專利名稱：一種用于免疫分析研究的集成化微流控芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析技術(shù)，具體涉及包含一種用于免疫分析研究的集成化微流控芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫分析方法具有極高的選擇性和靈敏度，可廣泛用于臨床診斷、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物研究、生物學(xué)研究、環(huán)境分析等領(lǐng)域。常規(guī)的免疫分析分為均相免疫分析與非均相免疫分析，而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是最常見的應(yīng)用最廣泛的非均相免疫分析，并且都是在96微孔板中進(jìn)行。作通常包含包被抗體、抗原，反復(fù)洗滌、甩干，封閉、標(biāo)記抗體，孵育反應(yīng)等多項(xiàng)操作。傳統(tǒng)的ELISA步驟繁瑣，且多為手工操作，需要消耗大量昂貴的免疫試劑，分析時(shí)間較長，通常需要數(shù)小時(shí)。微流控芯片，指的是把化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能。1990年后發(fā)展起來的微流控分析技術(shù)在微米級結(jié)構(gòu)中操控納升至皮升體積流體，可執(zhí)行樣品預(yù)處理、分離與檢測等步驟，具有體積小、t匕表面積大、反應(yīng)時(shí)間短、分析速度快、試劑和樣品用量少、易集成化和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。因此，將微流控分析技術(shù)與免疫分析結(jié)合，可在一定程度上克服傳統(tǒng)免疫分析的缺點(diǎn)，近幾年來已引起研究者的廣泛關(guān)注?；谖⒘骺匦酒拿庖叻治龃蟠蟾纳屏顺Ｒ?guī)免疫分析的性能，具體包括(I)易于集成化，便攜化；(2)操作簡便，自動(dòng)化程度高；(3)免疫反應(yīng)在微通道中進(jìn)行，由于其體積小，比表面積大，縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了分析效率；(4)大大節(jié)約了昂貴的免疫試劑用量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于免疫分析研究的集成化微流控芯片及其應(yīng)用。本發(fā)明集成了樣品溶液的分配、濃度梯度的生成、抗體和抗原的包被封閉、酶的吸附固定、沖洗、孵育反應(yīng)等單元操作，通過連接微量注射泵自動(dòng)運(yùn)行，完成操作后可置于普通酶標(biāo)儀上檢測讀取數(shù)據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種用于免疫分析研究的集成化微流控芯片，芯片主要由三個(gè)功能單元構(gòu)成，其上設(shè)置輸入輸出小孔，在其上裝置可拆卸的連接接頭，通過細(xì)管線與微量注射泵和廢液回收池相接。整塊集成化微流控芯片的尺寸與標(biāo)準(zhǔn)的多孔板相同(集成化微流控芯片的結(jié)構(gòu)見圖1，其功能模塊如圖2所示)。第一個(gè)功能單元為迂回的折線通道組合，這種迂回的折線通道從左至右(或從右至左)逐層分支增加一個(gè)，交錯(cuò)排列，作為濃度梯度生成單元；在其最左端(或最右端)設(shè)有2個(gè)入口，試劑、酶和藥物等由此入口進(jìn)入芯片；迂回的折線通道增擴(kuò)至6個(gè)出口，每條出口與第二功能單元中的逐層對稱增加分支通道組相連。
第二個(gè)功能單元由6個(gè)逐層對稱增加分支通道組成，作為等量分配單元，每個(gè)通道組的上游與第一功能單元的一條分支相連，下游與第三功能單元中的4個(gè)反應(yīng)室相通。第三個(gè)功能單元由48個(gè)直徑為5. 8mm,深100 U的微孔矩陣構(gòu)成，作為免疫分析之需的抗體、抗原和酶的吸附固定場所和分析檢測窗口。該微孔矩陣的排列與傳統(tǒng)的多孔板一致，這樣可應(yīng)用在標(biāo)準(zhǔn)的酶標(biāo)儀上進(jìn)行分析數(shù)據(jù)的測定和采集。所述集成化微流控芯片的應(yīng)用過程如下所有的試劑、抗體、抗原、酶、底物、藥物及洗滌液等依次由注射泵經(jīng)微流控芯片上的輸入口 Cl，C2恒速、定量地注入芯片，當(dāng)需要一系列不同濃度的樣品溶液時(shí)，只須配制兩個(gè)最高和最低的樣品溶液經(jīng)Cl，C2注入，在流經(jīng)第一功能單元的逐層增加分支的蛇形通道時(shí)，兩個(gè)不同濃度的樣品溶液經(jīng)歷了不斷地定量分配、混合；再分配、再混合，最后生成所需的不同濃度的樣品溶液輸出給下一個(gè)功能單元。第一功能單元的每條分支流向第二功能單元中的一個(gè)等量分配單元組，將該濃度的樣品溶液等量地分配給第三功能單元中同一排的
4個(gè)反應(yīng)室。從輸入口 C1，C2注入的兩個(gè)不同濃度的樣品溶液流經(jīng)第一功能單元和第二功能單元后，在第三功能單元中同時(shí)自動(dòng)地形成48個(gè)樣品溶液矩陣。第三功能單元中的反應(yīng)室提供了較大的有效面積，特別是比表面積，是傳統(tǒng)多孔板的約23倍。流入反應(yīng)室的抗體被吸附滯留，隨后抗原、酶依次流入反應(yīng)室，與其上的抗體相互作用，將酶固定。完成酶的固定化后，底物或底物與藥物的混合溶液被注入反應(yīng)室，再孵育一定時(shí)間，待酶催化的反應(yīng)完成或達(dá)到平衡后，拆除芯片上的連接接頭及管線。將芯片裝入標(biāo)準(zhǔn)的酶標(biāo)儀，檢測各反應(yīng)室的紫外-可見光吸光度或熒光發(fā)射強(qiáng)度，提供分析數(shù)據(jù)。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明只需向第一個(gè)功能單元的兩個(gè)輸入口分別注入所需樣品的最低濃度和最高濃度的溶液就可以在第一個(gè)單元的出口處生成6個(gè)不同濃度的樣品溶液并分別自動(dòng)進(jìn)入第二個(gè)功能單元的各組的一個(gè)等量分配通道。2.上述所生成的每一種濃度的樣品溶液經(jīng)過第二個(gè)功能單元中的各組的等量分配通道后，在第三功能單元中同時(shí)自動(dòng)地形成了 48個(gè)樣品溶液矩陣。3.第三功能單元中的反應(yīng)室的容積非常小，卻提供了較大的有效面積，特別是比表面積，是傳統(tǒng)多孔板的約23倍。能有效的提高抗體、抗原、酶的吸附和固定，由于所有的溶液都能流動(dòng)可控，所以換液、洗滌等操作方便快速。用于本發(fā)明的集成化微流控芯片進(jìn)行免疫分析，能顯著降低了昂貴的免疫試劑的消耗，縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了分析效率。4.本發(fā)明的集成化微流控芯片所設(shè)計(jì)的微孔矩陣的排列與傳統(tǒng)的多孔板一致，可應(yīng)用在標(biāo)準(zhǔn)的酶標(biāo)儀上進(jìn)行分析數(shù)據(jù)的采集。與傳統(tǒng)的多孔板技術(shù)相比，本發(fā)明省去了配制不同濃度樣品溶液繁冗操作，同時(shí)在檢測方法上又與傳統(tǒng)的多孔板技術(shù)兼容，無需配備專用設(shè)備。


圖1為集成化免疫分析研究微流控芯片結(jié)構(gòu)示意圖，圖中Cl和C2為試劑、抗體、抗原、酶、底物、藥物及洗滌液等的輸入口，當(dāng)需要生成不同濃度的樣品溶液時(shí)，Cl和C2所輸入的分別是最低和最高濃度的溶液。圖2為免疫分析研究微流控芯片功能模塊示意圖，每個(gè)功能單元用虛線框包圍，I部分為第一功能單元，即濃度梯度生成單元；11部分為第二功能單元，即等量分配單元；III部分為第三功能單元，即反應(yīng)室。圖3為聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制成的集成化微流控芯片實(shí)物圖，其實(shí)物中集成了兩個(gè)微流控芯片系統(tǒng)，可同時(shí)進(jìn)行兩個(gè)試驗(yàn)，也可裁切成兩個(gè)獨(dú)立的芯片系統(tǒng)。圖中硬幣為芯片實(shí)際尺寸參照。圖4為實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)藥物濃度從0. OOOlmM到0.1OmM時(shí)，熒光強(qiáng)度不斷增加并且呈良好的線性關(guān)系，但當(dāng)藥物濃度大于0.1mM時(shí)熒光強(qiáng)度基本不再增強(qiáng)。造成這種結(jié)果的可能原因是當(dāng)酶的濃度一定，藥物的起始濃度較低時(shí)，酶促反應(yīng)速度與藥物濃度成正比，即隨藥物濃度的增加而增加。當(dāng)所有的酶與藥物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后，即使再增加藥物濃度，產(chǎn)物濃度也不會增加，因此選用藥物濃度為0. 10mM。圖5為實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，藥物進(jìn)入芯片后140秒后檢測到的熒光強(qiáng)度不再明顯增強(qiáng)，藥物的作用已基本達(dá)到平衡。圖6為實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，抑制劑KH2PO4對ALP酶的相對抑制率隨著抑制劑濃度的增加而逐漸增加，由實(shí)驗(yàn)測得其IC5tl為0. 47mM。
具體實(shí)施例方式一種用于免疫分析研究的集成化微流控芯片，芯片主要由三個(gè)功能單元構(gòu)成，其上設(shè)置輸入輸出小孔，在其上裝置可拆卸的連接街頭，通過細(xì)管線與微量注射泵和廢液回收池相接。整塊集成化微流控芯片的尺寸與標(biāo)準(zhǔn)的多孔板相同。第一個(gè)功能單元為蛇形通道組合，從左至右(或從右至左)逐層增加分支的濃度梯度生成單元，在其最外端設(shè)有試劑、酶和藥物等的入口，每個(gè)分支的通道為迂回的折線形。第二個(gè)功能單元由6個(gè)逐層增加的對稱分支通道組成，作為等量分配單元，每個(gè)通道組的上游與第一功能單元的一條分支相連，下游與第三功能單元中的4個(gè)反應(yīng)室相通。第三個(gè)功能單元由48個(gè)直徑為5. 8mm，深I(lǐng)OOy的微孔矩陣構(gòu)成，該微孔矩陣的排列與傳統(tǒng)的多孔板一致，這樣可應(yīng)用在標(biāo)準(zhǔn)的酶標(biāo)儀上進(jìn)行分析數(shù)據(jù)的采集。具體操作時(shí)，抗體、抗原、酶、底物、藥物及洗滌液等依次由注射泵經(jīng)微流控芯片上的輸入口 Cl，C2恒速、定量地注入芯片，需要6個(gè)不同濃度的樣品溶液時(shí)，配制兩個(gè)最高和最低的樣品溶液經(jīng)Cl，C2注入，在流經(jīng)第一功能單元的逐層增加分支的蛇形通道時(shí)，兩個(gè)不同濃度的樣品溶液經(jīng)歷了不斷地定量分配、混合；再分配、再混合，最后生成所需的6個(gè)不同濃度的樣品溶液輸出給下一個(gè)功能單元。第一功能單元的每條分支流向第二功能單元中的一個(gè)等量分配單元組，將該濃度的樣品溶液等量地分配給第三功能單元中同一排的4個(gè)反應(yīng)室。從輸入口 C1，C2注入的兩個(gè)不同濃度的樣品溶液流經(jīng)第一功能單元和第二功能單元后，在第三功能單元中同時(shí)自動(dòng)地形成48個(gè)樣品溶液矩陣。第三功能單元中的反應(yīng)室提供了較大的有效面積，特別是比表面積，是傳統(tǒng)多孔板的約23倍。流入反應(yīng)室的抗體被吸附滯留，隨后抗原、酶依次流入反應(yīng)室，與其上的抗體相互作用，將酶固定。完成酶的固定化后，底物或底物與藥物的混合溶液被注入反應(yīng)室，再孵育一定時(shí)間，待酶催化的反應(yīng)完成或達(dá)到平衡后，拆除芯片上的連接接頭及管線。將芯片裝入標(biāo)準(zhǔn)的酶標(biāo)儀，檢測各反應(yīng)室的熒光發(fā)射強(qiáng)度，提供分析數(shù)據(jù)。
實(shí)施例1微流控芯片進(jìn)行藥物最適濃度的研究應(yīng)用。圖3所示的芯片經(jīng)過BSA-戊二醛-蛋白A的表面修飾后，在pH9. 4，溫度37°C，藥物溶液流速為10iil/min，其他液流速度為50 u 1/min的體系中，將5 u g/ml的抗體通入PDMS通道內(nèi)靜置60min，然后通入TBS緩沖液沖掉未被固定的抗體。將5 ii g/ml的抗原通入通道內(nèi)并靜置20min，然后通入TBS緩沖液沖掉未被固定的抗原。將5 ii g/ml的二抗通入通道內(nèi)并靜置20min，然后通入TBS緩沖液沖掉未被固定的二抗。通入藥物濃度為0. 0001mmol/l的4-MUP反應(yīng)3min,然后置于酶標(biāo)儀下檢測熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為365nm與448nm)。重復(fù)以上操作，分別改變藥物 4-MUP 的濃度為 0. 001,0. 01，0. 02，0. 04，0. 06，0. 08，0. 10，0. 15，0. 20mmol/l 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，當(dāng)藥物濃度從0. OOOlmM到0.1OmM時(shí)，熒光強(qiáng)度不斷增加并且呈良好的線性關(guān)系，但當(dāng)藥物濃度大于0.1mM時(shí)熒光強(qiáng)度基本不再增強(qiáng)。造成這種結(jié)果的可能原因是當(dāng)酶的濃度一定，藥物的起始濃度較低時(shí)，酶促反應(yīng)速度與藥物濃度成正比，即隨藥物濃度的增加而增加。當(dāng)所有的酶與藥物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后，即使再增加藥物濃度，產(chǎn)物濃度也不會增加，因此選用藥物濃度為0. 10mM。實(shí)施例2微流控芯片進(jìn)行藥物作用時(shí)間的研究應(yīng)用。圖3所示的芯片經(jīng)過BSA-戊二醛-蛋白A的表面修飾后，在pH9. 4，在溫度37°C，藥物溶液流速為10iil/min，其他液流速度為50 u 1/min的體系中，將5 u g/ml的抗體通入PDMS通道內(nèi)靜置60min，然后通入TBS緩沖液沖掉未被固定的抗體。將5 ii g/ml的抗原通入通道內(nèi)并靜置20min，然后通入TBS緩沖液沖掉未被固定的抗原。將5 ii g/ml的二抗通入通道內(nèi)并靜置20min，然后通入TBS緩沖液沖掉未被固定的二抗。通入藥物濃度為0. 10mmol/l的4-MUP后置于酶標(biāo)儀下檢測熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為365nm與448nm)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。實(shí)施例3微流控芯片進(jìn)行酶抑制劑抑制率的研究應(yīng)用。圖3所示的芯片經(jīng)過BSA-戊二醛-蛋白A的表面修飾后，在pH9. 4，在溫度37°C，藥物溶液流速為10 u 1/min,其他液流速度為50 u 1/min的體系中，將5 y g/ml的抗體通入PDMS通道內(nèi)靜置60min，然后通入TBS緩沖液沖掉未被固定的抗體。將5 ii g/ml的抗原通入通道內(nèi)并靜置20min，然后通入TBS緩沖液沖掉未被固定的抗原。將5 ii g/ml的二抗通入通道內(nèi)并靜置20min，然后通入TBS緩沖液沖掉未被固定的二抗。芯片一個(gè)入口通入0.1OmM的4-MUP和抑制劑KH2PO4的緩沖液，另一入口通入0.1OmM的4-MUP和ImM的KH2PO4反應(yīng)3min，然后置于酶標(biāo)儀下檢測熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為365nm與448nm)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，抑制劑KH2PO4對ALP的相對抑制率隨著抑制劑濃度的增加而逐漸增加，由實(shí)驗(yàn)可得50%抑制濃度(IC5tl)為0. 47mM0
權(quán)利要求
1.一種用于免疫分析研究的集成化微流控芯片及其應(yīng)用，其特征在于芯片主要由三個(gè)功能單元構(gòu)成， 第一個(gè)功能單元為迂回的折線通道組合，這種迂回的折線通道從左至右(或從右至左)逐層分支增加一個(gè)，交錯(cuò)排列，作為濃度梯度生成單元； 第二個(gè)功能單元由逐層對稱增加分支通道組成，作為等量分配單元，每個(gè)通道組的上游與第一功能單元的一條分支相連，下游與第三功能單元中的反應(yīng)室相通； 第三個(gè)功能單元由直徑為5. 8mm，深100的微孔矩陣構(gòu)成，容積非常小，卻提供了較大的有效面積，作為免疫分析之需的抗體、抗原和酶的吸附固定場所和分析檢測窗口。
2.權(quán)利要求1所述用于免疫分析研究的集成化微流控芯片，其特征在于第一單元中其最左端(或最右端)設(shè)有2個(gè)入口，試劑、酶和藥物等由此入口進(jìn)入芯片，迂回折線通道增擴(kuò)至6個(gè)出口，每條出口與第二單元中的逐層對稱增加分支通道組相連； 第二單元中每組逐層對稱增加分支通道增擴(kuò)4個(gè)出口分別與第三單元中的4個(gè)反應(yīng)室相通，該單元中包含6組共24條出口 ； 第三單元中共包含24個(gè)微孔矩陣，排列與傳統(tǒng)的多孔板一致，整塊集成化微流控芯片的尺寸與標(biāo)準(zhǔn)的酶標(biāo)儀兼容。
3.一種用于免疫分析研究的集成化微流控芯片的應(yīng)用，其特征在于所有的試劑、抗體、抗原、酶、底物、藥物及洗滌液等依次由注射泵經(jīng)微流控芯片上的輸入口注入芯片，只須配制兩個(gè)最高和最低濃度的樣品溶液經(jīng)輸入口注入，可生成所需的不同濃度的樣品溶液輸出給下一個(gè)功能單元； 將這些不同濃度的樣品溶液再等量地分配給第三功能單元中同一排的反應(yīng)室；6組等量分配通道總共在第三單元中同時(shí)自動(dòng)地形成24個(gè)樣品溶液矩陣； 流入反應(yīng)室的抗體被吸附滯留，隨后抗原、酶依次流入反應(yīng)室，與其上的抗體相互作用，將酶固定，完成酶的固定化后，底物與藥物的混合溶液被注入反應(yīng)室，再孵育一定時(shí)間，待酶催化的反應(yīng)完成或達(dá)到平衡后，拆除芯片上的連接接頭及管線； 將芯片裝入標(biāo)準(zhǔn)的酶標(biāo)儀上，檢測各反應(yīng)室的紫外-可見光吸光度或熒光發(fā)射強(qiáng)度，采集分析數(shù)據(jù)。
全文摘要
一種用于免疫分析研究的集成化微流控芯片，芯片主要由濃度梯度生成單元、等量分配單元和直徑為5.8mm，深100μ的微孔反應(yīng)室矩陣構(gòu)成，容積小而比表面積大；該微孔矩陣的排列與傳統(tǒng)的多孔板一致，可應(yīng)用在標(biāo)準(zhǔn)的酶標(biāo)儀上進(jìn)行分析數(shù)據(jù)的檢測和采集。本發(fā)明創(chuàng)新性地將免疫分析操作中抗體、抗原、酶的吸附和固定；樣品不同濃度溶液的配制；換液、洗滌等操作全部集成在一塊芯片上按流程自動(dòng)化完成，能顯著降低試劑的消耗，縮短分析時(shí)間，提高效率。與傳統(tǒng)的多孔板技術(shù)相比，本發(fā)明省去了配制樣品溶液、洗滌等繁冗的手工操作，在檢測方法上又與標(biāo)準(zhǔn)的酶標(biāo)儀兼容。
文檔編號G01N21/64GK103033608SQ201110305409
公開日2013年4月10日 申請日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者成志毅, 侯鳳華 申請人:中山大學(xué)