專利名稱：馬鈴薯y病毒檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
馬鈴薯Y病毒檢測試劑盒技術領域[0001]本實用新型屬于生物技術領域，涉及一種病毒的快速檢測器具，具體是馬鈴薯Y 病毒的檢測試劑盒。
背景技術：
[0002]馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是侵染馬鈴薯的主要病毒之一，分布于所有的馬鈴薯種植區(qū)。馬鈴薯Y病毒侵染嚴重影響馬鈴薯產量，可減產30%左右，與其它病毒混合侵染可減產80%左右。為了控制馬鈴薯Y病毒的傳播及危害，迫切需要快速、靈敏、穩(wěn)定的檢測技術。[0003]血清學方法是檢測植物病毒的主要方法。傳統(tǒng)抗體的制備一般首先提純病毒粒子，然后免疫動物，再通過單克隆或多克隆抗體技術制備抗體；其存在較多弊端，如一些病毒在寄主體內含量較低，難以提純獲得足夠的抗原；還有一些病毒分離提純困難，不易得到純化的病毒粒子。馬鈴薯Y病毒在馬鈴薯植株內病毒含量較低，提純病毒粒子較困難，所以應用傳統(tǒng)的提純病毒粒子的方法難以制備高效價抗體，且檢測靈敏度較差。[0004]免疫學最新進展顯示，在抗原抗體的結合反應中，抗原表位(Epitope)，又稱抗原決定簇(Antigenic determinant)，是關鍵的免疫學因子，它是存在于抗原分子表面的能夠決定抗原特異性的數(shù)個氨基酸殘基組成的特殊序列及其空間結構，是蛋白質抗原性的基礎，根據(jù)抗原表位區(qū)氨基酸序列直接合成多肽，之后免疫動物，即可制備抗病毒多肽的抗體。由于其受其他與抗原表位無關的序列干擾較少，因而制備的抗體效價較高，特異性較強。因此，研制開發(fā)以抗馬鈴薯Y病毒多肽抗體為主體設計的檢測試劑盒，不僅為應用血清學方法檢測馬鈴薯Y病毒提供了一種效價較高、特異性較強的抗體，而且可以實現(xiàn)有效、靈敏、快捷、簡便的檢測馬鈴薯Y病毒，對馬鈴薯病毒病的預防和控制具有重要意義。發(fā)明內容[0005]本實用新型的目的是為了解決目前缺乏檢測馬鈴薯Y病毒的有效器具的問題，而提供一種以抗馬鈴薯Y病毒多肽抗體為主體設計的馬鈴薯Y病毒的檢測試劑盒，可快速、方便、有效地檢測出馬鈴薯待測樣品是否感染馬鈴薯Y病毒。[0006]本實用新型的目的是這樣實現(xiàn)的本設計的馬鈴薯Y病毒檢測試劑盒包括一個盒體(15)，盒體(1 內裝有密封包裝的反應板(14)、A蛋白稀釋溶液(1)、抗馬鈴薯Y病毒多肽抗體(幻、100倍濃縮的稀釋緩沖液(3)、提取緩沖液(4)、100倍濃縮的洗滌緩沖液(5)、 酶標抗體(6)、NBT/BCIP底物緩沖液(7)、顯色液A (8)、顯色液B (9)、終止液(10)、馬鈴薯Y 病毒陽性樣品對照(11)、馬鈴薯Y病毒陰性樣品對照(12)和操作說明書(13)；該試劑盒是以抗馬鈴薯Y病毒多肽抗體為主體設計的，該抗體效價高、特異性好，盒體內的液體試劑均以小瓶包裝。[0007]本實用新型的優(yōu)點與效果[0008]1、靈敏度高，可對無明顯癥狀植株中的病毒進行有效檢測。[0009]2、操作簡單，普通工作人員經過簡單培訓即可完成。[0010]3、可重復性好，檢測結果穩(wěn)定可靠。[0011]4、對儀器要求較低，僅需要普通的恒溫水浴鍋、酶標儀等。[0012]5、本實用新型的抗體制備成本低，只有用重組抗原制備抗體成本的十分之一，并且安全可靠性高于重組抗原制備的抗體。[0013]6、本實用新型中的抗馬鈴薯Y病毒多肽抗體效價高，特異性好，可與馬鈴薯Y病毒的外殼蛋白基因原核表達產物及天然的馬鈴薯Y病毒陽性植物材料產生免疫反應，為應用血清學方法檢測馬鈴薯Y病毒提供了有效、實用的抗體，具有良好的應用前景。


[0014]圖1是馬鈴薯Y病毒檢測試劑盒的外觀主視圖。[0015]圖2是馬鈴薯Y病毒檢測試劑盒橫截面剖視圖，即盒內設置的組成及位置示意圖。 圖中，A蛋白稀釋溶液(1)、抗馬鈴薯Y病毒多肽抗體(2)、100倍濃縮的稀釋緩沖液(3)、提取緩沖液⑷、100倍濃縮的洗滌緩沖液(5)、酶標抗體(6) ,NBT/BCIP底物緩沖液(7)、顯色液A (8)、顯色液B (9)、終止液(10)、馬鈴薯Y病毒陽性樣品對照(11)、馬鈴薯Y病毒陰性樣品對照(12)和操作說明書(13)、密封包裝的反應板(14)和盒體(15)。
具體實施方式
[0016]馬鈴薯Y病毒檢測試劑盒的使用方法如下[0017]1、將1號管中的A蛋白稀釋溶液加入反應板中，每孔100 μ L，37°C孵育池，倒掉孔中液體后，用蒸餾水將5號管中的洗滌液稀釋100倍，然后用其洗滌反應孔3次，每次3min。[0018]2、用蒸餾水將3號管中的稀釋緩沖液稀釋100倍，然后用其稀釋2號管中的抗馬鈴薯Y病毒多肽抗體，抗體的工作濃度為1 1000，每孔100μ ，37 孵育池，洗滌。[0019]3、待檢抗原樣品用4號管中的提取緩沖液1 5倍(W/V)研磨，SOOOrpm離心 8min,每孔加上清液100 μ L，同時分別在相應孔中加入馬鈴薯Y病毒陽性樣品對照和馬鈴薯Y病毒陰性樣品對照，每孔100yL，4°C過夜，洗滌。[0020]4、2號管中的抗馬鈴薯Y病毒多肽抗體用3號管中稀釋后的緩沖液稀釋，抗體的工作濃度為1 500，每孔100μ ，37 孵育2h，洗滌。[0021]5、6號管中酶標抗體用3號管中稀釋后的緩沖液稀釋，工作濃度1 1000，每孔 100yL，37°C孵育 2h，洗滌。[0022]6、將8、9號兩管中的顯色液均以1 20的比例加入7號管中的底物緩沖液中，配制成底物溶液，然后加入反應板中，每孔100 μ L，室溫下遮光放置30min顯色。[0023]7、加10號管中的反應終止液，每孔25μ L，目測比色后，利用酶標儀在405nm波長下測定每孔吸光值(OD405值)。[0024]8、結果判定[0025]1)試驗結果同時符合下列條件方為有效兩孔陽性對照OD4tl5值平均值彡0. 6 ；陰性對照平均值< 0. 25 ；[0026]2)臨界值的計算臨界值上限=(陽性對照孔OD4tl5均值-陰性對照OD4tl5均值)X0. 20+陰性對照OD4tl5平均值；臨界值下限=(陽性對照孔OD4tl5均值-陰性對照OD4tl54均值)X0. 15+陰性對照OD405平均值；[0027]3)結果判定被檢樣品OD4tl5平均值<臨界值下限，為馬鈴薯Y病毒陰性；被檢樣品OD4tl5平均值>臨界值上限，為馬鈴薯Y病毒陽性；介于二者之間，判為可疑，應復檢，復檢 OD405平均值>臨界值上限(復檢時)，判為馬鈴薯Y病毒陽性，反之判為陰性。[0028]備注試劑盒不使用時，應于2 8°C避光保存，開封后，應在3個月內用完。
權利要求1.馬鈴薯Y病毒的檢測試劑盒，其特征在于試劑盒包括一個盒體(15)，盒體(15)內裝有密封包裝的反應板(14)、A蛋白稀釋溶液⑴、抗體O)、100倍濃縮的稀釋緩沖液(3)、 提取緩沖液(4)、100倍濃縮的洗滌緩沖液(5)、酶標抗體(6)、NBT/BCIP底物緩沖液(7)、顯色液A (8)、顯色液B (9)、終止液(10)、馬鈴薯Y病毒陽性樣品對照(11)、馬鈴薯Y病毒陰性樣品對照(12)和操作說明書(13)，盒體內的液體試劑均以小瓶包裝。
專利摘要馬鈴薯Y病毒檢測試劑盒，它包括一個盒體，盒體內裝有密封包裝的反應板、A蛋白稀釋溶液、抗馬鈴薯Y病毒多肽抗體、100倍濃縮的稀釋緩沖液、提取緩沖液、100倍濃縮的洗滌緩沖液、酶標抗體、NBT/BCIP底物緩沖液、顯色液A、顯色液B、終止液、病毒陽性樣品對照、病毒陰性樣品對照和操作說明書，使用方法見具體實施方式
。該試劑盒是以抗馬鈴薯Y病毒多肽抗體為主體設計的，該抗體效價高、特異性好。操作說明書印制了應用A蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗方法檢測馬鈴薯Y病毒的操作步驟和判定標準。本試劑盒實現(xiàn)了對馬鈴薯Y病毒快速、簡便、靈敏的檢測，易于大規(guī)模應用。
文檔編號G01N33/569GK202305537SQ201120324778
公開日2012年7月4日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權日2011年9月1日
發(fā)明者李麗麗, 楊洪一 申請人:東北林業(yè)大學