專利名稱：一種用于阿特拉津快速檢測的直接包被elisa方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用于阿特拉津快速檢測的ELISA方法，特別涉及直接包被ELISA檢測方法，屬于檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，建立的直接包被ELISA檢測方法可以用于研制阿特拉津免疫速測試劑盒。
背景技術(shù)：
除草劑阿特拉津(Atrazine，AT)又名莠去津，全稱:2_氯_4_乙胺基_6_異丙氨基-1，3，5-三氮苯，分子式C8H14ClN5,分子量為215.69。阿特拉津純品為無色無臭晶體，性質(zhì)穩(wěn)定，熔點(diǎn)175 177°C，蒸汽壓40.00 μ Pa (20°C )，在水中溶解度為281^171,甲醇中的溶解度為l.SgL—1，氯仿中溶解度為52gL'主要適用于苗前土壤處理和苗后早期莖葉兼土壤噴霧處理，可防除一年生禾本科雜草，對某些多年生雜草也有一定的抑制作用。從1952年瑞士 Ciba-Geigy開發(fā)生產(chǎn)以來,阿特拉津在全球范圍大面積使用。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1980年全世界釋放到環(huán)境中的阿特拉津達(dá)到9X IO4噸。從1980到1990年，平均每年噴灑量達(dá)3.6 X IO4噸。阿特拉津雖然是一種低毒除草劑，但其在環(huán)境中不易被分解，半存留期長達(dá)57周。噴灑后，僅有少部分落到靶標(biāo)上，大部分進(jìn)入到土壤、河流、湖泊，對地下水和地表水造成污染。阿特拉津具有一定的生物毒性，在水中到達(dá)一定濃度時(shí)，能夠抑制水中多種藻類物質(zhì)的光合作用 ，同時(shí)導(dǎo)致魚類體內(nèi)Ca2+、Mg2+等離子濃度明顯下降，致使生理功能紊亂。阿特拉津?qū)θ诵笥幸欢ǖ亩拘晕：?，對眼睛和皮膚具有刺激作用，還能經(jīng)口、皮膚等部位進(jìn)入血液循環(huán)，使心臟、肝腎、血管等出現(xiàn)中毒癥狀。低濃度長期暴露會(huì)干擾人畜內(nèi)分泌系統(tǒng)，甚至引發(fā)癌癥。阿特拉津的嚴(yán)重危害問題已經(jīng)引起人們的高度重視。歐盟在飲用水標(biāo)準(zhǔn)中對阿特拉津的濃度做出限制，規(guī)定其濃度不得超過0.1yg L—1。美國環(huán)境保護(hù)局規(guī)定阿特拉津在水中濃度不得高于3 μ gL'我國《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB3838-2002)規(guī)定其標(biāo)準(zhǔn)限值為3 μ gL'因此必須建立快速、靈敏的檢測分析方法，以確保環(huán)境安全和人類健康。阿特拉津測定最常采用的有色譜法、色質(zhì)聯(lián)用法等。我國新修訂的《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》(GB/T5750.8-2006)采用固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法檢測阿特拉津。衛(wèi)生部編寫的《食品中的阿特拉津殘留量的測定》(GB/T16336-1996)使用氣相色譜法進(jìn)行監(jiān)測。但是這些儀器方法前處理費(fèi)事、成本高、不適合現(xiàn)場檢測，而ELISA具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，避免了經(jīng)典儀器測試手段的不足，能夠用于現(xiàn)場快速監(jiān)測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種直接包被ELISA方法用于阿特拉津的快速檢測。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:一種用于阿特拉津快速檢測的直接包被ELISA方法，具體步驟如下1.微孔板表面氨基化修飾使用3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)進(jìn)行氨基化修飾。首先在微孔內(nèi)加入HNO3和H2SO4混合液(v/v = 47/53)，每孔250 μ L，室溫反應(yīng)30min。倒去濃酸后，用去離子水洗滌兩次，每孔250 μ L。再加入5%氨丙基三乙氧基硅烷(HCl調(diào)節(jié)pH為5.5 6.9)的水溶液，每孔100 μ L，室溫反應(yīng)2h。去離子水洗滌兩次后放入62°C烘箱中反應(yīng)2h。2.羧基化阿特拉津的直接包被IOmg阿特拉津、NHS 6mg、DCC 12mg溶解于2mL10% DMF中，室溫下緩慢振搖反應(yīng)12小時(shí)，12000r/min離心IOmin后去除沉淀物以活化羧基化阿特拉津，每孔加入ΙΟΟμ L適當(dāng)濃度活化后的羧基化阿特拉津，4°C反應(yīng)過夜。PBST洗滌后，加0.2mol/L甲醛溶液37°C孵育I小時(shí)，封閉除去多余的氨基。洗滌后干燥保存。3.直接包被ELISA檢測阿特拉津方法的建立在固定好羧基化阿特 拉津的酶標(biāo)板中，加入50 μ L阿特拉津抗體和一系列濃度(0,0.025,0.12,0.6,3.2，16，80，400，2000，10000，50000ng mL-1)阿特拉津小分子，37°C孵育1.5h，PBST洗滌四次后，每孔加入100 μ L羊抗小鼠二抗，37°C反應(yīng)45分鐘。PBST洗滌6次，每孔加100 μ L底物顯色液，37°C孵育10分鐘后每孔中加50 μ L 2mol終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。本發(fā)明的有益效果:直接包被ELISA用于阿特拉津檢測具有較高的靈敏度，通過實(shí)際樣品加標(biāo)回收分析，氨基化阿特拉津直接包被ELISA表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性和精確度，該方法相比傳統(tǒng)包被完全抗原的ELISA方法相比，更簡單快速。


圖1APTES法氨基化聚苯乙烯微孔板原理圖。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試劑與材料，如無特殊說明，均可從常規(guī)試劑公司購買得到。實(shí)施例1，直接包被ELISA檢測方法的建立與評估一.方法的靈敏度1.微孔板表面氨基化和羧基化阿特拉津直接包被使用3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)進(jìn)行氨基化修飾。首先在微孔內(nèi)加入HNO3和H2SO4混合液(v/v = 47/53)，每孔250 μ L，室溫反應(yīng)30min。倒去濃酸后，用去離子水洗滌兩次，每孔250 μ L。再加入5%氨丙基三乙氧基硅烷(HCl調(diào)節(jié)pH為5.5 6.9)的水溶液，每孔100 μ L，室溫反應(yīng)2h。去離子水洗滌兩次后放入62°C烘箱中反應(yīng)2h即可完成氨基化修飾。其原理圖見圖1。微孔板氨基化處理完成后，IOmg羧基化阿特拉津、NHS 6mg、DCC 12mg溶解于2mL有機(jī)溶劑中，室溫下緩慢振搖反應(yīng)12小時(shí)，12000r/min離心IOmin后去除沉淀物以活化羧基化阿特拉津，每孔加入ΙΟΟμ L適當(dāng)濃度活化后的羧基化阿特拉津，4°C反應(yīng)過夜。PBST洗滌后，加一定濃度甲醛溶液37°C孵育I小時(shí)，封閉除去多余的氨基。洗滌后干燥保存。2.常規(guī)ELISA包被過程0.05mol Ι^ΡΗ9.6碳酸鹽緩沖液將阿特拉津-OVA偶聯(lián)物稀釋到適當(dāng)濃度加入到微孔板內(nèi)，每孔ΙΟΟμ L4°C反應(yīng)過夜。傾去包被液,滅菌水洗一次,拍干。每孔加入150yL1% 0VA，37°C反應(yīng)1.5小時(shí)，除去封閉液。3.常規(guī)ELISA與直接包被ELISA檢測阿特拉津分析方法的建立在固定好羧基化阿特拉津以及全抗原的酶標(biāo)板中，加入50 μ L阿特拉津抗體和一系列濃度(0,0.025,0.12,0.6, 3.2,16,80,400, 2000,10000, 50000ng mL-1)阿特拉津小分子，37°C孵育1.5h，PBST洗滌四次后，每孔加入100 μ L羊抗小鼠二抗，37°C反應(yīng)45分鐘。PBST洗滌6次，每孔加100 μ L底物顯色液，37°C孵育10分鐘后每孔中加50 μ L 2molL-1H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。根據(jù)下述公式求出ELISA競爭抑制率:
權(quán)利要求
1.一種阿特拉津直接包被ELISA檢測方法，具體步驟如下: (1)微孔板表面氨基化修飾:使用3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)進(jìn)行氨基化修飾；首先在微孔內(nèi)加入HNO3和H2SO4混合液(v/v = 47/53)，每孔250 μ L，室溫反應(yīng)30min ；倒去濃酸后，用去離子水洗滌兩次，每孔250 μ L ;再加入5%氨丙基三乙氧基硅烷(HCl調(diào)節(jié)pH為5.5 6.9)的水溶液，每孔100 μ L，室溫反應(yīng)2h ;去離子水洗滌兩次后放入62°C烘箱中反應(yīng)2h ； (2)羧基化阿特拉津的直接包被:10mg阿特拉津、NHS6mg、DCC 12mg溶解于2mL10%DMF中，室溫下緩慢振搖反應(yīng)12小時(shí)，12000r/min離心IOmin后去除沉淀物以活化羧基化阿特拉津，每孔加入IOOyL適當(dāng)濃度活化后的羧基化阿特拉津，4°C反應(yīng)過夜；PBST洗滌后，加入0.2mol/L甲醛溶液37°C孵育I小時(shí)，封閉除去多余的氨基；洗滌后干燥保存； (3)直接包被ELISA檢測阿特拉津方法的建立:在固定好羧基化阿特拉津以及全抗原的酶標(biāo)板中，加入50 μ L阿特拉津抗體和一系列濃度(0,0.025，0.12，0.6,3.2，16，80，400，.2000,10000, 50000ngmL-l)阿特拉津小分子，37°C孵育1.5h，PBST洗滌四次后，每孔加入.100 μ L羊抗小鼠二抗，370C反應(yīng)45分鐘；PBST洗滌6次，每孔加100 μ L底物顯色液，37°C孵育10分鐘后每孔中加50 μ L 2molL_1 H2SO4終止反應(yīng),酶標(biāo)儀進(jìn)行讀數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種阿特拉津的快速檢測方法，屬于檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明首先通過APTES法對聚苯乙烯微孔板表面進(jìn)行氨基化修飾，利用羧基化阿特拉津的羧基與微孔板表面的氨基反應(yīng)將羧基化阿特拉津直接包被到微孔板表面?；诎被⒖装褰⒘酥苯影籈LISA用于阿特拉津的檢測，該方法減少了封閉步驟并且省去了小分子半抗原與蛋白的偶聯(lián)復(fù)雜過程，具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性，因此該方法更加適用于阿特拉津殘留的分析與監(jiān)測。
文檔編號(hào)G01N33/543GK103175956SQ201110440639
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者高志賢, 白家磊, 寧保安, 彭媛, 柳明, 孫思明 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所