專利名稱：葉黃素制品中葉黃素順反異構(gòu)體的hplc-ms檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葉黃素制品中葉黃素順反異構(gòu)體的HPLC-MS檢測(cè)方法，屬于液相色譜 分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葉黃素，是一種含氧類胡蘿卜素，廣泛存在于蔬菜、花卉、水果與某些藻類生物中， 尤其在萬壽菊花中含量最高。因?yàn)槿~黃素能大量吸收近于紫外光的藍(lán)光，因此可過濾損害 光感受器和視網(wǎng)膜色素上皮的藍(lán)光，及時(shí)補(bǔ)充葉黃素可以防治老年黃斑變性病(AMD)引起 的視力下降與失明。另外葉黃素還具有抗氧化，抗癌、抗誘變、延緩動(dòng)脈硬化等生理功能，是 一種天然營養(yǎng)健康的功能性色素。
目前商品葉黃素主要是從萬壽菊油樹脂中提取分離出的。但是葉黃素不溶于水， 在油中也是微溶的，另外葉黃素本身又極易氧化，而且，作為類胡蘿卜中一種，與其它種類 胡蘿卜素一樣，葉黃素晶體的生物利用率很低，這些特性決定了葉黃素晶體的應(yīng)用受到很 大的限制。在實(shí)際應(yīng)用中，往往根據(jù)不同的食品特性或應(yīng)用要求，將葉黃素制成不同的產(chǎn) 品，如油懸浮液、水分散性干粉等，提高葉黃素的穩(wěn)定性和生物利用率，以滿足食品不同的 加工需要。然而在葉黃素產(chǎn)品的制備過程中，反式葉黃素會(huì)不可避免地受到光照、加熱和空 氣氧化等作用的影響，并因此產(chǎn)生很多順式異構(gòu)體和副產(chǎn)物。葉黃素全反式的化學(xué)構(gòu)象最 為穩(wěn)定，在生物體內(nèi)反式構(gòu)象的活性也較順式構(gòu)象高很多。因此，葉黃素順反異構(gòu)體準(zhǔn)確高 效的定性、定量分析體系對(duì)葉黃素制品的生產(chǎn)和應(yīng)用具有重要的意義。
HPLC方法由于其靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為葉黃素定性定量檢測(cè)的主要方法。色 譜柱的類型對(duì)于分離結(jié)果的影響很大，迄今為止，用于類胡蘿卜素HPLC分離檢測(cè)的色譜柱 固定相主要有硅膠、C18及C3tl等，其中，正相硅膠柱不能從其他類胡蘿卜素中徹底分離葉黃 素；反向C18色譜柱在類胡蘿卜素的色譜分離中應(yīng)用廣泛，但不能徹底分離類胡蘿卜素及其 各種順式異構(gòu)體；C3(I固定相是20世紀(jì)90年代研發(fā)的一種反相吸附固定相，在類胡蘿卜素 色譜分離中有良好性能，又稱為類胡蘿卜素柱。張艷等報(bào)道了一種YMC-C3tl色譜柱分離葉黃 素及其異構(gòu)體的方法，使用流動(dòng)相為甲基叔丁基醚、甲醇和乙腈，葉黃素異構(gòu)體分離效果不 是很好，并且乙腈和甲基叔丁基醚價(jià)格較貴。因此，建立一種快速經(jīng)濟(jì)有效的定性定量分析 葉黃素順反異構(gòu)體的方法尤為重要。發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的在于提供葉黃素制品中葉黃素順反異構(gòu)體的HPLC-MS檢測(cè)方法，顯 著分離葉黃素5種順反異構(gòu)體。
技術(shù)方案
本發(fā)明將全反式葉黃素光碘異構(gòu)化反應(yīng)制得葉黃素順式異構(gòu)體，經(jīng)HPLC分離，應(yīng) 用液質(zhì)聯(lián)用、光譜對(duì)其進(jìn)行定性分析，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定了精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率，可以對(duì)葉黃素制品中的異構(gòu)體含量進(jìn)行定量分析。
包括以下步驟
(I)葉黃素異構(gòu)體的制備
葉黃素異構(gòu)體由全反式葉黃素光碘異構(gòu)化反應(yīng)制得。將Img全反式葉黃素標(biāo)品溶解于幾滴甲苯溶液中，加入IOmL碘-己正烷溶液(c = 2yg/mL)，最終碘含量為葉黃素質(zhì)量的1-2 %。將混合溶液放在4盞40w日光燈60cm處照射30min，然后用硫代硫酸鈉溶液(lmol/L)洗滌2次，去除多余的碘。有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干(T < 30°C )，復(fù)溶于甲醇后定容至25mL容量瓶中。
(2)色譜及質(zhì)譜條件
C18-HPLC 分析條件色譜柱 C18 (4. 6mmX 150mm, 5 μ m),流動(dòng)相甲醇 / 水=98/2,時(shí)間45min,流速1. OmL/min,柱溫25°C,進(jìn)樣量20 μ I，檢測(cè)波長450nm。
C3tl-HPLC 分析條件色譜柱為 YMC Carotenoid C3tl (4. 6mmX 250mm, 5 μ m),流動(dòng)相 甲醇/水=98/2，時(shí)間70min，流速1. OmL/min, DAD檢測(cè)器，柱溫25°C，進(jìn)樣量20 μ 1，檢測(cè)波長450nm。
LC-MS色譜條件與上述色譜條件相同，色譜柱流出組分進(jìn)入質(zhì)譜儀的流速為 10yL/min，正離子質(zhì)譜(APCI+/MS)，掃描范圍m/z 200-800，毛細(xì)管溫度150°C，氣化溫度 450°C，毛細(xì)管電壓10V，干燥氣體流速8mL/min。
(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取Img反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容于25mL容量瓶中，混勻，制成濃度為40 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。再分別取O. 5mL、1. OmL,1. 5mL、2. OmL,2. 5mL標(biāo)準(zhǔn)液置于IOmL 容量瓶中，混勻，制成2 μ g/mL>4 μ g/mL>6 μ g/mL>8 μ g/mL、10 μ g/mL的反式葉黃素系列標(biāo)準(zhǔn)液。
(4)精密度試驗(yàn)
吸取葉黃素含量分別為2. 5,4. 8,8. O μ g/mL的供試樣品溶液20 μ L，按照上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算葉黃素峰面積積分值的RSD值。
(5)穩(wěn)定性試驗(yàn)
取供試樣品溶液，分別于_18°C保存0，12，24，48h后測(cè)定，計(jì)算葉黃素峰面積積分值的RSD值。
(5)加標(biāo)回收率試驗(yàn)
分別精密稱取3份不同含量的供試樣品溶液，添加適量的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品含葉黃素在4 10 μ g/mL之間，進(jìn)行液相色譜分析，每份樣液重復(fù)進(jìn)樣三次，計(jì)算加標(biāo)回收率。
(6)樣品的制備
稱取一定量的葉黃素制品于錐形瓶中，加入30mL提取劑(己烷-丙酮-乙醇-甲苯)，塞上塞子并充分旋轉(zhuǎn)振搖。用移液管加入2mL 40% KOH甲醇溶液到錐形瓶中，旋轉(zhuǎn)振搖lmin，密封一夜(12h)，轉(zhuǎn)移樣液至分液漏斗中，用10%硫酸鈉洗滌，洗多次去除堿液。取上清液，減壓濃縮至干，用甲醇定容至10mL，將樣液經(jīng)O. 45 μ m微孔膜過濾后備用。
本發(fā)明中步驟(I)中所述全反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Fluka公司，純度為97%。
本發(fā)明中步驟(6)中所述提取劑己烷/丙酮/乙醇/甲苯比例為10/7/6/7。
以上試驗(yàn)過程均注意避光。
有益效果
1.本發(fā)明將異構(gòu)化樣品用C3tl-HPLC分離，至少分離得到七個(gè)峰，且分離效果良好， 如圖4。這是由于C3tl烷基的鏈長與類胡蘿卜素分子的長度接近，因而二者的相互作用得到了增強(qiáng)。另外，C30固定相較長的烷基鏈增加其疏水性，導(dǎo)致非極性類胡蘿卜素的保留時(shí)間延長，柱效提高，近年來常應(yīng)用于分離類胡蘿卜素幾何異構(gòu)體。甲醇相對(duì)于其他色譜洗脫液價(jià)格便宜，在流動(dòng)相中加入少量的水可以使待測(cè)組分晚些出峰。碘是一個(gè)活躍的催化劑，可以作用于分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)使其發(fā)生彎曲，改變構(gòu)型，因此常選用碘誘導(dǎo)全反式類胡蘿卜素生成順式異構(gòu)體。然而將葉黃素標(biāo)品光-碘異構(gòu)化后經(jīng)C18-HPLC分離，得到峰的分離效果不好，如圖2所示。·
2.本發(fā)明對(duì)異構(gòu)化樣品進(jìn)行了正離子模式的LC-APC1-MS和電子吸收光譜分析， 以此確定圖4中各個(gè)峰的歸屬。LC-APC1-MS檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，其中包括HPLC分離圖、 總離子流量圖和葉黃素母離子[M+H+] (m/z 569.1)的提取圖。同時(shí)對(duì)響應(yīng)較強(qiáng)的幾個(gè)峰進(jìn)行了質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示峰1、2、4、5的質(zhì)譜圖(圖7)均與峰3 (全反式葉黃素)的質(zhì)譜圖(圖 6)類似，皆具備[M+H+] (m/z 569)、[M+H+-H20] (m/z 551)、[M+H+_2H20] (m/z 533)、 [M+H+-6CH3] (m/z 476)和[M+H+-C9H150] (m/z 431)，為葉黃素共軛雙烯鏈加上一個(gè)H+失去一個(gè)紫羅蘭酮環(huán))離子片段，可以判斷出以上皆為葉黃素異構(gòu)體。
但根據(jù)質(zhì)譜圖不能具體說明是哪種葉黃素順式結(jié)構(gòu)。反式葉黃素及其異構(gòu)體的電子吸收光譜不同，順式異構(gòu)體的主吸收峰與反式異構(gòu)體的主吸收峰相比，其電子吸收光譜發(fā)生“紫移”，同時(shí)在330 340nm處會(huì)出現(xiàn)一個(gè)吸收峰，這些光譜特征可作為判斷葉黃素異構(gòu)體的重要依據(jù)。由表I可以看出13-順式和13’ -順式葉黃素與9-順式、9’ -順式葉黃素光譜最大吸收峰與全反式葉黃素相比分別發(fā)生了 6 Snm和4nm左右的“紫移”。經(jīng)計(jì)算得到的Q值，與文獻(xiàn)值接近。13-順式通常比13’ -順式更早出峰，這可能是由于13-順式的極性相對(duì)稍強(qiáng)些，9-順式和9’-順式呈同樣規(guī)律。光譜精細(xì)結(jié)構(gòu)[100III/II]，為近紅團(tuán)的峰的高度III與中間吸收峰(通常為最大吸收峰入_)高度II的比值。全反式葉黃素的精細(xì)結(jié)構(gòu)[100ΙΙΙ/ΙΙ]，經(jīng)測(cè)量為63，與乙醇溶液中60相近。由Q值和精細(xì)結(jié)構(gòu)可以看出流動(dòng)相的差異并未引起葉黃素異構(gòu)體光譜特征發(fā)生太大的變化。
表I葉黃素順反異構(gòu)體的鑒定
權(quán)利要求
1.葉黃素制品中葉黃素順反異構(gòu)體的HPLC-MS檢測(cè)方法，其特征在于將全反式葉黃素光碘異構(gòu)化反應(yīng)制得葉黃素順式異構(gòu)體，經(jīng)HPLC分離，應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-DAD-MS)、光譜對(duì)其進(jìn)行定性分析，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定了精密度、穩(wěn)定性和加標(biāo)回收率，可以對(duì)葉黃素制品中的異構(gòu)體含量進(jìn)行定量分析。
2.權(quán)利要求1所述葉黃素制品中葉黃素順反異構(gòu)體的HPLC-MS檢測(cè)方法，其特征在于HPLC 條件為色譜柱 YMC Carotenoid C3tl (4. 6_X 250mm, 5 μ m),流動(dòng)相甲醇 / 水=98/2,時(shí)間70min，流速1. OmL/min, DAD檢測(cè)器，柱溫25°C，進(jìn)樣量20 μ 1，檢測(cè)波長450nm。
3.權(quán)利要求1所述葉黃素制品中葉黃素順反異構(gòu)體的HPLC-MS檢測(cè)方法，其特征在于LC-MS色譜條件與上述色譜條件相同，色譜柱流出組分進(jìn)入質(zhì)譜儀的流速為10 μ L/min,正離子質(zhì)譜(APCI+/MS)，掃描范圍m/z 200-800，毛細(xì)管溫度150°C，氣化溫度450°C，毛細(xì)管電壓10V,干燥氣體流速8mL/min。
4.權(quán)利要求1所述葉黃素制品中葉黃素順反異構(gòu)體的HPLC-MS檢測(cè)方法，其特征在于葉黃素順反異構(gòu)體質(zhì)譜圖皆具備[M+H+] (m/z 569)、[M+H+-H20] (m/z 551)、[M+H+_2H20] (m/z533)、[M+H+-6CH3] (m/z 476)和[M+H+-C9H150] (m/z 431)，為葉黃素共軛雙烯鏈加上一個(gè) H+失去一個(gè)紫羅蘭酮環(huán))離子片段。
5.權(quán)利要求1所述葉黃素制品中葉黃素順反異構(gòu)體的HPLC-MS檢測(cè)方法，其特征是，在上述HPLC條件下，有5種葉黃素異構(gòu)體中能夠得到顯著分離，并根據(jù)質(zhì)譜和光譜信息這幾種物質(zhì)分別確定為全反式、9_順式、9’-順式、13-順式和13’-順式葉黃素。全反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = 171. 78X-59. 24 (R2 = O. 9992)，方法重現(xiàn)性好、回收率高。
6.權(quán)利要求1所述葉黃素制品中葉黃素順反異構(gòu)體的HPLC-MS檢測(cè)方法，其特征在于葉黃素制品為葉黃素油懸浮液、乳液、水分散性干粉等以葉黃素為主要原料的加工產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明屬分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及葉黃素制品中葉黃素順反異構(gòu)體的HPLC-MS檢測(cè)方法。將全反式葉黃素光碘異構(gòu)化反應(yīng)制得葉黃素順式異構(gòu)體，采用YMC Carotenoid C30色譜柱，以甲醇/水＝98/2為流動(dòng)相，時(shí)間70min，流速1.0mL/min，DAD檢測(cè)器，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μl，檢測(cè)波長450nm，顯著分離葉黃素異構(gòu)體，正離子質(zhì)譜(APCI+/MS)，色譜柱流出組分進(jìn)入質(zhì)譜儀的流速為10μL/min，掃描范圍m/z 200-800，毛細(xì)管溫度150℃，氣化溫度450℃，毛細(xì)管電壓10V，干燥氣體流速8mL/min。根據(jù)質(zhì)譜和光譜信息將葉黃素異構(gòu)體分別確定為全反式、9-順式、9’-順式、13-順式和13’-順式葉黃素。該分析方法快速有效、重現(xiàn)性好、回收率高，可以對(duì)葉黃素制品中的葉黃素順反異構(gòu)體含量進(jìn)行定量分析。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103018351SQ20111028635
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者李大婧, 黃占華, 王闖, 李德海 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué)