專利名稱：一種軟紫草和硬紫草的液相-圓二色譜(lc-cd)鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及軟紫草和硬紫草的鑒定技術(shù)，特別的涉及液相-圓二色譜(LC-CD)準(zhǔn)確地鑒定軟紫草和硬紫草藥材和提取物(包括含有紫草的復(fù)方中藥、萘醌類成分單體)的方法。
背景技術(shù)：
紫草在我國(guó)有悠久的藥用歷史，其味甘咸，性寒，歸心包絡(luò)肝經(jīng)，有涼血、活血、清熱、解毒等功效，中醫(yī)臨床主要用于濕性斑疹、紫癜、血尿、淋濁和血痢、熱結(jié)便秘、燒傷、濕疫、丹毒、癰瘍等病。紫草(RadixArnrbiae, Radix Lithospermi)為紫草科(Boraginaceae)植物新疆紫草 Arnebiaeuchroma (Royle) Johnst.、紫草 Lithospermum erythrorhizon Sieb.etZucc.或內(nèi)蒙紫草Arnebiaguttata Bunge的干燥根[1]。其中新疆紫草又名軟紫草,紫草或內(nèi)蒙紫草又稱硬紫草，軟紫草和硬紫草是藥用紫草的主要來源。文獻(xiàn)報(bào)道表明[2’3]，紫草中含有多種化學(xué)成分，包括紫草萘醌類、酚酸類、生物堿類、苯酚及苯醌類、三萜酸及留醇類、黃酮類以及多糖類等物質(zhì)。其中研究最多的是紫草萘醌類化合物，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從不同種屬紫草植物的根中分離得到多種萘醌化合物，如:β -羥基異戊酰紫草素、紫草素、2，3_ 二甲基戊烯酰紫草素、乙酰紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素、異丁酰紫草素、α-甲基-正丁酰紫草素、異戊酰紫草素、去氫阿卡寧(去氫異紫草素)、去氧紫草素、β，β -二甲基丙烯酰阿卡寧、β -乙酰氧基異戊酰阿卡寧、β -羥基異戊酰阿卡寧等。天然存在的紫草萘醌有兩種光學(xué)異構(gòu)體，一種為R型(命名為紫草素類)，一種為S型(命名為阿卡寧類)，它們 互為對(duì)映體[4’5]。
權(quán)利要求
1.一種軟紫草和硬紫草的液相-圓二色譜(LC-CD)鑒定方法，其特征是利用高效液相色譜(HPLC)技術(shù)，分離出紫草中的萘醌類衍生物，再利用圓二色譜(CD)檢測(cè)它們的圓二色性，利用圓二色色譜圖中的峰的正負(fù)特性鑒定軟紫草和硬紫草。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征為圓二色譜(CD)檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為:210_240nm,250_300nm,325_400nm 和 450-600nm,200_210nm,240_240nm,300_325nm,400_450nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定方法，其特征是圓二色譜(CD)檢測(cè)波長(zhǎng)為:220nm，245nm,260nm,310nm,360nm,430nm 和 550nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鑒定方法，其特征是圓二色譜(CD)檢測(cè)波長(zhǎng)為:220nm，245nm,260nm 和 550nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒定方法，其特征是 1.色譜條件:色譜柱為 Scienhome Kromasil C18 (4.6mmX 200mm, 5 μ m)及預(yù)柱，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.3%磷酸水(B)，梯度洗脫過程(A梯度)0-10分鐘70%，10-30分鐘70 % -75%, 30-31 分鐘 75 % -95%, 31-36 分鐘 95 %，36-37 分鐘 95 % -70%, 37-50 分鐘70%;檢測(cè)波長(zhǎng) 274nm (或者 220nm，245nm, 260nm, 310nm, 360nm, 430nm 和 550nm)，柱溫 30 °C，流速1.0mL/min，理論板數(shù)以萘醌計(jì)不低于3000 ;其紫外光譜的回歸方程、線性范圍、最低檢測(cè)限和定量限符合檢測(cè)誤差要求； .樣品溶液的配置方法1:精密稱取軟紫草或硬紫草樣品(藥材、提取物、化學(xué)成分單體、含有紫草的復(fù)方中藥等)各適量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)溶解，經(jīng)裝填ODS (十二烷基鍵合硅膠)的SPE小色譜柱預(yù)處理，水(或者低濃度有機(jī)溶劑)洗脫除雜，繼用乙腈(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)洗滌，合并洗脫液，甲醇溶解，定容，過濾，即得； ii1.樣品溶液的配置方法2:精密稱取軟紫草或硬紫草樣品(藥材、提取物、化學(xué)成分單體、含有紫草的復(fù)方中藥等)各適量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇溶解，定容，過濾，即得； iv.樣品溶液的配置方法3:精密稱取軟紫草或硬紫草樣品(藥材、提取物、化學(xué)成分單體、含有紫草的復(fù)方中藥等)各適量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)提取，過濾，即得； V.測(cè)試方法:進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，以圓二色譜(CD)為檢測(cè)，記錄色譜圖；軟紫草和硬紫草樣品各波長(zhǎng)處測(cè)定的液相-圓二色譜(LC-CD)色譜圖中色譜峰的符號(hào)不同，具體特征如下: 在220nm，274nm, 360nm和550nm處測(cè)定的液相-圓二色譜(LC-CD)色譜圖，軟紫草中各個(gè)色譜峰為負(fù)峰，硬紫草中各個(gè)色譜峰為正峰； 在245nm，310nm和430nm處測(cè)定的液相-圓二色譜(LC-⑶)色譜圖，軟紫草中各個(gè)色譜峰為正峰，硬紫草中各個(gè)色譜峰為負(fù)峰。
利用圓二色色譜圖中的峰的正負(fù)特性鑒定軟紫草和硬紫草。
6.一種軟紫草和硬紫草的液相-圓二色譜(LC-CD)鑒定方法，其特征是利用高效液相色譜(HPLC)分離出紫草中的萘醌類衍生物，再利用圓二色譜(CD)和紫外光譜(UV)同時(shí)檢測(cè)，根據(jù)紫外色譜峰的峰面積計(jì)算對(duì)映異構(gòu)體總含量，根據(jù)紫外色譜峰的峰面積計(jì)算對(duì)映異構(gòu)體總含量，利用圓二色色譜圖中的峰的正負(fù)，鑒定軟紫草和硬紫草。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鑒定方法，其特征為圓二色譜(CD)檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為:210_240nm,250_300nm,325_400nm 和 450-600nm,200_210nm,240_240nm,300_325nm,400-450nm ;紫外光譜(UV)檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為200-300nm和400_600nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的鑒定方法，其特征是圓二色譜(CD)檢測(cè)波長(zhǎng)為:220nm，245nm, 260nm, 310nm, 360nm, 430nm 和 550nm,最優(yōu)選檢測(cè)波長(zhǎng)為:220nm, 245nm, 260nm 和550nmo
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的鑒定方法，其特征為: i.色譜條件:色譜柱為 Scienhome Kromasil C18 (4.6mmX 200mm, 5 μ m)及預(yù)柱，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.3%磷酸水(B)，梯度洗脫過程(A梯度)0-10分鐘70%，10-30分鐘70 % -75%, 30-31 分鐘 75 % -95%, 31-36 分鐘 95 %，36-37 分鐘 95 % -70%, 37-50 分鐘70%;檢測(cè)波長(zhǎng) 274nm (或者 220nm，245nm, 260nm, 310nm, 360nm, 430nm和 550nm)，柱溫 30°C，流速1.0mL/min，理論板數(shù)以萘醌計(jì)不低于3000 ;其紫外光譜的回歸方程、線性范圍、最低檢測(cè)限和定量限符合檢測(cè)誤差要求； ii.樣品溶液的配置方法1:精密稱取軟紫草或硬紫草樣品(藥材、提取物、化學(xué)成分單體、含有紫草的復(fù)方中藥等)各適量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)溶解，經(jīng)裝填ODS (十二烷基鍵合硅膠)的SPE小色譜柱預(yù)處理，水(或者低濃度有機(jī)溶劑)洗脫除雜，繼用乙腈(或甲醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)洗滌，合并洗脫液，甲醇溶解，定容，過濾，即得； ii1.樣品溶液的配置方法2:精密稱取軟紫草或硬紫草樣品(藥材、提取物、化學(xué)成分單體、含有紫草的復(fù)方中藥等)各適量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)提取，回收提取液，甲醇溶解，定容，過濾，即得； iv.樣品溶液的配置方法3:精密稱取軟紫草或硬紫草樣品(藥材、提取物、化學(xué)成分單體、含有紫草的復(fù)方中藥等)各適量，用甲醇(或氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、石油醚、環(huán)己烷等有機(jī)溶劑及其不同濃度的水溶液)提取，過濾，即得； V.測(cè)試方法:進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，以圓二色譜(CD)為檢測(cè)，記錄色譜圖；軟紫草和硬紫草樣品各波長(zhǎng)處測(cè)定的液相-圓二色譜(LC-CD)色譜圖中色譜峰的符號(hào)不同，具體特征如下: 在220nm，274nm, 360nm和550nm處測(cè)定的液相-圓二色譜(LC-CD)色譜圖，軟紫草中各個(gè)色譜峰為負(fù)峰，硬紫草中各個(gè)色譜峰為正峰； 在245nm，310nm和430nm處測(cè)定的液相-圓二色譜(LC-⑶)色譜圖，軟紫草中各個(gè)色譜峰為正峰，硬紫草中各個(gè)色譜峰為負(fù)峰； 波長(zhǎng)為274nm處進(jìn)行紫外檢測(cè)，并記錄色譜圖； 根據(jù)紫外色譜峰的峰面積計(jì)算對(duì)映異構(gòu)體總含量，利用圓二色色譜圖中的峰的正負(fù)，鑒定軟紫草和硬紫草。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述的鑒定方法，其特征是該方法還可以用來鑒定軟紫草和硬紫草提取物、含 有紫草的復(fù)方中藥、萘醌類成分單體。
全文摘要
本發(fā)明涉及軟紫草和硬紫草的鑒定技術(shù)，利用軟紫草和硬紫草分別含有的卡寧對(duì)映異構(gòu)體，在液相-圓二色譜(LC-CD)中的相反關(guān)系，建立了液相-圓二色譜(LC-CD)準(zhǔn)確地鑒定軟紫草和硬紫草藥材和提取物(包括含有紫草的復(fù)方中藥、萘醌類成分單體)的方法，從而，提供了一種準(zhǔn)確地鑒定和區(qū)分軟紫草和硬紫草藥材和提取物(包括含有紫草的復(fù)方中藥、萘醌類成分單體)的方法。
文檔編號(hào)G01N30/88GK103175928SQ20111028536
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者王金輝, 劉珂, 李國(guó)玉, 馮文文, 郎躍武 申請(qǐng)人:山東靶點(diǎn)藥物研究有限公司