專利名稱：用于核酸適配子的篩選的多元微流體裝置及利用此裝置的核酸適配子的高通量篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于核酸適配子的篩選的多元微流體裝置及利用此裝置的核酸適配子的高通量篩選方法，尤其是涉及，將現(xiàn)有的針對單一目標(biāo)的適配子開發(fā)方式轉(zhuǎn)換為改善的多元平臺的多元微流體裝置(SELEX lap-on-a-chip)及將其與高通量測序方法(high throughput sequencing)連接的核酸適配子高通量篩選方法(high throughputselection mehtod)。
背景技術(shù)：
適配子為單鏈DNA或RNA分子，是以高親和力可特殊識別目標(biāo)物質(zhì)的單鏈寡核酸。適配子可以作為檢測分析系統(tǒng)中可識別分子的生物傳感器的一個因素，目前被關(guān)注為抗體的代替物質(zhì)。特別是，適配子與抗體不同，可以作為包括毒素的各種有機(jī)物及無機(jī)物的目標(biāo)分子，一旦分離出可以與特定物質(zhì)特殊結(jié)合的適配子，則可以通過自動化的寡核酸合成方法，以低成分實(shí)現(xiàn)持續(xù)再生產(chǎn)，非常經(jīng)濟(jì)。由此，1996年首次開發(fā)出利用熒光標(biāo)記的適配子測量目標(biāo)蛋白質(zhì)的基于適配子的生物傳感器以來，基于所述適配子的優(yōu)點(diǎn)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，開
發(fā)出各種適配子生物傳感器(開發(fā)者千處夸 ，NICE, 26 (6) :690，2008)。作為分離所述適配子的方法，一直以來使用SELEX(Systematic Evolution ofLigands by Exponential enrichment)工藝，但此方法一次只能實(shí)現(xiàn)對單一目標(biāo)分子的適配子分離，一直到可以篩選到高親和力的適配子或者僅剩少量的核算為止，要重復(fù)進(jìn)行10次以上的放大/分離工序，并且另外還需要親和度測試，因此，新適配子的開發(fā)所需時間較長，其工序復(fù)雜。由此，需要開發(fā)通過更簡單的工序，在短時間內(nèi)，同時分離出對兩個以上的目標(biāo)物質(zhì)的適配子的新的適配子篩選工序。并且，也需要開發(fā)用于適配子篩選的自動化工序。近來，為了更快的SELEX工序，引進(jìn)了幾種微流體技術(shù)，欲將分離適配子的時間從數(shù)個月 / 數(shù)周縮短為數(shù)日(Hybarget, et al. , Anal. Bioanal. Chem. , 384 191, 2006 ；Windbichler, et al. , Nat. Protoc. , I :637, 2006 ;Eulberg, et al. , Nucleic AcidsResearch, 33 e45, 2005)。但是,這些方法并不適合作為更小型化且多?；倪m配子篩選工序。針對此問題，本發(fā)明的發(fā)明人在PCT/US2009/054097號中開發(fā)出引用多元技術(shù)的微流體裝置，但此技術(shù)也無法實(shí)現(xiàn)多個適配子的分離，只能是對結(jié)合于目標(biāo)分子的適配子進(jìn)行依序分離，并且，其用于適配子分離的裝置也受限制。因此，需要開發(fā)出可以更加縮短工序執(zhí)行時間，適合于對整個工序進(jìn)行自動化處理的新型裝置及工序。本發(fā)明的發(fā)明人致力于開發(fā)提高效率及實(shí)現(xiàn)自動化的新型多元微流體裝置及利用其的適配子高通量篩選方法，經(jīng)努力確認(rèn)，首先制造利用主要的微細(xì)結(jié)合通道以外的其他洗脫通道或管體的微流體裝置模塊，之后，連接各個模塊，在數(shù)十個或數(shù)百個反應(yīng)腔室內(nèi)對數(shù)十-數(shù)百個目標(biāo)物質(zhì)同時多發(fā)地進(jìn)行適配子分離，并可以與高通量測序裝置或高通量、親和力測試裝置連接而實(shí)現(xiàn)自動化，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種多元微流體裝置，以改善的新方式，同時篩選多個適配子。本發(fā)明的另一目的在于，提供一種適配子篩選方法，通過可實(shí)現(xiàn)自動化的新方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，更快地篩選多個適配子。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于核酸適配子的篩選的多元微流體裝置，其特點(diǎn)在于，包括(a)結(jié)合通道，用于連接入口及出口；(b)多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，其形成于所述結(jié)合通道內(nèi)； (C)多個洗脫通道，其分別連接于所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域；及，(d)閥門開關(guān)裝置。本發(fā)明還提供一種用于適配子的篩選的多元微流體裝置，其特點(diǎn)在于，包括(a)結(jié)合通道，其用于連接入口及出口之間；(b)多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，其形成于所述結(jié)合通道內(nèi)；及，(c)連接區(qū)域，用于連接所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域。本發(fā)明還提供一種用于適配子的篩選的多元化芯片，其特點(diǎn)在于，以所述多元微流體裝置為一個單位體，包括兩個以上所述單位體，所述單位體通過連接區(qū)域互相連接。本發(fā)明還提供一種核酸適配子的高通量(high Throughput)篩選方法,其特點(diǎn)在于，包括(a)將由具有隨機(jī)化排列區(qū)域的單鏈核酸構(gòu)成的核酸群導(dǎo)入至權(quán)利要求I至37中任一項(xiàng)所述的多元微流體裝置的結(jié)合通道，使其與結(jié)合通道內(nèi)的目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的目標(biāo)分子進(jìn)行反應(yīng)的步驟；(b)從所述多元微流體裝置去除未與所述目標(biāo)分子結(jié)合的核酸的步驟；(C)將與所述目標(biāo)分子結(jié)合的核酸洗脫至所述多元微流體裝置的各個洗脫通道或各個連接區(qū)域的一側(cè)的步驟；(d)收集在所述(C)步驟中洗脫的核酸進(jìn)行放大的步驟；(e)將在所述(d)步驟中放大的核酸引入至所述多元微流體裝置的結(jié)合通道，并重復(fù)所述(a)至⑷步驟的步驟，此時，在最后一個重復(fù)過程中洗脫的核酸不進(jìn)行放大步驟；及(f)將在最終重復(fù)過程中洗脫的核酸篩選為適配子的步驟。本發(fā)明還提供包括所述的多元微流體裝置的適配子的高通量篩選用套件。本發(fā)明還提供通過高通量測序方法分析通過所述多元微流體裝置輸出的核酸進(jìn)行分析的方法。本發(fā)明的其他特征及實(shí)施例將通過以下詳細(xì)說明及權(quán)利要求書更加明確。


圖I為本發(fā)明中適配子篩選方法的概略示意圖2為包括氣壓閥門開關(guān)裝置的5-PLEX微流體裝置的概略示意圖；圖3為5-PLEX微流體裝置的概略示意圖，該裝置具有閥門開關(guān)裝置，所述閥門開關(guān)裝置用于，在洗脫與目標(biāo)反應(yīng)的核酸物質(zhì)時，通過用于分離多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域之間的結(jié)合信道的閥門和其他閥門，調(diào)節(jié)運(yùn)行結(jié)合通道和洗脫通道之間的轉(zhuǎn)換，“氣壓閥(Pneumatic valve) I”是用于在與目標(biāo)反應(yīng)的核酸物質(zhì)洗脫時，分離多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域之間的結(jié)合通道，“氣壓閥(Pneumatic valve) 2”用于轉(zhuǎn)換結(jié)合通道和洗脫通道之間的運(yùn)行。圖4為根據(jù)圖2制造的裝置的流程圖，(a)為5-PLEX微流體裝置，(b)為向主結(jié)合通道注入藍(lán)色墨水(包括欲與目標(biāo)分子結(jié)合的適配子的結(jié)合溶液)的圖片，(C)為利用洗滌溶液進(jìn)行洗滌工序的圖片，(d)為向洗脫通道注入紅色墨水(洗脫溶液)的圖片，(e)為在閥門運(yùn)行(valve-on)狀態(tài)下隨著流體通道注入的圖片，(f)為運(yùn)行閥門(valve-on)而 使得流體流圖各個洗脫通道的圖片；圖5為將從多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域洗脫核酸結(jié)合物所需的各個洗脫通道的長度設(shè)置成相同長度，并確認(rèn)洗脫溶液的體積及洗脫速度一致的結(jié)果示意圖；圖6為根據(jù)電信號傳輸控制圖4的情況的示意圖；圖7為圓形24多元化SELEX芯片(Multiplex SELEX chip)的一實(shí)施例示意圖；圖8為24多元化SELEX芯片的另一實(shí)施例示意圖；圖9為24多元化SELEX芯片的再一實(shí)施例示意圖；圖10為圓形96多元化SELEX芯片的一實(shí)施例；圖11為連接區(qū)域，即利用管體連接目標(biāo)結(jié)合區(qū)域(反應(yīng)腔室)的微流體裝置的概略不意圖；圖12為連接區(qū)域，即利用管體連接目標(biāo)結(jié)合區(qū)域時，使用管體和通道層間金屬銷的概略不意圖；圖13為連接區(qū)域，即利用管體連接目標(biāo)結(jié)合區(qū)域時，使用銜接件的示意圖；圖14中A為利用管體實(shí)現(xiàn)模塊連接的多元化芯片的概略示意圖，B為模塊連接的實(shí)際實(shí)施例示意圖；圖15為本發(fā)明中方法的自動化工序執(zhí)行實(shí)施例概略示意圖；圖16為利用圖2的裝置分別分離對BSA(陰性對照)、TBP、IIB、EGFP、HSF的5種目標(biāo)的適配子后，通過Q-PCR技術(shù)確認(rèn)各個適配子結(jié)合到相應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)的曲線圖。
具體實(shí)施例方式除非以其他形式被定義，本發(fā)明說明書中使用的所有技術(shù)用語及科技用語與本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的用語具有相同的含義。通常，本發(fā)明說明書所使用的命名法是本技術(shù)領(lǐng)域所公知的，是慣用的方法。在本發(fā)明的詳細(xì)說明中使用的主要用語的定義如下。本申請中所述的“核酸”為單鏈或雙鏈DNA、RNA及其化學(xué)形式，所述形式并不干涉被篩選核酸的放大，但并不限于此，包括脊柱(backbone)形式、甲基化、異常鹽基狀組合、5-溴尿卩密唳(5-Bromouracil)的取代等。在本申請中，“適配子”是指具有高親和力，可以特殊地識別目標(biāo)物質(zhì)的較小的單鏈寡核酸。在本申請中，“目標(biāo)分子”是指選自有蛋白質(zhì)、多肽、碳水化合物(carbohydrate)、脂質(zhì)(lipid)、制藥代理(pharmaceutical agent)、低分子物質(zhì)、有機(jī)非藥物代理(organicnon-pharmaceutical agent)及細(xì)胞等巨分子復(fù)體(macromolecuIar complex)組成的群，但并不限于此。此時，低分子物質(zhì)包括指雙酚A等非極性低分子化學(xué)物質(zhì)等。在本申請中，“目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域”是指通過溶膠凝膠組合物、珠(bead)等結(jié)合有目標(biāo)分子，從而可以實(shí)現(xiàn)適配子結(jié)合的反應(yīng)腔室。在本申請中，“微流體裝置”是指控制或操作yl、nL、pL、fL等微量(micro)標(biāo)準(zhǔn)的極微量溶液的流動的裝置。一方面，如圖I所示，本發(fā)明提供一種用于核酸適配子的篩選的多元微流體裝置，所述裝置可適用于改善的 SELEX(X(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment)工序。本發(fā)明中的用于核酸適配子的篩選的多元微流體裝置包括如下結(jié)構(gòu)。(a)基板，其包括連接入口及出口之間的結(jié)合通道；(b)多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，其形成于所述結(jié)合通道內(nèi)；(C)洗脫通道(elution channel),其分別連接于所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域；及，(d)閥門開關(guān)裝置。在本發(fā)明中，在連接入口及出口之間的流體通道內(nèi)形成有多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，因此，連接所述入口及出口之間的流體通道定義為結(jié)合通道，分別與所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域連接，從目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域洗脫與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合的核酸分子的流體通道定義為洗脫通道。本發(fā)明的特點(diǎn)是，在一個結(jié)合通道內(nèi)形成有多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域。此時，包括于各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的目標(biāo)分子為相同的目標(biāo)分子，或兩個以上互不相同的目標(biāo)分子。優(yōu)選地，各個目標(biāo)分子是各不相同的目標(biāo)分子，此時，目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，即發(fā)生目標(biāo)分子與導(dǎo)入的核酸群的結(jié)合的腔室通過結(jié)合通道與其他腔室連接，從一端，即從結(jié)合通道的入口投入具有隨機(jī)化排列區(qū)域的核酸群，則核酸群進(jìn)入各個腔室內(nèi)，與多個目標(biāo)分子同時結(jié)合。由此，可以誘導(dǎo)適配子對各個目標(biāo)分子的競爭(competition)，可以滿足篩選親和力(affinity)較高的適配子的條件。在本發(fā)明中，所述結(jié)合通道及目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域是由蒸鍍(exposition)于所述基板表面上的基板蓋所形成，所述多個洗脫通道也可以由蒸鍍于所述基板表面上的基板蓋(Iid)形成。此時，從所述目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域洗脫與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合的核酸分子時，各個洗脫通道的長度設(shè)置成相同長度，使得洗脫溶液的體積和速度一致。
并且，在結(jié)合反應(yīng)時，使得流體通過所述結(jié)合通道流入所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域之間，并且在結(jié)合結(jié)束后，閥門開關(guān)裝置運(yùn)行，使得流體并不通過結(jié)合通道流動于所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域之間，而是通過連接于各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的洗脫通道，洗脫結(jié)合于目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的目標(biāo)分子的核酸。此時，閥門開關(guān)裝置可以使得多元微流體芯片內(nèi)的結(jié)合通道和洗脫通道之間的轉(zhuǎn)換可以自動調(diào)節(jié)，包括兩個以上裝置，即兩個以上的閥門，使得各個閥門可以不同運(yùn)行。例如，閥門開關(guān)裝置可以包括用于調(diào)節(jié)結(jié)合通道內(nèi)流體的流動的閥門和將包 括結(jié)合于所述目標(biāo)分子的核酸的流體洗脫至洗脫通道的閥門。上述閥門裝置可以調(diào)節(jié)及優(yōu)化流體的速度及流動，減少基板蓋與基板(chip)之間粘接部分的壓力，從而可以降低流體泄露可能性。閥門開關(guān)裝置可以是以熱、氣壓、熱力氣動、液壓、靜電力、電子力、磁力、相位變化、壓電等驅(qū)動方式驅(qū)動的閥門其中之一(壓力閥、頻率控制閥門(frequencycontrol-valve)、微閥門(mirco-valve)及方向性閥(cock)等)，但只要是在具有隨機(jī)化排列區(qū)域的核酸群(pool)進(jìn)行目標(biāo)分子結(jié)合反應(yīng)時，通過結(jié)合通道使得包括所述核酸群的流體流動，之后，在洗脫結(jié)合于各個目標(biāo)分子的核酸時，使得包括與所述目標(biāo)分子結(jié)合的核酸的流體流動于所述洗脫通道的閥門開關(guān)裝置就不受所述閥門的限制。此時，所述壓力閥利用水壓、氣壓等壓力變更流體的流向，微型閥是人為地插入微細(xì)大小的2-way或3-way閥門，根據(jù)人為選擇，通過洗脫通道或者結(jié)合通道實(shí)現(xiàn)流體的流動。并且，使用方向性閥的裝置是具有方向性的活動性開關(guān)裝置，是在集成反應(yīng)時，即執(zhí)行核酸的目標(biāo)分子結(jié)合反應(yīng)時，以水平開關(guān)，使得流體通過結(jié)合通道流動，個別洗脫結(jié)合的核酸時，以垂直開關(guān)，使得流體通過洗脫通道洗脫的閥門開關(guān)裝置。如圖2所示，本發(fā)明的實(shí)施例中制造出了包括氣壓閥門開關(guān)裝置的5-plex微流體裝置，所述裝置一次可以對5個目標(biāo)分子的適配子進(jìn)行篩選。本發(fā)明中的5-PLEX微流體裝置(5-plex SELEX-on-a-Chip)包括底部，其包括作為加熱裝置的金屬電極；腔體；通道；及，蓋體部，其用于形成閥門開關(guān)裝置(壓力閥)(圖2中的①)。底部起到洗脫與目標(biāo)分子結(jié)合的核酸的加熱裝置(heater)的作用，所述底部用PDMS (Polydimethylsiloxane,聚二甲基娃氧燒)涂布了芯片,所述芯片是5個焊條加熱器(heater electrode)被鉻/金(Cr/Au)所圖案化(圖2中的②)，基板蓋在其上部形成了具有連接5個腔體和腔體之間的通道的第一個層(圖2中的③)，并且在其上部形成了作為基板蓋的、構(gòu)成氣壓閥的第二個層(圖2中的④)及起到支撐臺作用而使得流體及氣壓順利進(jìn)入的第三個層(圖2中的⑤)。此時，所述基板蓋都由PDMS形成。適配子-目標(biāo)物質(zhì)的反應(yīng)腔室的直徑為I. 8mm,高為30 u m,通道的寬度為0. 28mm。用于施加氣壓的腔體的直徑為0. 5mm，高度為30iim，通道寬度為0. 2mm。為了貼合PDMS和PDMS，在大氣壓條件下利用等離子進(jìn)行表面處理，使其具有超親水性并利用于粘合技術(shù)，用于表面處理的Ar/02的暴露時間為2秒。設(shè)置于所述目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域之間，即連接腔體和腔體的通道上的氣壓閥，在通道中形成氣壓而阻攔流體從腔體流入至另一腔體，使得流體分別獨(dú)立流入至各個洗脫通道。并且，如圖3所示，利用另外的閥門可以自動調(diào)節(jié)結(jié)合通道與洗脫通道之間的轉(zhuǎn)換。即，如圖4所示，將核酸結(jié)合于目標(biāo)分子時，打開氣壓閥，使得包括核酸群的流體從腔體流入至腔體，并結(jié)合于各個目標(biāo)分子，洗脫時，利用氣壓閥阻攔流體的流動，并使得金屬電極部分(腔體)發(fā)熱，使得流體無交叉污染(cross-contamination)地分別從各個腔體流出。并且，在本實(shí)施例中，將用于從多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域洗脫核酸結(jié)合物的各個洗脫通道的長度設(shè)計(jì)為相同長度，結(jié)果，確認(rèn)到洗脫通道的體積及洗脫速度一致(圖5)。此時，為了在洗脫通道中將通道長度設(shè)計(jì)成相同長度，將流速統(tǒng)一，可以將“阻力”(通道的彎折)適用于洗脫通道。從電信號流(Signal flow)角度圖示利用氣壓閥的實(shí)驗(yàn)的情況如圖6所示。利用被電信號控制的氣壓系統(tǒng)機(jī)械輸入(Mechanical input)至腔體的氣壓(P)誘導(dǎo)V腔室組(Vchamber Array)的隔膜(diaphragm)的變形,這種變形(S )起到阻攔流動的流體的閥門作用，所述電信號是利用鼠標(biāo)或鍵盤輸入。并且，本發(fā)明中的用于核酸適配子的篩選的多元微流體裝置可以如圖7至圖10設(shè)計(jì)。圖7為24多元化SELEX芯片(Multiplex SELEX chip)，其設(shè)計(jì)成圓形使得芯片的形狀更加簡單。所述芯片如噴泉，可實(shí)現(xiàn)同時洗脫(elution)，可提高效率。特別是，在圓形內(nèi)部可以設(shè)置多個腔體(Chamber)，可以實(shí)現(xiàn)更多的SELEX。此時，優(yōu)選在芯片內(nèi)部設(shè)置泵體，實(shí)現(xiàn)自動SELEX。并且，圖8也是24多元化SELEX芯片，可以在一個模具(mold)上制造6個左右，可一次性制造多個芯片，還可提高實(shí)驗(yàn)時的效率。此時，可以擴(kuò)大芯片的大小，從而可以實(shí)現(xiàn)24個以上的SELEX芯片，并且各個腔體為獨(dú)立形狀，不會受到旁邊的溶膠凝膠的影響。并且，圖9也是24多元化SELES芯片，該圖中也可以將芯片大小擴(kuò)大而實(shí)現(xiàn)24個以上的更多的SELEX芯片。并且，圖10為96多元化SELEX芯片，其涉及為圓形(Disc-type)，芯片形狀簡單，可以縮小芯片大小而設(shè)計(jì)。所述芯片如噴泉，可實(shí)現(xiàn)同時洗脫(elution)，可提高實(shí)驗(yàn)效率。特別是，在圓形內(nèi)部可以設(shè)置多個腔體(Chamber)，可以實(shí)現(xiàn)更多的SELEX。此時，優(yōu)選地，在芯片內(nèi)部設(shè)置泵體，實(shí)現(xiàn)自動SELEX。本發(fā)明中用于核酸適配子的篩選的多元微流體裝置，還包括以下結(jié)構(gòu)。(a)基板，其包括連接入口及出口之間的結(jié)合通道；(b)多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，其形成于所述結(jié)合通道內(nèi)；及，(C)連接區(qū)域，用于連接所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域。在本發(fā)明中，所述連接區(qū)域的一端可以從其一側(cè)或兩側(cè)的目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域分離，如圖11所示，其可以為管體(tube)。并且，在本發(fā)明中，所述結(jié)合通道及目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域可以通過蒸鍍于所述基板表面上的基板蓋(Iid)形成，所述管體連接至各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的孔(hole)，所述孔也是通過蒸鍍于所述基板表面上的基板蓋(Iid)所形成，此時，連接方法有“管體與所述目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的孔間的直接連接，漢密爾頓注射器的針與所述目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的孔之間的直接連接”等方法，但這種連接會出現(xiàn)反應(yīng)物的泄露、無法再利用等問題點(diǎn)。為此，本發(fā)明如圖12所示，在目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，即用于產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)的腔體件連接的管體的切割部位上，用金屬銷進(jìn)行連接，使得腔體的注入口與管體的連接及分離更加自由，并且可連續(xù)使用。并且，在本發(fā)明的實(shí)施例中，為了防止基板與形成所述目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的孔的基板蓋之間的翹起現(xiàn)象，如圖13所示，另行蒸鍍了銜接件(adapter)結(jié)構(gòu)。此時，銜接件優(yōu)選由PDMS(Polydimethylsiloxane,聚二甲基娃氧燒)形成的板型結(jié)構(gòu)物。通過設(shè)置銜接件，可提高管體與通道層之間的連接度，從而實(shí)現(xiàn)基板表面與基板蓋之間的強(qiáng)力貼合。在本發(fā)明的裝置中，目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，即反應(yīng)腔室的目標(biāo)分子可通過各種方法固定。例如，利用溶膠凝膠階段曝氣法可以固定各種物質(zhì)，例如化學(xué)物質(zhì)、肽等低分子物質(zhì)、蛋白質(zhì)、抗體、細(xì)胞等，可以無結(jié)構(gòu)變化地以活性狀態(tài)固定于反應(yīng)腔體內(nèi)。并且，可以在反應(yīng)腔室內(nèi)捕獲螯合親和層析柱(Ni-NTA-agarose)珠(bead)、磁性珠、谷胱甘肽表面處理、珠、與環(huán)氧樹脂等反應(yīng)的物質(zhì)和bead的復(fù)合體，根據(jù)各種目標(biāo)分子的應(yīng)用，可以固定各種bead。并且，隨著在各個反應(yīng)腔室內(nèi)固定不同種類的細(xì)胞，可以開發(fā)針對表達(dá)于細(xì)胞表面的物質(zhì)的適配子。此時，為了防止目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，即反應(yīng)腔室之間的異物污染或目標(biāo)分子-bead復(fù)合體之間的混淆，優(yōu)選地，可以使用薄膜(membrane)過濾器。S卩，在制造PDMS蓋(Iid)時，將兩種試劑(reagent)混合后，在硬化之前，提前將薄膜帖于用于管體連接的孔部分而硬化，完全硬化后，打孔而與管體連接，此方式可以防止腔體之間的異物污染。由此，本發(fā)明可以在目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域之間附加設(shè)置過濾器。結(jié)合于上述目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的目標(biāo)分子的核酸，通過閥門開關(guān)裝置從洗脫通道洗脫，或通過目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的連接區(qū)域的一端而洗脫，根據(jù)固定于目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，即反應(yīng)腔室的物質(zhì)，結(jié)合于目標(biāo)分子的核酸分子的分離可以直接適用于以各種方法開發(fā)的芯片上。例如，可以通過高濃度氯化(NaCl，KCl，MgCl2, Tris等)、pH變化(HCl，NaOH處理)方法變化核酸的三位結(jié)構(gòu)，從而可以誘導(dǎo)出親密度缺陷，通過尿素(Urea)處理來誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，從而分離核酸。除此之外，還有根據(jù)濃度變化的競爭分離法，可以通過高濃度咪唑(Imidazole)、谷胱甘肽(Glutathione)處理來誘導(dǎo)競爭分離結(jié)合,如果是對化學(xué)品的核酸分離，則通過高濃度化學(xué)品處理來激發(fā)核酸分子結(jié)合競爭來進(jìn)行分離。但是，在本發(fā)明的實(shí)施例中，是利用熱來分離結(jié)合于目標(biāo)分子的核酸分子。適配子是在形成結(jié)構(gòu)時具有對目標(biāo)物質(zhì)的結(jié)合力，這種結(jié)構(gòu)是根據(jù)鹽基之間的氫結(jié)合而形成?？梢约ぐl(fā)DNA或RNA的熱改性的溫度稱為溶解溫度，在比溶解溫度略高的溫度條件下，鹽基之間的氫結(jié)合會斷開，使得適配子的結(jié)構(gòu)拆解，失去對目標(biāo)物質(zhì)的結(jié)合力，從而可以從目標(biāo)分離(elution,洗脫)。通常,洗脫適配子的溫度為65 95°C。在本發(fā)明的一實(shí)施例中制造的SELEX芯片(SELEX-on-a-chip)中，在芯片上蒸鍍金屬電極，形成增加電阻值的結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生較高的熱量，從而實(shí)現(xiàn)適配子的分離洗脫。通過對適用熱條件的最佳化(尋找僅影響適配子的結(jié)構(gòu)變化的溫度條件)，誘導(dǎo)高純度適配子洗脫。此時，優(yōu)選地，可以使現(xiàn)有的分離方法與芯片上產(chǎn)生的熱一起融合適用。此時，本發(fā)明的裝置將作為加熱裝置的電極中的一個電極靠近所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域而設(shè)置，或者，多個電極分別靠近各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域而分別設(shè)置。在本發(fā)明人的專利PCT/US2009/054097號中，為了防止結(jié)合于形成在一個流體通道內(nèi)的目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的目標(biāo)分子的核酸被混合，依次洗脫，在各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的下端部分別形成獨(dú)立地電極，與此不同地，在本發(fā)明中，利用一個電極對整個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域進(jìn)行加熱，實(shí)現(xiàn)核酸分子同時分離。在此，金屬電極的材質(zhì)只要是可以發(fā)熱的材料即可(例如，Al、Cr/Au等)。如圖8至圖10所示，所述優(yōu)點(diǎn)特別是可以幾何級數(shù)減少了同時對多個目標(biāo)分子進(jìn)行SELEX時的時間。在以往的專利中，因低效率的洗脫時間，無法實(shí)現(xiàn)24plex以上的高速篩選，但是通過閥門裝置的開關(guān)裝置，提高了高速篩選效率，實(shí)現(xiàn)了 24-flex、96-flex等多 重分析。在本發(fā)明中，為了防止在閥門驅(qū)動及管體連接時的反應(yīng)物的泄露，改善了以下幾點(diǎn)。即，在本發(fā)明的實(shí)施例中，調(diào)節(jié)及優(yōu)化流體速度及流動，減少基板蓋和基板(chip)帖合部分的壓力，從而減少流體的泄露。并且，在玻璃基板表面涂布PDMS(Polydimethylsiloxane),形成腔體和通道的基板蓋也用PDMS形成而構(gòu)成“全部PDMS芯片(All PDMS Chip)”，結(jié)果，提高了芯片和基板蓋部分的粘著力，從而減少了流體的泄露。S卩，在本發(fā)明中，基板是由如PDMS、PMMA(polymethylmethacrylate,聚甲基丙烯酸甲酯)及聚苯乙烯(polystyrene)等塑料、玻璃、娃膠及金(Gold)等金屬其中之一形成，優(yōu)選地，所述基板是由PDMS(Polydimethylsiloxane)涂層。此時，所述基板蓋由PDMS (Polydimethylsiloxane)形成，從而構(gòu)成All PDMS Chip結(jié)構(gòu)。并且,優(yōu)選地,利用使得基板和目標(biāo)分子的固定更加容易的化合物，即PVAc、聚醋酸乙烯酯等進(jìn)行涂層。在本實(shí)施例中，由TOMS形成基板蓋，此時，通過調(diào)整基板蓋厚度來降低無流體流動時通道內(nèi)產(chǎn)生的反壓(back pressure)。并且,較薄地設(shè)計(jì)PDMS基板蓋,從而可以提高閥門驅(qū)動效率。即，優(yōu)選地，所述PDMS基板蓋的厚度< 200iim，更優(yōu)選100 200 y m。并且，上述基板蓋由聚苯乙烯(polystyrene)形成，基板由塑料、玻璃或娃膠形成，如塑料-聚苯乙烯、玻璃-聚苯乙烯、硅膠-聚苯乙烯等來構(gòu)成裝置。本發(fā)明中的多元微流體裝置可以該裝置為基本單位(模塊)，連接兩個以上而使 用，從另外一個角度，本發(fā)明是涉及用于適配子篩選的多元化芯片，其以所述多元微流體裝置為一個單位體，包括兩個以上，所述單位體通過連接區(qū)域互相連接。此時，利用管體或通道串聯(lián)或并聯(lián)基本單位體，從而構(gòu)成多元化芯片。并且，優(yōu)選地，連接所述基本單位體的連接區(qū)域上設(shè)置過濾器，可以防止基板單位體之間的異物污染。從另一個觀點(diǎn)上,本發(fā)明涉及核酸適配子高通量(high Throughput)篩選方法,所述方法利用上述多元微流體裝置。此時，本發(fā)明的篩選方法包括如下步驟。(a)將由具有隨機(jī)化排列區(qū)域的單鏈核酸構(gòu)成的核酸群導(dǎo)入至上述多元微流體裝置的結(jié)合通道，使其與結(jié)合通道內(nèi)的目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的目標(biāo)分子進(jìn)行反應(yīng)的步驟；(b)從所述多元微流體裝置去除未與所述目標(biāo)分子結(jié)合的核酸的步驟；(C)將與所述目標(biāo)分子結(jié)合的核酸洗脫至所述多元微流體裝置的各個洗脫通道或各個連接區(qū)域的一側(cè)的步驟；(d)收集在所述(C)步驟中洗脫的核酸進(jìn)行放大的步驟；(e)將在所述(d)步驟中放大的核酸引入至所述多元微流體裝置的結(jié)合通道，并重復(fù)所述(a)至⑷步驟的步驟，此時，在最后一個重復(fù)過程中洗脫的核酸不進(jìn)行放大步驟；及(f)將在最終重復(fù)過程中洗脫的核酸篩選為適配子的步驟。本發(fā)明的上述方法可以對具有不同的隨機(jī)化排列區(qū)域的IX IO9 15個核酸群進(jìn)行。隨機(jī)化(randomized)此用語用于敘述在規(guī)定長度內(nèi)具有任意可能的排列的核酸的段(segment)。隨機(jī)化排列可以根據(jù)需要具有8-100核苷酸以上范圍的各種長度。因?yàn)榭赡艽嬖诘臒o法預(yù)知的偏向性或核苷酸選擇性，形成隨機(jī)化排列段的化學(xué)或酶反應(yīng)有可能無法生成計(jì)算出的隨機(jī)化排列。隨機(jī)化一用語是為了反應(yīng)上述偏向可能性，代替隨機(jī)而使用。在已公知的依次化學(xué)合成等技術(shù)中，并沒有發(fā)生很大的偏差。在較短的段中，可能存在的極小的偏向性是可以無視的。特別是本方法需要對向核酸測試混合物的初期制造。個別的測試核酸可以具有保存于混合物內(nèi)的所有核酸的排列和構(gòu)成側(cè)面的隨機(jī)化區(qū)域。保存區(qū)域是為了使得核酸的放大及篩選更加容易而設(shè)置。在本領(lǐng)域中這樣的排列較多，因此，在排列的選擇上，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以與指定的放大方法一同進(jìn)行選擇。隨機(jī)化區(qū)域可以具有完全或部分隨機(jī)化排列。選擇性地，核酸的該部分可以具有混合物的所有核酸類中的固定的副部分的同時，一同具有隨機(jī)化副部分。例如，被公知為與標(biāo)記蛋白質(zhì)結(jié)合的，或?yàn)榱私Y(jié)合而被篩選的排列區(qū)域與隨機(jī)化區(qū)域成為一體，從而可以改善結(jié)合性或結(jié)合的特異性。測試混合物的排列多樣性，可以通過在篩選/放大工序中對測試混合物的核酸產(chǎn)生變異而引入或放大。原則上，被測試混合物采用的核酸可以根據(jù)其可以放大的情況具有任意長度。本發(fā)明方法是在多個排列變異體中進(jìn)行篩選的方法中最實(shí)用的方法。并且，優(yōu)選地，本發(fā)明的方法被采用于約4鹽基到任意可到達(dá)的大小的核酸排列的結(jié)合的評價。在本發(fā)明中，包括于所述多元微流體裝置的各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的目標(biāo)分子是相同的目標(biāo)分子或兩個以上互不相同的目標(biāo)分子。優(yōu)選地，各個目標(biāo)分子為互不相同的目標(biāo)分子，此時，目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，即發(fā)生目標(biāo)分子和導(dǎo)入的核酸群之間的結(jié)合的腔體，通過結(jié)合通道與另一腔體連接，因此，從一端，即從結(jié)合通道的入口注入具有隨機(jī)化排列區(qū)域的核酸群，則核酸群進(jìn)入各個腔體，與多個目標(biāo)分子同時進(jìn)行結(jié)合。由此，對各個目標(biāo)分子 可以誘導(dǎo)適配子競爭(competition),從而可以滿足篩選親和力(affinity)高的適配子的條件。上述目標(biāo)分子，例如，蛋白質(zhì)、多肽、碳水化合物(carbohydrate)、脂質(zhì)(lipid)、制藥代理(pharmaceutical agent)、低分子物質(zhì)、有機(jī)非藥物代理(organicnon-pharmaceutical agent)及細(xì)胞等巨分子復(fù)體(macromolecuIar complex)等，只要是可以成為適配子的目標(biāo)的分子，則不受限制。導(dǎo)入至上述裝置的核酸群，在優(yōu)選與目標(biāo)分子的結(jié)合的條件下，與所述目標(biāo)分子接觸，在所述核酸群中可與目標(biāo)分子特異結(jié)合的核酸與所述目標(biāo)分子結(jié)合形成核酸-目標(biāo)分子對。由此，可以去除隨之產(chǎn)生的未結(jié)合核酸。并且，在本發(fā)明的步驟中，“放大”意味著分子的復(fù)制或增加分子種類的量或數(shù)的工序或工序組合。此時，所述“放大”過程可以是PCR過程，其包括被篩選RNA的cDNA復(fù)制制造步驟；利用聚合酶連鎖反應(yīng)增加各個cDNA的復(fù)制數(shù)的步驟；及,轉(zhuǎn)錄(Transcription)cDNA復(fù)制而獲得與被篩選的RNA具有相同排列的RNA分子的步驟。即，如本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所公知，包括直接DNA復(fù)制、直接RNA放大等方法，本領(lǐng)域公知的反應(yīng)或反應(yīng)的組合都可適當(dāng)利用。從結(jié)果上來說，放大方法必須在放大混合物的比例上體現(xiàn)出初始混合物內(nèi)的不同的排列比例。并且，在本發(fā)明的方法中，可以將上述多元微流體裝置作為基本單位(模塊)，連接兩個以上而使用。即，利用管體或微細(xì)結(jié)合通道，串聯(lián)及并聯(lián)所述基本單位而構(gòu)成多元化(multiplex)芯片。例如，可以連接24個4plex芯片(4-plex chip)改善為96孔板(96-well plate)類型的芯片。這樣模塊化后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，使用?shù)十或數(shù)百個孔板類型的芯片，這種方法容易適用于序列分析(例如，Solexa，測序技術(shù))、物質(zhì)間結(jié)合力分析(如Octet)來實(shí)現(xiàn)自動化。并且，在本發(fā)明中，上述(e)的重復(fù)步驟是一直重復(fù)到達(dá)到規(guī)定的篩選度為止，例如，可以最初實(shí)驗(yàn)混合物，即，具有隨機(jī)化排列區(qū)域的核酸群中的特定核酸達(dá)到指定的結(jié)合程度，或者獲得混合物中最小核酸為止重復(fù)。利用本發(fā)明的多元微流體裝置，即使進(jìn)行不到6次的重復(fù)過程也可以篩選出適配子。即，上述重復(fù)次數(shù)可以小于6次，優(yōu)選地為1-3次。
再者，在本發(fā)明方法的各個重復(fù)過程中，利用高通量測序方法(high throughputsequencing)對從上述多元微流體裝置洗脫的核酸進(jìn)行序列分析，之后，比較在各個重復(fù)過程中利用高通量測序方法分析的序列，將根據(jù)重復(fù)次數(shù)的增加，其相對比例也增加的核酸序列篩選為適配子。此時，因利用高通量測序方法而無需執(zhí)行復(fù)制(cloning)，因此可更快更簡單地篩選適配子。S卩，利用生物信息學(xué)(Bioinformatics)分析工具可以縮減SELEX步驟。執(zhí)行上述高通量測序方法的裝置與上述多元微流體裝置的各個洗脫通道或各個連接區(qū)域的一側(cè)連接，可直接執(zhí)行步驟?，F(xiàn)有技術(shù)中是再篩選對目標(biāo)物質(zhì)的適配子之后，復(fù)制于T-載體，對個別的適配子進(jìn)行鹽基序列分析。但是，其缺點(diǎn)是復(fù)制麻煩，只能是對適配子挨個進(jìn)行序列分析，并且在多元化SELEX中，對很多適配子需另行進(jìn)行序列分析。本發(fā)明的實(shí)施例連接代測序技術(shù)(Solexa)方式的高通量測序方法(High-throughputsequencing)，無需進(jìn)行復(fù)制，對適配子池可以進(jìn)行一次性的序列分析，利用具有個別條形碼的銜接件，對各種目標(biāo)的適配子或各個SELEX過程的適配子池進(jìn)行一次性的序列識別而 另行進(jìn)行分析。目前已經(jīng)出臺了標(biāo)記96中條形碼而對96中目標(biāo)或各個過程中的適配子進(jìn)行序列分析的技術(shù)。作為高通量測序方法，例如，Solexa、Solid技術(shù)等，但并不限于此，只要是可以同時對大量序列進(jìn)行高通量分析即可。并且，上述(f)步驟對最終洗脫的核酸進(jìn)行進(jìn)一步的目標(biāo)分子親和力測試，將親和力被確認(rèn)的核酸篩選為適配子。所述目標(biāo)分子親和力測試為高通量親和力測試方法，例如，作為高通量親和力測試可以利用八隅體系統(tǒng)(Octet system)，八隅體系統(tǒng)利用BH (Bio-Layer Interferometry,干涉技術(shù))技術(shù),可以進(jìn)行用于活體物質(zhì)之間結(jié)合分析的無標(biāo)記(Label-free)動力分析(kinetic analysis)及定量(quantitation)的裝置。BLI (Bio-Layer Interferometry)是在傳感器表面的光層(Optical-layer)上發(fā)生物質(zhì)之間的結(jié)合時，傳感器表面的厚度發(fā)生變化，此厚度變化表示為貫通傳感器表面而被反射的白色光的波動圖案變化，從而測量物質(zhì)之間的結(jié)合的技術(shù)。此技術(shù)可以在兩個小時內(nèi)對96個試劑進(jìn)行動能篩查(kinetic screening)或親和性標(biāo)記試驗(yàn)(affinity test),從而可以進(jìn)行多元化，并且不僅對蛋白質(zhì)，對肽或低分子物質(zhì)之間的相互作用也可以進(jìn)行測量。并且，所述傳感器無需標(biāo)記，因此不但簡單容易，并且與其他無標(biāo)記技術(shù)不同地，可以直接檢測試料表面，因此不具有流體系統(tǒng)中存在的各種問題點(diǎn)。由此，以本發(fā)明的微流體裝置為基本單位，以96孔板式(96well plate type)提供,并將此連接至八隅體(Octet)系統(tǒng)。由此，如圖15所示，本發(fā)明方法的各個步驟可以自動化實(shí)現(xiàn)。以往的SELEX工序是生物相關(guān)試驗(yàn)的集合體，在每個步驟中根據(jù)試驗(yàn)者的能力及經(jīng)驗(yàn)，試驗(yàn)的成功與否也不同。因此，需要較高的規(guī)格化及自動化。但是，本發(fā)明的裝置為SELEX-芯片(SELEX-on-chip)，根據(jù)通用的96/384-孔板規(guī)格設(shè)計(jì)，通過與現(xiàn)有裝置連接而實(shí)現(xiàn)SELEX整個過程的自動化。并且，本發(fā)明中的裝置，即SELEX-芯片(SELEX-on-a-Chip)以單一的單位體(模塊)形式構(gòu)成，利用管體將基本單位串聯(lián)及并聯(lián)連接，從而構(gòu)成多元化芯片(如，96孔型、384孔型等)，通過利用規(guī)格化的SELEX芯片和管體的物理連接，或利用閥門裝置的腔體開關(guān)的驅(qū)動，自動調(diào)節(jié)向96孔板(96-well plate)的適配子分離及回收。由此，易于適用在現(xiàn)有的基于96/384孔板的分析儀器(PCR, High Throughput sequencer, affinity 測量裝置)。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，利用圖2的5-plex微流體裝置，作為對BSA (陰性對照組)、TBP、IIB, EGFP, HSF 5種目標(biāo)的適配子，分別分離出IOlapt (以TBP為目標(biāo)的適配子)、b4apt (以IIB為目標(biāo)的適配子)、GFPapt (以EGFPfmf為目標(biāo)的適配子)及HSFapt (以HSF為目標(biāo)的適配子)。之后，為了確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明的裝置及方法分離的適配子是否與該目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合，利用StepOne-Plus RT PCR(Applied Biosystems,美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行了Q-PCR。結(jié)果，如圖16所示，確認(rèn)到分別以TBP、IIB、EGFP, HSF為目標(biāo)分離的各個適配子對原來的各個目標(biāo)的親和力較高。在圖16的曲線圖中，Y軸的量(Quantity)數(shù)值越高，結(jié)合時的親和力也越高。再者，為了提高便攜性，本發(fā)明的方法可以套件(kits)形式提供。即，從另一個角度來說，本發(fā)明涉及包括上述多元微流體裝置的適配子高通量篩選用套件。此時，所述套件可以將用于洗脫核酸的放大及序列分析的試劑裝于另外的容器或另外的反應(yīng)部而提供。所述適配子的高通量篩選用套件可以使瓶、桶(tub)、小袋(sachet)、信封(envelope)、管體、小瓶(ampoule)等形狀,這些套件的部分或整體可以由塑料、玻璃、紙、箔紙、蠟等形成。容器上可以設(shè)置蓋體，該蓋體可以是容器的一部分，或者通過機(jī)械、粘貼或其他手段而帖附于容器，該蓋體與容器可部分或完全分離。容器上還可以設(shè)置有塞子，該容器通過該塞子，利用注射針來靠近內(nèi)容物。所述套件可以包括外部包裝，該外部包裝可以包括有關(guān)構(gòu)成部分的使用的使用手冊。工業(yè)利用性如上所述，本發(fā)明涉及用于核酸適配子的篩選的多元微流體裝置及利用其的核酸適配子的高通量篩選方法。本發(fā)明中的多元微流體裝置不僅可以同時檢測對多個目標(biāo)的各個適配子，與現(xiàn)有的多元化技術(shù)相比，可以大大縮減處理量及處理時間，特別是將本發(fā)明的裝置與高通量測序方法連接而執(zhí)行適配子篩選工序，從而可大幅減少目標(biāo)結(jié)合/分離/放大工序過程，實(shí)現(xiàn)自動化工序，是非常有利的技術(shù)。如上詳細(xì)記載了本發(fā)明內(nèi)容中的特定部分，本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以知道 上述記載僅為較佳實(shí)施例，本發(fā)明并不限于此。從而，本發(fā)明實(shí)際上的保護(hù)范圍是由權(quán)利要求書及其等價部分所定義。
權(quán)利要求
1.一種用于核酸適配子的篩選的多元微流體裝置，其特征在于，包括(a)結(jié)合通道，用于連接入口及出口；(b)多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，其形成于所述結(jié)合通道內(nèi)；(C)多個洗脫通道，其分別連接于所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域；及，(d)閥門開關(guān)裝置。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其特征在于，所述結(jié)合通道及目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域是由蒸鍍于所述基板表面上的基板蓋所形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其特征在于，所述多個洗脫通道由蒸鍍于所述基板表面上的基板蓋(Iid)所形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其特征在于，所述閥門開關(guān)裝置是在結(jié)合反應(yīng)時，使得流體通過所述結(jié)合通道流動于所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域之間，在結(jié)合結(jié)束后，使得流體并不是通過所述結(jié)合通道流動于所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域之間，而是使得包括結(jié)合于目標(biāo)分子的核酸的流體洗脫至連接于各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的洗脫通道。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于，所述閥門開關(guān)裝置包括用于調(diào)節(jié)所述結(jié)合通道內(nèi)的所述流體的流動的閥門；及，將包括結(jié)合于所述目標(biāo)分子的核酸的流體洗脫至所述洗脫通道的閥門。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的裝置，其特征在于，所述閥門開關(guān)裝置以熱、大氣壓、熱力氣動、液壓、靜電力、電子力、磁力、位相變化及壓電其中之一作為閥門開關(guān)的驅(qū)動因素。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其特征在于，將所述多個洗脫通道的長度設(shè)置為相同的長度，使得洗脫至所述洗脫通道的洗脫溶液的體積及洗脫速度一致。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其特征在于，還包括洗脫裝置，其用于使得與所述各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的目標(biāo)分子結(jié)合的核酸洗脫至與所述各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域連接的各個所述洗脫通道。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的裝置，其特征在于，所述洗脫裝置為加熱裝置，所述加熱裝置靠近所述結(jié)合通道的多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域而設(shè)置。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的裝置，其特征在于，所述加熱裝置為電極。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的裝置，其特征在于，一個所述電極靠近所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域而設(shè)置。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的裝置，其特征在于，多個所述電極靠近所述各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域而分別設(shè)置。
13.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其特征在于，所述基板蓋由聚二甲基硅氧烷PDMS形成。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的裝置，其特征在于，所述PDMS基板蓋的厚度為100 .200 μ m。
15.根據(jù)權(quán)利要求I所述的裝置，其特征在于，所述基板由塑料、玻璃、硅膠及金屬其中之一形成。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的裝置，其特征在于，所述塑料為PDMS、聚甲基丙烯酸甲酯PMMA及聚苯乙烯其中之一。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的裝置，其特征在于，所述基板由PDMS、PVA及聚醋酸乙烯酯其中之一涂層。
18.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其特征在于，所述基板蓋由聚苯乙烯形成，所述基板由塑料、玻璃及硅膠其中之一形成。
19.根據(jù)權(quán)利要I所述的裝置，其特征在于，在所述目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域之間還設(shè)置有過濾器。
20.一種用于適配子的篩選的多元微流體裝置，其特征在于，包括(a)結(jié)合通道，其用于連接入口及出口之間；(b)多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域，其形成于所述結(jié)合通道內(nèi)；及，(C)連接區(qū)域，用于連接所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的裝置，其特征在于，所述連接區(qū)域的一端可與一側(cè)或兩側(cè)的目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域分離。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的裝置，其特征在于，所述連接區(qū)域?yàn)楣荏w。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的裝置，其特征在于，所述結(jié)合通道及目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域是由蒸鍍于所述基板的表面上的基板蓋所形成。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的裝置，其特征在于，所述管體連接至所述目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的孔，所述孔形成于蒸鍍于所述基板的表面上的基板蓋上。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的裝置，其特征在于，所述管體通過金屬銷連接至所述目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的所述孔。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的裝置，其特征在于，在所述管體和所述目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域之間還蒸鍍有銜接件。
27.根據(jù)權(quán)利要求20所述的裝置，其特征在于，還包括洗脫裝置，所述洗脫裝置使得與所述各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的目標(biāo)分子結(jié)合的核酸洗脫至與所述各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域連接的各個所述洗脫通道的一側(cè)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的裝置，其特征在于，所述洗脫裝置為加熱裝置，所述加熱裝置靠近所述結(jié)合通道的多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域而設(shè)置。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的裝置，其特征在于，所述加熱裝置為電極。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的裝置，其特征在于，一個所述電極靠近所述多個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域而設(shè)置。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的裝置，其特征在于，多個所述電極靠近所述各個目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域而分別設(shè)置。
32.根據(jù)權(quán)利要求23所述的裝置，其特征在于，所述基板蓋由聚二甲基硅氧烷PDMS形成。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的裝置，其特征在于，所述PDMS基板蓋的厚度為100 200 μ m。
34.根據(jù)權(quán)利要求20所述的裝置，其特征在于，所述基板由塑料、玻璃、硅膠及金屬其中之一形成。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的裝置，其特征在于，所述基板由PDMS、PVA及聚醋酸乙烯酯其中之一涂層。
36.根據(jù)權(quán)利要求23所述的裝置，其特征在于，所述基板蓋由聚苯乙烯形成，所述基板由塑料、玻璃及硅膠其中之一形成。
37.根據(jù)權(quán)利要20所述的裝置，其特征在于，在所述目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域之間還設(shè)置有過濾器。
38.一種用于適配子的篩選的多元化芯片，其特征在于，以權(quán)利要求I至37中任一項(xiàng)所述的多元微流體裝置為一個單位體，包括兩個以上所述單位體，所述單位體通過連接區(qū)域互相連接。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的多元化芯片，其特征在于，所述單位體之間的連接區(qū)域?yàn)楣荏w或通道。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的多元化芯片，其特征在于，在所述單位體之間的連接區(qū)域還設(shè)置有過濾器。
41.一種核酸適配子的高通量篩選方法，其特征在于，包括(a)將由具有隨機(jī)化排列區(qū)域的單鏈核酸構(gòu)成的核酸群導(dǎo)入至權(quán)利要求I至37中任一項(xiàng)所述的多元微流體裝置的結(jié)合通道，使其與結(jié)合通道內(nèi)的目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域的目標(biāo)分子進(jìn)行反應(yīng)的步驟；(b)從所述多元微流體裝置去除未與所述目標(biāo)分子結(jié)合的核酸的步驟；(c)將與所述目標(biāo)分子結(jié)合的核酸洗脫至所述多元微流體裝置的各個洗脫通道或各個連接區(qū)域的一側(cè)的步驟；(d)收集在所述(C)步驟中洗脫的核酸進(jìn)行放大的步驟；(e)將在所述(d)步驟中放大的核酸引入至所述多元微流體裝置的結(jié)合通道，并重復(fù)所述(a)至⑷步驟的步驟，此時，在最后一個重復(fù)過程中洗脫的核酸不進(jìn)行放大步驟；及(f)將在最終重復(fù)過程中洗脫的核酸篩選為適配子的步驟。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述核酸群包括具有不同的隨機(jī)排列區(qū)域的I X 10卜15個核酸。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述多元微流體裝置包括具有互相不同的目標(biāo)分子的目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域。
44.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述多元微流體裝置包括具有相同目標(biāo)分子的目標(biāo)分子結(jié)合區(qū)域。
45.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)分子選自由蛋白質(zhì)、多肽、碳水化合物、脂質(zhì)、制藥代理、低分子物質(zhì)、有機(jī)非藥物代理及巨分子復(fù)體構(gòu)成的群中。
46.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述多元微流體裝置設(shè)置有兩個以上。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述多元微流體裝置通過管體或通道連接。
48.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，在各個重復(fù)過程中，利用高通量測序方法，對從所述多元微流體裝置洗脫的核酸進(jìn)行序列分析，之后，比較在各個重復(fù)過程中通過高通量測序方法分析的序列,將根據(jù)重復(fù)次數(shù)的增加其相對比例也增加的核酸序列篩選為適配子。
49.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述(e)步驟的重復(fù)次數(shù)為I至6次。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，執(zhí)行所述高通量測序方法的裝置與所述多元微流體裝置的各個洗脫通道或各個連接區(qū)域的一側(cè)連接。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述(f)步驟對最終洗脫的核酸進(jìn)行進(jìn)一步的目標(biāo)分子親和力測試，將親和力被確認(rèn)的核酸篩選為適配子。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)分子親和力測試為高通量親和力測試。
53.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述各個步驟以自動化方法執(zhí)行。
54.一種包括權(quán)利要求I至權(quán)利要求37中任一項(xiàng)所述的多元微流體裝置的適配子的高通量篩選用套件。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于核酸適配子的篩選的多元微流體裝置及利用其的核酸適配子的高通量篩選方法，特別是，將現(xiàn)有的對單一目標(biāo)的適配子開發(fā)方式轉(zhuǎn)換為改善的多元化平臺的多元微流體裝置及將其與高通量測序方法連接的核酸適配子的高通量篩選方法。本發(fā)明中的多元微流體裝置不僅可以同時檢測對多個目標(biāo)的各個適配子，與現(xiàn)有的多元化技術(shù)相比，可以大幅縮減處理量及處理時間，特別是將本發(fā)明的裝置與高通量測序方法連接而執(zhí)行適配子篩選工序，從而可大幅減少目標(biāo)結(jié)合/分離/放大工序過程，實(shí)現(xiàn)自動化工序，是非常有利的技術(shù)。
文檔編號G01N33/53GK102639720SQ201180004708
公開日2012年8月15日 申請日期2011年10月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月5日
發(fā)明者安智瑛, 曺旼廷, 金泰坰, 金邵妍 申請人:Pcl公司, 東國大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)