專利名稱：雌二醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及雌ニ醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。
背景技術(shù)：
雌ニ醇(estradiol，E2)是由卵巢成熟濾泡分泌的ー種天然雌激素，能促進(jìn)和調(diào)節(jié)女性器官及副性征的正常發(fā)育。它主要促使子宮內(nèi)膜增生；增強(qiáng)子宮平滑肌的收縮；促使乳腺導(dǎo)管發(fā)育增生，但較大劑量能抑制垂體前葉催乳素的釋放，從而減少乳汁分泌；抗雄激素作用；降低血中膽固醇，井能增加鈣在骨中的沉著。男性正常范圍50 200pmol/L ；女性正常范圍卵泡期94 433pmol/L，黃體期499 1580pmol/L，絕經(jīng)期40 IOOpmol/し其含量增高主要見于兒童女性化、產(chǎn)生雌激素的腫瘤、男子乳房發(fā)育癥、肝硬化失代償期、腎上腺皮質(zhì)增生；降低則見于Turner綜合征、原發(fā)性和繼發(fā)性功能減退癥。最近，環(huán)境雌激素影響人們生活的事件頻發(fā)。雌ニ醇(eStradi0l，E2)是雌激素中生物活性最強(qiáng)的ー種，摻在預(yù)混料及飼料添加劑中喂養(yǎng)畜、禽，或埋入耳根及家禽翼下，可以大大加快禽類的繁殖和生長。但雌ニ醇及其衍生物卻可滯留在畜禽體內(nèi)，通過食物鏈危害人類健康，使女性兒童提前發(fā)育，男性兒童乳腺發(fā)育呈女性化；男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常或引起病變；并導(dǎo)致女性乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生率上升。因此，在食品安全方面，加強(qiáng)對農(nóng)產(chǎn)品和食品中的雌ニ醇?xì)埩舯O(jiān)測不容忽視。用于檢測雌ニ醇的方法主要有兩大類化學(xué)測定法和免疫測定法?；瘜W(xué)測定法包括光譜法、氣相色譜法(GC)和高效相色譜(HPLC)等。其中HPLC是化學(xué)法中應(yīng)用最廣泛的。高效液相色譜(highperformance liquid chromatography, HPLC)是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送(最高輸送壓力可達(dá)4.9' 107Pa);色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬)；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。它的優(yōu)點(diǎn)是分離效能高，選擇性高，靈敏度高(紫外檢測器可達(dá)10~9 ;熒光檢測器可達(dá)10~12)以及分析速度快。但是雖然HPLC靈敏度高，但需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，精密的提取和凈化過程，難以進(jìn)行樣本的大規(guī)模篩選，不利于生產(chǎn)實(shí)踐中的推廣。目前用于檢測雌ニ醇的檢測多采用免疫測定法，尤其是酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)，因其既能用于快速篩選，又能進(jìn)行定量測定，是當(dāng)前進(jìn)行雌ニ醇檢測最實(shí)用的分析方法。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)和底物對酶的高效催化作用結(jié)合起來的ー種敏感性很高的檢測技木。由于抗原、抗體的反應(yīng)是在ー種固相載體——聚苯こ烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌去除多余的游離反應(yīng)物，從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性和穩(wěn)定性。ELISA檢測中的關(guān)鍵原料是抗原和抗體，抗原可以經(jīng)過 提取、重組、合成等不同的方法獲得，而高特異性、高親和力的抗體卻不容易獲取。特別是針對雌ニ醇這樣的小分子，它的分子量僅為272. 38，直接免疫動(dòng)物很難產(chǎn)生抗體，目前普遍采用的方法是將雌ニ醇進(jìn)行改造，然后偶聯(lián)到卵清蛋白(0VA)、牛血清白蛋白(BSA)等載體蛋白上，最后免疫動(dòng)物收獲抗體，這樣就増加了操作的復(fù)雜性。而且還存在偶聯(lián)效率不穩(wěn)定的情況，很難獲得高質(zhì)量的抗體。因此，需要提供一種雌ニ醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒以解決上述問題。

實(shí)用新型內(nèi)容為了解決該問題，本實(shí)用新型公開了ー種雌ニ醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，所述試劑盒包括固相載體，所述固相載體上設(shè)置有微孔條，所述微孔條包括微孔、包被層和封閉
層。 較佳地，所述固相載體采用96孔聚苯こ烯試劑板形成。較佳地，所述包被層由抗雌ニ醇抗體組成。較佳地，所述固相載體采用48孔聚苯こ烯試劑板形成。本實(shí)用新型的雌ニ醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，具有高品質(zhì)，在試劑盒的特異性、靈敏度等方面有很大的改善。在實(shí)用新型內(nèi)容部分中引入了一系列簡化形式的概念，這將在具體實(shí)施方式
部分中進(jìn)ー步詳細(xì)說明。本實(shí)用新型內(nèi)容部分并不意味著要試圖限定出所要求保護(hù)的技術(shù)方案的關(guān)鍵特征和必要技術(shù)特征，更不意味著試圖確定所要求保護(hù)的技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
以下結(jié)合附圖，詳細(xì)說明本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)和特征。

圖I是根據(jù)本實(shí)用新型一個(gè)實(shí)施例的雌ニ醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的酶標(biāo)板沿著一列微孔的縱剖示意圖。
具體實(shí)施方式
在下文的描述中，給出了大量具體的細(xì)節(jié)以便提供對本實(shí)用新型更為徹底的理解。然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，本實(shí)用新型可以無需ー個(gè)或多個(gè)這些細(xì)節(jié)而得以實(shí)施。在其他的例子中，為了避免與本實(shí)用新型發(fā)生混淆，對于本領(lǐng)域公知的ー些技術(shù)特征未進(jìn)行描述。為了徹底了解本實(shí)用新型，將在下列的描述中提出詳細(xì)的結(jié)構(gòu)。顯然，本實(shí)用新型的施行并不限定于本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟習(xí)的特殊細(xì)節(jié)。本實(shí)用新型的較佳實(shí)施例詳細(xì)描述如下，然而除了這些詳細(xì)描述外，本實(shí)用新型還可以具有其他實(shí)施方式。以下參考附圖對本實(shí)用新型的實(shí)施例做出詳細(xì)描述。參看圖1，是根據(jù)本實(shí)用新型一個(gè)實(shí)施例的雌ニ醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的酶標(biāo)板沿著一列微孔的縱剖示意圖。本實(shí)用新型的試劑盒包括固相載體，該固相載體上設(shè)置有微孔條，微孔條包括微孔1，包被層2和封閉層3。其中使用96孔聚苯こ烯試劑板(PS)作為固相載體。當(dāng)然也可采用48孔聚苯こ烯試劑板(PS)或其他材料的試劑板。包被層2由抗雌ニ醇抗體組成。上述試劑盒的主要制備方法如下。抗雌ニ醇特異性抗體的篩選可以購買商業(yè)化構(gòu)建好的噬菌體抗體庫，并進(jìn)行菌液培養(yǎng)進(jìn)行噬菌體表面呈現(xiàn)。將雌ニ醇固化，抗體庫與固相上的雌ニ醇分子經(jīng)過一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后用酸洗脫下與雌ニ醇結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下ー輪洗脫，經(jīng)過3-5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與雌ニ醇特異結(jié)合的噬菌體抗體得到高度富集。抗雌ニ醇抗體scFv的改造P53基因的表達(dá)產(chǎn)物主要以四聚體的形式存在，由第319-360位氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域能將其自身組裝成四聚體，故該結(jié)構(gòu)域被稱為四聚功能域。篩選獲得的scFv只有ー個(gè)抗原結(jié)合區(qū)，抗原結(jié)合力較完整的mAb低，因此，我們選擇p53四聚功能域基因與抗雌ニ醇scFv基因融合，利用p53四聚功能域基因表達(dá)產(chǎn)物會(huì)自動(dòng)組裝成四聚體這一特性，使抗雌ニ醇基因表達(dá)產(chǎn)物形成四聚體，該抗體具有四個(gè)功能區(qū)，可明顯增加對抗原的結(jié)合力。將含融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至中國倉鼠卵巣(CHO)細(xì)胞中，擴(kuò)增培養(yǎng)后采用親和層析法純化目的抗體，并通過Western-Blot和ELISA等方法對其親和性和特異性進(jìn)行鑒定。 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制備本實(shí)用新型試劑盒的制備過程如下使用96孔聚苯こ烯試劑板(PS)作為固相載體，先將其置于紫外光下輻照2小時(shí)，使PS板活化。在試劑板微孔條上預(yù)先包被一定濃度的抗雌ニ醇抗體，4°C過夜，經(jīng)洗板及牛血清白蛋白封閉處理后制成包被好的酶標(biāo)板。然后進(jìn)行檢測，依次加入待測標(biāo)本(標(biāo)準(zhǔn)品)及生物素化的雌ニ醇，形成酶標(biāo)板微孔中待測樣本(標(biāo)準(zhǔn)品)和生物素化的雌ニ醇競爭結(jié)合包被在微孔中抗雌ニ醇抗體的局面，再通過親和素化辣根過氧化物酶(HRP)放大信號，以3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及硫酸分別作為底物及終止液，然后在ELISA檢測儀上于450nm處讀取O. D值，完成雌ニ醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制備。最后分析數(shù)據(jù)，在試劑盒的檢測范圍內(nèi)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算待測物濃度，待測物濃度越高，樣本O. D值則越低。本實(shí)用新型的技術(shù)效果描述如下噬菌體抗體展示技術(shù)相較傳統(tǒng)的單克隆或多克隆抗體技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)，可以快速聞效的獲得聞質(zhì)量的抗體(見表I)。
權(quán)利要求1.一種雌ニ醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括固相載體，所述固相載體上設(shè)置有微孔條，所述微孔條包括微孔、包被層和封閉層。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雌ニ醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征在于，所述固相載體采用96孔聚苯こ烯試劑板形成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雌ニ醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征在干，所述包被層由抗雌ニ醇抗體組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雌ニ醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，其特征在于，所述固相載體采用48孔聚苯こ烯試劑板形成。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種雌二醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，所述試劑盒包括固相載體，所述固相載體上設(shè)置有微孔條，所述微孔條包括微孔、包被層和封閉層。本實(shí)用新型的雌二醇酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，具有高品質(zhì)，在試劑盒的特異性、靈敏度等方面有很大的改善。
文檔編號G01N33/544GK202372504SQ201120483149
公開日2012年8月8日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者萬定一, 叢旭霞, 何峰容, 姚雯, 李慶, 楊娟, 童曉玲 申請人:武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司