)的綴合物包含在墊中以形成綴合物墊并置于E中2)和F中6)的不溶性膜支持物的上游側(cè)，G.樣品墊，其位于綴合物墊的上游側(cè)并供給以樣品，和H.吸收墊，其位于E中2)和F中6)的不溶性膜支持物的下游側(cè)。(12)根據(jù)(8)至(11)中任一項(xiàng)的免疫色譜測試條，其中所述第一分析物是血紅蛋白。(13)根據(jù)(12)的免疫色譜測試條，其中所述第二分析物是CRP。(14)用于免疫色譜法的測定試劑盒，其包括根據(jù)(12)或(13)的免疫色譜測試條；和用于血紅蛋白溶血和稀釋的稀釋溶液。(15)通過免疫色譜法測量至少包含第一分析物和第二分析物的樣品的方法，其包括以下步驟A和B:A.利用下述I)和2)，通過競爭性免疫色譜法測量樣品中第一分析物的步驟I)綴合物，其中針對(duì)所述第一分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物；和2)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第一分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第一分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可以與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可以與所述第二抗體相同)；和
B.利用下述5)和6)，通過免疫色譜法測量樣品中第二分析物的步驟，5)綴合物，其中針對(duì)所述第二分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物；和6)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第二分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第二分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可以與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可以與所述第二抗體相同)。(16)根據(jù)(15)的方法，其中所述第二分析物是CRP。對(duì)于能夠在常規(guī)認(rèn)為不適合于量化的前帶現(xiàn)象區(qū)內(nèi)進(jìn)行測量的原因，本發(fā)明人推測如下。血紅蛋白濃度在以約100倍稀釋和溶血的血液樣品中太高，由此導(dǎo)致不能與抗血紅蛋白抗體固定的膠體金(綴合物)結(jié)合的游離血紅蛋白。因此，發(fā)生上述現(xiàn)象，其歸因于當(dāng)游離血紅蛋白與不溶性膜支持物上固定的抗血紅蛋白抗體結(jié)合時(shí)，它與抗血紅蛋白抗體固定的膠體金和血紅蛋白的復(fù)合物相競爭。發(fā)明有利效果根據(jù)本發(fā)明，即使在包含高度濃縮的分析物的樣品中，分析物的濃度可以在等于或大于在該分析物測量系統(tǒng)中獲得最大信號(hào)值的濃度的濃度范圍(前帶現(xiàn)象區(qū))內(nèi)來測量，由此相當(dāng)大地減少稀釋樣品所需的努力和成本。應(yīng)用本發(fā)明測量血紅蛋白容許規(guī)定免疫色譜測試條和用于免疫色譜法的測定試劑盒能夠通過同一免疫色譜法測量同一樣品中分析物和血紅蛋白的濃度和由血紅蛋白的測量值進(jìn)行分析物測量值的血細(xì)胞比容校正并且，因此，與常規(guī)方式相比，分析物的精確血液濃度測量可以以簡單操作短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，由此滿足POCT領(lǐng)域中的社會(huì)需要。附圖簡述

圖1顯示免疫色譜測試條的示意性結(jié)構(gòu)。圖2顯示實(shí)施例1的血紅蛋白測量的結(jié)果。圖3顯示實(shí)施例1的CRP測量中的校準(zhǔn)曲線。圖4是實(shí)施例1的來自血紅蛋白測量線的反射光強(qiáng)度和血細(xì)胞比容值之間關(guān)系的圖表。圖5是實(shí)施例1中在無血細(xì)胞比容校正條件下利用本發(fā)明的免疫色譜測試條獲得的CRP濃度與利用商購CRP測量試劑盒(由SekisuiMedical Co.，Ltd.(積水醫(yī)療株式會(huì)社)制造的"Nanopia CRP")獲得的CRP濃度之間相關(guān)性的圖表。圖6是實(shí)施例1中使用血細(xì)胞比容校正獲得的CRP濃度與利用商購CRP測量試劑盒(由Sekisui Medical Co. ,Ltd.(積水醫(yī)療株式會(huì)社)制造的"Nanopia CRP")獲得的CRP濃度之間相關(guān)性的圖表。圖7是當(dāng)通過實(shí)施例1的免疫色譜測試條獲得的CRP濃度使用平均血細(xì)胞比容值44%統(tǒng)一校正時(shí)的CRP濃度與利用商購CRP測量試劑盒(由Sekisui Medical Co.，Ltd.(積水醫(yī)療株式會(huì)社)制造的"Nanopia CRP")獲得的CRP濃度之間相關(guān)性的圖表。圖8是實(shí)施例2的來自血紅蛋白測量線的反射光強(qiáng)度和血細(xì)胞比容值之間關(guān)系的圖表。圖9顯示實(shí)施例2的CRP測量中的校準(zhǔn)曲線。圖10是當(dāng)實(shí)施例2中不進(jìn)行HCT校正時(shí)，商購CRP測量試劑盒(Nanopia CRP)和本發(fā)明方法之間相關(guān)性的圖表。圖11是當(dāng)實(shí)施例2中進(jìn)行HCT校正時(shí)，商購CRP測量試劑盒(Nanopia CRP)和本發(fā)明方法之間相關(guān)性的圖表。圖12是膜的毛細(xì)流動(dòng)時(shí)間對(duì)Hb測量影響圖表。實(shí)施方案描述將通過以當(dāng)?shù)诙治鑫锸荂RP的測量法作為實(shí)例，詳細(xì)描述作為本發(fā)明實(shí)施方案之一的具有血細(xì)胞比容校正的測量法。在該情形中，第一分析物是血紅蛋白且第二分析物是 CRP。當(dāng)使用本發(fā)明的測量法測量CRP時(shí)，血液在同時(shí)溶血和稀釋至所需濃度后用作樣品，以使得CRP和血紅蛋白可以通過基于免疫色譜法原理的免疫測定同時(shí)測量。本發(fā)明測量法中樣品中的血紅蛋白濃度必須在等于或大于獲得血紅蛋白測量的最大信號(hào)值時(shí)濃度的濃度范圍(前帶現(xiàn)象區(qū))內(nèi)。換言之，樣品中的血紅蛋白濃度必須被設(shè)定為在等于或大于獲得血紅蛋白測量的最大信號(hào)值時(shí)濃度的濃度范圍(前帶現(xiàn)象區(qū))內(nèi)。特別地，適合時(shí)通過改變稀釋倍數(shù)，將樣品稀釋至等于或大于獲得血紅蛋白測量的最大信號(hào)值時(shí)濃度的范圍內(nèi)。因此，樣品中的血紅蛋白濃度被設(shè)定為等于或大于獲得血紅蛋白測量的最大信號(hào)值時(shí)的濃度，且血紅蛋白濃度可以由與血紅蛋白濃度成反比的檢測強(qiáng)度減小程度而獲得。可以進(jìn)行初步測試，以預(yù)先獲得這樣的濃度，即獲得血紅蛋白測量的最大信號(hào)值時(shí)的濃度。備選地，這樣的濃度可以通過由樣品類型(患者特征)和過去的測試結(jié)果預(yù)測的血紅蛋白濃度來預(yù)先預(yù)測。特別地，以50至200倍稀釋和溶血的血液樣品可以用于通過免疫色譜法同時(shí)測量同一樣品中的CRP和血紅蛋白。理想地，優(yōu)選設(shè)定稀釋比率為100倍，因?yàn)镃RP測量范圍應(yīng)該設(shè)定為O. 2-20mg/mL。使用本發(fā)明測量法的CRP測量包括以下步驟將稀釋和溶血血液樣品滴在免疫色譜測試條的樣品墊上，在具有抗血紅蛋白抗體，即固定于不溶性膜支持物的針對(duì)血紅蛋白的抗體(針對(duì)血紅蛋白的第二抗體)的測量部分(下文中也稱為"血紅蛋白測量線")上測量血紅蛋白濃度，和由血紅蛋白的測量值獲得血液樣品的血細(xì)胞比容值。特別地，血紅蛋白濃度通過使用其中針對(duì)血紅蛋白的第一抗體固定于標(biāo)記物的綴合物和其上固定有針對(duì)血紅蛋白的第二抗體的不溶性膜支持物(如果針對(duì)血紅蛋白的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可以與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可以與所述第二抗體相同)來測量。血紅蛋白濃度可以作為測量值，由來自具有固定的針對(duì)血紅蛋白的第二抗體的不溶性膜支持物上的血紅蛋白測量線的信號(hào)差直接獲得或可以是由該信號(hào)差計(jì)算的血紅蛋白濃度。根據(jù)本發(fā)明的測量法，由于樣品中的血紅蛋白濃度在等于或大于獲得血紅蛋白測量的最大信號(hào)值時(shí)濃度的濃度范圍(前帶現(xiàn)象區(qū))內(nèi)測量，血紅蛋白濃度由與血紅蛋白濃度成反比的吸光度或反射光強(qiáng)度的減小程度來獲得。血細(xì)胞比容值可以由測量的信號(hào)或血紅蛋白濃度值差異和由權(quán)威方法諸如離心法提供的血細(xì)胞比容值之間的相關(guān)性表述來計(jì)算。盡管免疫色譜測試條可以是僅用于測量血紅蛋白的測試條，但是如果該測試條是制備的容許同時(shí)測量CRP和血紅蛋白的單免疫色譜測試條則更理想。理想的形式是本發(fā)明以上(9)或(10)中所述的免疫色譜測試條。
使用本發(fā)明的測量法的CRP的測量包括以下步驟將稀釋和溶血血液樣品滴在免疫色譜測試條的樣品墊上，和在具有抗CRP抗體，即固定于不溶性膜支持物的針對(duì)CRP的抗體(針對(duì)CRP的第二抗體)的測量部分(下文中也稱為"CRP測量線")上測量CRP濃度。特別地，CRP濃度通過使用其中針對(duì)CRP的第一抗體固定于標(biāo)記物的綴合物和其上固定有針對(duì)CRP的第二抗體的不溶性膜支持物(如果針對(duì)CRP的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可以與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可以與所述第二抗體相同)來測量。CRP濃度可以作為測量值，由來自具有固定的針對(duì)CRP的第二抗體的不溶性膜支持物上的CRP測量線的信號(hào)差直接獲得，或可以是由該信號(hào)差計(jì)算的CRP濃度。將樣品滴在免疫色譜測試條的樣品墊上可以使用能夠滴落一定量的樣品如臨床檢查領(lǐng)域中常用的那些樣品的任何程序來進(jìn)行，并可以使用能夠滴落一定量小滴的測量吸管或滴管進(jìn)行。滴落可以手工進(jìn)行或可以使用自動(dòng)操作裝置。測量源自標(biāo)記物的信號(hào)的方法可以根據(jù)已知技術(shù)執(zhí)行并且，例如，如果標(biāo)記物是膠體金，則可以測量吸光度和反射光強(qiáng)度。CRP和血紅蛋白的濃度可以通過將吸光度或反射光強(qiáng)度的差異外推至具有已知濃度的樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線中來同時(shí)計(jì)算。使用本發(fā)明的測量法的CRP的測量包括以下步驟使用由在測試條的血紅蛋白測量線中測量的血紅蛋白值計(jì)算的血細(xì)胞比容值來校正在CRP測量線中測量的CRP濃度。在通過血細(xì)胞比容校正計(jì)算CRP的方法中，計(jì)算如通過通常使用下述另一種方法獲得的血細(xì)胞比容值進(jìn)行校正的情形來進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.通過免疫色譜法測量至少包含第一分析物的樣品的方法，其包括以下步驟A，其中 樣品中第一分析物的濃度在等于或大于獲得所述第一分析物最大信號(hào)值時(shí)的濃度的濃度范圍(前帶現(xiàn)象區(qū))內(nèi)測量， A.利用下述I)和2)，通過競爭性免疫色譜法測量樣品中第一分析物的步驟 1)綴合物，其中針對(duì)所述第一分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物；和 2)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第一分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第一分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可與所述第二抗體相同)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟A還使用下述3)和4)并且其中I)的綴合物包含在墊中，以形成綴合物墊并置于2)的不溶性膜支持物的上游側(cè)， 3)樣品墊，其位于綴合物墊的上游側(cè)并供給以樣品，和 4)吸收墊，其位于2)的不溶性膜支持物的下游側(cè)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述第一分析物是血紅蛋白，且其中所述樣品通過對(duì)血液進(jìn)行稀釋和溶血以達(dá)到等于或大于獲得血紅蛋白測量最大信號(hào)值時(shí)的濃度的濃度范圍(前帶現(xiàn)象區(qū))來獲得。
4.通過免疫色譜法測量至少包含作為第一分析物的血紅蛋白和第二分析物的樣品的方法，其包括以下步驟A至D : A.利用下述I)和2)，通過競爭性免疫色譜法測量樣品中第一分析物的步驟 1)綴合物，其中針對(duì)所述第一分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物，和 2)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第一分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第一分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可與所述第二抗體相同)； B.利用下述5)和6)，通過免疫色譜法測量樣品中第二分析物的步驟 5)綴合物，其中針對(duì)所述第二分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物，和 6)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第二分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第二分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可與所述第二抗體相同)； C.從步驟A獲得的第一分析物的測量值獲得樣品的血細(xì)胞比容值的步驟；和 D.通過利用步驟C獲得的血細(xì)胞比容值校正步驟B獲得的第二分析物的測量值的步驟。
5.權(quán)利要求4的方法，其中步驟A和B是使用相同不溶性膜支持物的步驟。
6.權(quán)利要求5的方法，其中步驟A和B在相同流動(dòng)通道中進(jìn)行。
7.權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二分析物是C反應(yīng)蛋白(CRP)。
8.用于通過免疫色譜法測量至少包含第一分析物和第二分析物的樣品的免疫色譜測試條，所述免疫色譜測試條包括以下E和F : E.用于測量所述第一分析物的測試條，其包括下述I)和2)，1)綴合物，其中針對(duì)所述第一分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物；和 2)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第一分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第一分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可與所述第二抗體相同)；和 F.用于測量第二分析物的測試條，其包括下述5)和6)， 5)綴合物，其中針對(duì)所述第二分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物；和 6)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第二分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第二分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可與所述第二抗體相同)。
9.權(quán)利要求8的免疫色譜測試條，其中E中I)和F中5)的綴合物包含在相同墊中，以形成綴合物墊，并且其中E中2)的不溶性膜支持物與F中6)的不溶性膜支持物相同。
10.權(quán)利要求9的免疫色譜測試條，其中E和F置于相同流動(dòng)通道內(nèi)。
11.權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)的免疫色譜測試條，還包括以下G和H，其中E中I)和F中5)的綴合物包含在墊中以形成綴合物墊并且置于E中2)和F中6)的不溶性膜支持物的上游側(cè)， G.樣品墊，其位于綴合物墊的上游側(cè)并供給以樣品，和 H.吸收墊，其位于E中2)和F中6)的不溶性膜支持物的下游側(cè)。
12.權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)的免疫色譜測試條，其中所述第一分析物是血紅蛋白。
13.權(quán)利要求12的免疫色譜測試條，其中所述第二分析物是C反應(yīng)蛋白(CRP)。
14.用于免疫色譜法的測定試劑盒，其包括權(quán)利要求12或13的免疫色譜測試條；和用于溶血和稀釋的稀釋溶液。
15.通過免疫色譜法測量至少包含第一分析物和第二分析物的樣品的方法，其包括以下步驟A和B : A.利用下述I)和2)，通過競爭性免疫色譜法測量樣品中第一分析物的步驟 1)綴合物，其中針對(duì)所述第一分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物；和 2)不溶性膜支持物，針對(duì)所述第一分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第一分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可與所述第二抗體相同)；和 B.利用下述5)和6)，通過免疫色譜法測量樣品中第二分析物的步驟， 5)綴合物，其中針對(duì)所述第二分析物的第一抗體固定于標(biāo)記物；和 6)與A中2)相同的不溶性膜支持物，針對(duì)所述第二分析物的第二抗體固定于所述不溶性膜支持物(如果針對(duì)所述第二分析物的第一抗體的表位是單價(jià)的，則所述第二抗體的表位與第一抗體不同，而如果所述第一抗體的表位是多價(jià)的，則所述第二抗體的表位可與第一抗體相同或在一些情形中所述第一抗體可與所述第二抗體相同)。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述第二分析物是C反應(yīng)蛋白(CRP)。
全文摘要
本發(fā)明提供利用免疫色譜法的測量方法、免疫色譜測試條和免疫色譜法試劑盒，所述免疫色譜法、免疫色譜測試條和免疫色譜法試劑盒能夠以與常規(guī)方法相比簡單的操作精確短期測量血液中的分析物。本發(fā)明提供通過免疫色譜法的測量方法，在所述免疫色譜法中，同一樣品中的分析物和血紅蛋白的濃度通過免疫色譜法來測量，從而利用血紅蛋白的測量值對(duì)分析物的測量值進(jìn)行血細(xì)胞比容校正，以及提供用于免疫色譜法的測試條和試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/53GK103069277SQ201180026969
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者小林幸司, 森田元喜, 伊藤佐智子 申請(qǐng)人:積水醫(yī)療株式會(huì)社