專利名稱：一種磺胺類藥物的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測磺胺類的化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒，用于檢測動物組織(肌 肉、肝臟)、水產(chǎn)品(魚、蝦)、雞蛋、牛奶和奶粉中的磺胺類藥物含量或殘留量。屬于免疫學(xué) 檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
磺胺類藥物的基本結(jié)構(gòu)為對氨基苯磺酰胺，具有芳氨基和磺酞胺基，多為兩性化 合物，藥物具有一定酸性。磺胺類藥物的抑菌作用是由于磺胺類藥物中能分解出對氨基苯 磺酰胺，其分子的大小和形狀與組成葉酸中的對氨基苯甲酸相近，化學(xué)性質(zhì)也類似。由于細(xì) 菌對二者缺乏選擇性，大量的對氨基苯磺胺替代了對氨基苯甲酸而被細(xì)菌吸收，干擾細(xì)菌 葉酸的合成而影響其生長繁殖，從而可抑制大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些陰性菌?；前奉愃?物應(yīng)用較廣，具有一定療效的就有幾十種。
磺胺類藥物作為獸藥和飼料添加劑，在食源性動物的飼養(yǎng)中被廣泛應(yīng)用，在動物 疾病的防治方面具有顯著的療效。例針對動物的腸炎、乳房炎、肺炎、腦膜炎等疾病。同時， 這類藥物具有顯著的毒副作用，影響人的泌尿系統(tǒng)功能，引起結(jié)晶尿，血尿，尿痛，尿少等癥 狀，或產(chǎn)生一些皮炎、發(fā)熱等過敏反應(yīng)以及致癌性作用。如果這類藥物不按規(guī)定或要求使用 與停藥，動物體內(nèi)的藥物殘留會隨著食物鏈影響人體的健康。因此，國內(nèi)外對磺胺類藥物殘 留均有限量要求，我國以及美國、歐盟等國家規(guī)定動物性食品中總磺胺以及單個磺胺的最 高殘留限量(MRLs)為O. lmg/kg，其中磺胺二甲基嘧啶(SM2)的MRLs為O. 025mg/kg。
目前，針對磺胺類獸藥殘留的檢測方法有薄層色譜法(TLC)、高壓液相色譜 (HPLC)法、液質(zhì)聯(lián)用(HPLC/MS)、氣相色譜法(GC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和毛細(xì)管電泳 法(HPCE)等。由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的前處理過程，儀器分析方法不適合現(xiàn)場監(jiān)控和 大量樣本的篩選，其中ELISA方法作為一種新型的動物源性食品中磺胺類藥物殘留篩選方 法已被使用，但是大部分只能針對磺胺類其中一種或者少數(shù)幾種藥物進(jìn)行檢測，不利于磺 胺類藥物的全面檢測。
化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程 度高、試劑穩(wěn)定且有效期長出 18個月)等優(yōu)點(diǎn)，其檢測限比酶聯(lián)免疫法和理化檢測方法 高幾個數(shù)量級。化學(xué)發(fā)光進(jìn)口儀器與試劑性能較好，而國外的技術(shù)壟斷導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光儀、發(fā) 光底物液和試劑盒價格居高不下，而且試劑或試劑盒與儀器相匹配，進(jìn)口試劑常常不能在 國產(chǎn)儀器中使用，造成化學(xué)發(fā)光免疫方法無法在基層普及?；瘜W(xué)發(fā)光底物液是化學(xué)發(fā)光酶 免疫檢測方法的關(guān)鍵試劑，配制出低成本且性能良好，適合國產(chǎn)儀器使用的的發(fā)光底物液， 可降低化學(xué)發(fā)光方法的使用成本，有利于在基層的普及。建立穩(wěn)定的磺胺類藥物多殘留化 學(xué)發(fā)光酶免疫檢測分析方法，也是進(jìn)行商品化學(xué)發(fā)光試劑盒的研制的基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種磺胺類的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。該試劑盒具有檢測靈敏度高、應(yīng)用靈活、方便的特點(diǎn)。
一種磺胺類藥物的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑；其特征在于，所述酶標(biāo)板的各孔包被有以磺胺類藥物母核與卵清蛋白偶聯(lián)制成的包被抗原；所述試劑包括磺胺類單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體、磺胺類系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學(xué)發(fā)光液。
所述酶標(biāo)板優(yōu)選乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板。
所述酶標(biāo)板的各孔包被有以磺胺類藥物母核與卵清蛋白偶聯(lián)制成的包被抗原；其中所述包被抗原濃度優(yōu)選10 μ g/mL。
所述磺胺類系列標(biāo)準(zhǔn)溶液從磺胺類純品中稀釋得到，稀釋液為含有10%甲醇的 O. 05mmol/L, pH = 7. 4 的 PBS,磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別是 Ong/mL,1. Ong/mL, 3. Ong/mL, 9. Ong/mL, 27. Ong/mL和81. Ong/mL,所述百分比為體積百分比。
所述磺胺類單克隆抗體是由磺胺類藥物母核與牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫動物制得的單克隆抗體，其工作濃度優(yōu)選為1: 64000。
所述化學(xué)發(fā)光液A液為魯米諾含量為O. 01M、對甲苯酚含量為O. OOlM pH = 8. 8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液；B液為IOOmL溶液含檸檬酸2. lg，無水Na2HP042. 82g，0. 75% 的過氧化氫脲O. 64mL的溶液。所述魯米諾為化學(xué)發(fā)光底物，對甲苯酚為發(fā)光增強(qiáng)劑。
所述濃縮磷酸鹽緩沖液是每升含NaH2PO4 · 2H20 5. 74g、Na2HPO4 · 12H20 32. 6g的水溶液。
所述濃縮洗滌溶液是含有體積分?jǐn)?shù)O. 05%吐溫-20的pH = 7. 4,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液。
所述包被溶液是每升水中含1. 59g碳酸鈉和2. 53g碳酸氫鈉的溶液(CB)，pH = 9.5。
所述封閉溶液是每升洗漆溶液中含IOg卵清蛋白(OVA, ovalbumin,也稱雞卵清白蛋白或雞卵白蛋白，由385個氨基酸殘基組成，分子量約45kDa)且加入質(zhì)量為5%。NaN3的溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比。
本發(fā)明溶液的配制
本發(fā)明試劑盒中涉及的磺胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液、磺胺類單克隆抗體溶液、化學(xué)發(fā)光溶液及洗滌溶液及其配方對本發(fā)明試劑盒檢測的靈敏度影響很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是
1、磺胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液以常規(guī)方法將磺胺類藥物純品用含有10%甲醇的O. 05m mol/L,pH = 7· 4 的 PBS 配制成濃度分別為 Ong/mL,1. Ong/mL, 3. Ong/mL, 9. Ong/mL, 27. Ong/ mL和81. Ong/mL的磺胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液，所屬百分比為體積百分比。
2、酶標(biāo)羊抗鼠抗體溶液酶標(biāo)羊抗鼠抗體為辣根過氧化酶-羊抗鼠IgG原液，使用時用洗滌溶液配制成1: 2000的工作濃度。
3、磺胺類單克隆抗體溶液磺胺類單克隆抗體是用人工免疫抗原免疫動物制得的單克隆抗體，將所得磺胺類單克隆抗體用洗滌溶液稀釋成1: 64000的工作濃度。
4、化學(xué)發(fā)光溶液A液為魯米諾含量為O. 01M、對甲苯酚含量為O. OOlM pH = 8. 8 的三(羥甲基)氨基甲烷溶液；B液為IOOmL溶液含檸檬酸2. lg，無水Na2HP042. 82g，0. 75% 的過氧化氫脲O. 64mL的溶液。
5、濃縮磷酸鹽緩沖液=NaH2PO4 · 2H20 5. 74g,Na2HPO4 · 12H20 32. 6g 溶于 IL 去離子水中。
6、濃縮洗滌溶液按體積分?jǐn)?shù)O. 05%將吐溫-20添加至pH = 7. 4，O. lmol/L磷酸鹽緩沖液中。
7、包被溶液1. 59g碳酸鈉和2. 53g碳酸氫鈉溶于IL水中，調(diào)節(jié)pH = 9. 5。
8、封閉溶液配制10g OVA溶于IL洗滌溶液中，再加入重量比為5%。的NaN3。
本發(fā)明酶標(biāo)板的包被
本發(fā)明中包被酶標(biāo)板采用將磺胺類藥物母核-OVA偶聯(lián)物置于設(shè)定的包被溶液中，以設(shè)定的濃度，在37 °C恒溫箱中反應(yīng)包被。
本發(fā)明包被液采用的是pH = 9. 5的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液。本發(fā)明中微孔板中所包被的磺胺類藥物母核-OVA在堿性環(huán)境下可以很好的結(jié)合在微孔板塑料表面上， 可以經(jīng)受多次洗板，采用的包被抗原濃度為10 μ g/mL。
包被好的微孔板可以用封閉溶液封閉，封閉液中惰性蛋白優(yōu)選0VA，需加入NaN3防止變質(zhì)。
磺胺類單克隆抗體溶液的制備
本發(fā)明中磺胺類單克隆抗體溶液是決定本發(fā)明中磺胺類酶聯(lián)免疫測試試劑盒測定范圍及靈敏度的重要因素。
本發(fā)明中涉及的磺胺類單克隆抗體溶液可以用洗滌溶液稀釋成1: 64000的工作濃度。
按照上述磺胺類單克隆抗體溶液濃度制備的試劑盒可以達(dá)到很好的線性范圍 (標(biāo)準(zhǔn)線范圍可以達(dá)到Ong/mL 81. Ong/mL)和很好的靈敏度(1. Ong/mL)。
化學(xué)發(fā)光溶液的配制
本發(fā)明采用辣根過氧化酶標(biāo)記底物發(fā)光系統(tǒng)，主要是魯米諾-過氧化氫系統(tǒng)。
所述化學(xué)發(fā)光液A液為魯米諾含量為0. 01M、對甲苯酚含量為0. 001M pH = 8. 8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液，B液為IOOmL溶液含檸檬酸2. lg，無水Na2HP042. 82g,0. 75% 的過氧化氫脲0. 64mL的溶液。所述魯米諾為化學(xué)發(fā)光底物，對甲苯酚為發(fā)光增強(qiáng)劑。
本發(fā)明的原理是將抗體-抗原反應(yīng)的高度特異性與酶催化的高度靈敏性結(jié)合起來，利用酶催化底物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測產(chǎn)物濃度。
本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有靈敏度高、簡便快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的比色ELISA法比較，靈敏度可以提高一個數(shù)量級。有望在動物性食品(如奶、奶粉、 動物組織、水產(chǎn)品、蜂蜜、尿樣)中的磺胺類藥物殘留檢測中發(fā)揮重要作用。


圖1為磺胺類母核半抗原合成反應(yīng)式。
圖2為本發(fā)明化學(xué)發(fā)光反應(yīng)式。
圖3為本發(fā)明磺胺類藥物抗體的工作曲線。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 :母核半抗原、免疫原、包被原及單克隆抗體的制備
(I)磺胺母核半抗原合成
A,于25ml單口瓶中加入6_氨基煙酸O. 87g,乙醇20ml,鹽酸(12mol/L), 3. 7ml, 加熱回流，反應(yīng)8h，TLC監(jiān)測，反應(yīng)畢，減壓除去溶劑，溶于飽和NaHC03水溶液，乙酸乙酯萃取，無水NaS204干燥，柱層析(乙酸乙酯/石油醚，2/1，v/v)純化，收率85%。
B，于25ml單口瓶中加入6_氨基煙酸乙酯O. 89g，Et3Nl. 6ml，CH2C1210ml，攪拌溶解后，加入催化量DMAP。緩慢滴入4-乙酰氨基苯磺酰氯的2ml 二氯甲烷溶液，TLC監(jiān)測， 5h，反應(yīng)完畢，后處理，干燥，柱層析純化(乙酸乙酯/石油醚，1/10，v/v)，收率為80%。
C，于25ml單口瓶中加入上述產(chǎn)物lg，2mol/LNa0H水溶液120ml，加熱回流，TLC監(jiān)測，反應(yīng)10h，反應(yīng)畢，調(diào)節(jié)PH4 5，有固體析出，收率約70%。
(2)免疫原合成
A，取12mg磺胺類母核半抗原，溶解于ImL DMF中，取15EDC用O. 2ml水充分溶解后于加入(I)中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A。
B,稱取BSA40mg，使之充分溶解在3mL PBS (PH 7. 2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用O. Olmol/IPBS 4度透析3d每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 稱取30mg0VA和12mg磺胺類母核半抗原,按上述步驟反應(yīng),合成SAs-OVA,供包被用。
(3)磺胺類單克隆抗體的制備
A，動物免疫用上述制備出的免疫原(SAs-BSA)按100 μ g/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐 劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6 8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天以免疫復(fù)合物100 μ g/只，不加弗氏佐劑再追加免疫一次。
B，細(xì)胞融合按常規(guī)方法進(jìn)行，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)混合，然后在45秒內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑(PEG4000)進(jìn)行融合，用HAT 培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后用HT培養(yǎng)基半換液，9天時候進(jìn)行全換液。
C，雜交瘤細(xì)胞的篩選細(xì)胞融合后，待細(xì)胞長到培養(yǎng)孔面積的1/2時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初選采用間接ELISA方法，以包被抗原(預(yù)先用方陣法常規(guī)滴定其最佳包被濃度和陽性血清稀釋度)包被酶標(biāo)板，加入被測孔培養(yǎng)上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，鄰苯二胺(OPD)進(jìn)行顯色反應(yīng)。篩選出的陽性孔再用間接競爭ELISA方法篩選，先將細(xì)胞上清與100 μ g/mL的磺胺類藥物等體積混合，37°C水浴作用 30min，再加入到包被好的酶標(biāo)板中。同時用PBS取代磺胺類藥物作對照，其余步驟同上。若經(jīng)磺胺類阻斷后的OD45tlnm值下降到對照孔的50%以下，則判為陽性，經(jīng)2 3次檢測都為陽性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。
D，單克隆抗體制備將2 3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液用間接ELISA測定效價，凍存；并取8 10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟O. 5mL/只， 7 10日后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞I 2X IO6/只，7 10日后抽取小鼠腹水，離心取上清， 測定效價，并凍存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2 =ELISA檢測方法的建立
(I)抗體與包被抗原濃度的優(yōu)選(方陣)
縱向用每種包被抗原按160. O μ g/mL, 80. O μ g/mL, 40. 0 μ g/mL, 20. 0 μ g/mL,10.0 μ g/mL, 5. 0 μ g/mL, 2. 5 μ g/mL,1. 25 μ g/mL 的系列稀釋度包被酶標(biāo)板，100 μ L/ 孔,置于37°C恒溫箱a后，拍干；以150 μ L/孔封閉溶液封閉，37°C恒溫箱放置2小時，洗板一次， 拍干；加入50 μ L/孔一系列稀釋的磺胺類單克隆抗體(I 1000至1: 512000)，再加入 50 μ L/孔用洗滌溶液配制成1: 2000的酶標(biāo)羊抗鼠抗體工作濃度。室溫(20 25°C )孵育15min,洗板五次,最后一次拍干；加入100 μ L/孔的化學(xué)發(fā)光液,測定發(fā)光值。以發(fā)光值隨包被抗原的濃度有明顯梯度變化的包被抗原濃度和抗體稀釋度為最佳濃度進(jìn)行特異性測定。
(2)抗體靈敏度的測定
根據(jù)上述對抗體及包被抗原濃度的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)，申請人選擇并確定抗體濃度為 I 64000，包被抗原濃度為10 μ g/mL進(jìn)行抗體的靈敏度的測定
A，包被用O. 05M pH = 9. 6的碳酸鹽包被溶液將包被抗原配成10 μ g/mL的溶液， 每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加100μ L，37°C恒溫箱2h。棄去孔內(nèi)溶液，拍干。
B,封閉用封閉溶液封閉上述已包被的酶標(biāo)板，150 μ L/孔，37°C恒溫箱2h然后洗板一次，拍干。
C，加樣加不同濃度的磺胺類溶液50 μ L/孔，再加入50 μ L/孔以稀釋的磺胺類單克隆抗體((I 64000)與用洗滌溶液配制成的酶標(biāo)羊抗鼠抗體工作液(I 2000)按體積比10 I比例配置的酶-抗體溶液于以上述已封閉的反應(yīng)孔中，室溫(20 25°C)避光孵育15min,然后洗板五次,最后一次拍干。
D,發(fā)光于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的化學(xué)發(fā)光溶液100 μ L/孔,反應(yīng)3min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測。
E，檢測結(jié)果以抑制率計算
相對發(fā)光強(qiáng)度) = RLU/RLU0, RLU是標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品溶液測定的發(fā)光強(qiáng)度值， RLU0是空白(濃度為O的標(biāo)準(zhǔn)溶液)的發(fā)光強(qiáng)度值。
計算50%抑制率時藥物的濃度即為該抗體的靈敏度。
實(shí)施例3 :檢測磺胺類的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒
(I)檢測磺胺類的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的組成
A，包被有包被原(SAs-OVA)的固相載體(酶標(biāo)板)。
B,磺胺類標(biāo)準(zhǔn)溶液0ng/mL,1. Ong/mL, 3. Ong/mL, 9. Ong/mL, 27. Ong/mL 和 81. 0ng/mLo
C，磺胺類抗體溶液用人工免疫抗原(SAs-BSA)免疫動物制備所得的單克隆抗體，將所得磺胺類抗體用洗滌溶液稀釋成1: 64000工作濃度。
D，發(fā)光溶液A液為魯米諾含量為0. 01M、對甲苯酚含量為0. 001M pH = 8. 8的三 (羥甲基)氨基甲烷溶液，B液為IOOmL溶液含檸檬酸2. lg，無水Na2HP042. 82g，0. 75%的過氧化氫脲0. 64mL的溶液。
E，濃縮磷酸鹽緩沖液是每升含 NaH2PO4 · 2H20 5. 74g、Na2HPO4 · 12H20 32. 6g 的水溶液；
F，濃縮洗滌溶液含有體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-20的pH = 7.4，0. lmol/L磷酸鹽緩沖液。
(2)酶標(biāo)板的制備
用包被液將包被抗原稀釋成10 μ g/mL,每孔加入100 μ L，37°C恒溫箱放置2h，傾去包被液，拍干，然后每孔加入封閉液150 μ L，37°C恒溫箱放置2h，傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌一次，拍干，用錫箔紙真空密封保存。
實(shí)施例4 :檢測磺胺類的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的應(yīng)用
(I)試劑的配制
A，洗滌溶液將試劑盒中提供的濃縮洗滌液用去離子水按1: 19倍稀釋后使用。
B，磷酸鹽緩沖液將試劑盒中提供的濃縮磷酸鹽緩沖液用去離子水按1:1倍稀釋后使用。
C，化學(xué)發(fā)光溶液使用前將A液與B液按體積比1:1混勻。
(2)樣品前處理
A，動物組織(豬肉、雞肉)、水產(chǎn)品(魚、蝦等)
——稱取2. 0±0. 058均質(zhì)物至5011^聚苯乙烯離心管中，加入20(^1^ O.1M NaOH, 再加入3. 8mL乙腈和2mL乙酸乙酯,立即振搖3min,3000g以上離心5min ；
—取3mL上清液至IOmL干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?
—加入ImL正己燒，用渦旋儀渦動30s溶解干燥殘留物，加入ImL磷酸鹽緩沖液， 用渦旋儀渦動IOs后轉(zhuǎn)入2mL離 心管中，3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min ；
——除去上層正己烷相，取下層水相50 μ L用于分析。
B，雞蛋
——用均質(zhì)器均質(zhì)雞蛋樣本,使蛋清和蛋黃充分混合；
-稱取1. 0±0. 05g均質(zhì)物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入8mL乙酸乙酯,立即振搖3min，3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min ；
—取4mL上清液至IOmL干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?br> —加入ImL正己烷，用渦旋儀渦動Imin溶解干燥殘留物，再加入ImL磷酸鹽緩沖液，用渦旋儀渦動20s，3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min ；
——除去上層正己烷相，取下層水相50 μ L用于分析。
C，牛奶
——移取ImL新鮮牛奶樣本至50mL聚苯乙烯離心管中，加入8mL乙酸乙酯，立即振搖3min，3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min ；
-取4mL上清液至IOmL干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?br> —加入ImL正己烷，用渦旋儀渦動Imin溶解干燥殘留物，再加入ImL磷酸鹽緩沖液，用渦旋儀渦動20s，3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min ；
—除去上層正己烷相，取下層水相50μ L用于分析。
D，奶粉:
-稱取O. 5. 0±0. 05g均質(zhì)物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入5mL甲醇,用振蕩器振蕩5min，3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min ；
—移取ImL上層有機(jī)相至IOmL干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?br> ——加入ImL正己烷，用渦旋儀渦動30s，再加ImL磷酸鹽緩沖液，用渦旋儀渦動 30s后轉(zhuǎn)入2mL離心管中，3000g以上,室溫(20 25°C )離心5min ；
——除去上層有機(jī)相，取下層50 μ L用于分析。
Ε，雞肝、豬肝
——稱取2.0±0.058均質(zhì)物至501^聚苯乙烯離心管中，加入20(^1^ O.1M NaOH, 再加入3. 8mL乙腈和2mL乙酸乙酯,立即振搖3min,3000g以上離心5min ；
—取ImL上清液至IOmL干凈玻璃試管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑?br> —加入ImL正己燒，用渦旋儀渦動30s溶解干燥殘留物，加入ImL磷酸鹽緩沖液， 用渦旋儀渦動IOs后轉(zhuǎn)入2mL離心管中，3000g以上，室溫(20 25°C )離心5min ；
—除去上層正己烷相，取下層水相50μ L用于分析。
(3)檢測步驟
Α，加樣加不同濃度的磺胺類溶液50 μ L/孔，再加入50 μ L/孔以稀釋的磺胺類單克隆抗體((1:64000)與用洗滌溶液配制成的酶標(biāo)羊抗鼠抗體工作液(I 2000)按體積比 10 I比例配置的酶-抗體溶液于以上述已封閉的反應(yīng)孔中，室溫(20 25°C)避光孵育 15min。
B，洗滌傾出孔中液體，每孔加入洗滌溶液250 μ L，洗滌5次，拍干；
C，加發(fā)光溶液每孔加入發(fā)光溶液100 μ L，反應(yīng)3min ；
D，檢測用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強(qiáng)度。
(4)結(jié)果判斷
所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品發(fā)光值的平均值除以第一個標(biāo)準(zhǔn)((O標(biāo)準(zhǔn))的發(fā)光值再乘以100，以抑制率為縱坐標(biāo)，磺胺類濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，每一個樣品的濃度可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出。
相對發(fā)光強(qiáng)度) = RLU/RLU0, RLU是標(biāo)準(zhǔn)品或者樣品溶液測定的發(fā)光強(qiáng)度值， RLU0是空白(濃度為O的標(biāo)準(zhǔn)溶液)的發(fā)光強(qiáng)度值。
實(shí)施例5 :試劑盒特異性試驗(yàn)
以磺胺甲氧異惡唑作為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定磺胺甲氧異惡唑的交叉反應(yīng)率為100%，用于抗體交叉反應(yīng)性研究的藥物均為與磺胺甲氧異惡唑結(jié)構(gòu)或者功能相似的磺胺類藥物磺胺甲氧異惡唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺多辛，磺胺喹惡啉，磺胺甲基嘧啶，磺胺甲氧噠嗪，磺胺氯噠嗪，磺胺間甲氧嘧啶，磺胺苯酰，磺胺對甲氧嘧啶，磺胺二甲基異惡唑，酞?；青邕?，磺胺林，磺胺甲噻二唑，磺胺噻唑，磺胺醋酰，磺胺吡啶，磺胺硝苯。按試劑盒程序操作，但加入的競爭物分別為不同的磺胺類類似物，制作抑制曲線，根據(jù)線性方程計算各競爭物50%抑制濃度(IC5tl)15交叉反應(yīng)率(％CR)即為抗體對磺胺甲氧異惡唑的IC5tl與抗體對競爭物的IC5tl之比的百分?jǐn)?shù)，按下式進(jìn)行計算
抗體對磺胺甲氧異惡唑的IC50交叉反應(yīng)率％ (CR%) =...........................................X100%抗體對磺胺類競爭物得IC5。
結(jié)果列于表1:
表I磺胺類試劑盒特異性試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.一種磺胺類藥物的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑；其特征在于，所述酶標(biāo)板的各孔包被有以磺胺類藥物母核與卵清蛋白偶聯(lián)制成的包被抗原；所述試劑包括磺胺類單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體、磺胺類系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學(xué)發(fā)光液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述磺胺類的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)板為乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述磺胺類的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述包被抗原濃度為10 μ g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述磺胺類的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述磺胺類單克隆抗體的工作濃度為1: 64000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述磺胺類的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述磺胺類的單克隆抗體是由磺胺類藥物母核與牛血清蛋白偶合制成的偶聯(lián)物作為免疫原免疫Balb/c小鼠制備獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述磺胺類的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述磺胺類系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0ng/mL,1. Ong/mL, 3. 0ng/mL,9. Ong/mL, 27. Ong/mL和81. Ong/mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述磺胺類的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述濃縮磷酸鹽緩沖液是每升含NaH2PO4 · 2H20 5. 74g、Na2HPO4 · 12H20 32. 6g的水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述磺胺類的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌溶液是含有體積分?jǐn)?shù)0. 05%吐溫-20的pH = 7. 4,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述磺胺類的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述化學(xué)發(fā)光液A液為魯米諾含量為0.01M、對甲苯酚含量為0.001M pH = 8. 8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液液為IOOmL溶液含檸檬酸2. lg，無水Na2HP042. 82g，0. 75%的過氧化氫脲.0.64mL的溶液，所述百分比為質(zhì)量百分比。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磺胺類藥物的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑；其特征在于，所述酶標(biāo)板的各孔包被有包被抗原即磺胺類母核與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述試劑包括磺胺類單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體、磺胺類系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、濃縮磷酸鹽緩沖液、濃縮洗滌液、化學(xué)發(fā)光液；本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒具有高靈敏度、簡便快速、準(zhǔn)確度高、檢測藥物種類多的特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的比色ELISA法比較，操作時間大幅度減少；可用作檢測動物組織(豬肉、雞肉、豬肝、雞肝)、水產(chǎn)品(魚肉、蝦肉)、雞蛋、牛奶和奶粉中17種磺胺類類藥物殘留檢測。
文檔編號G01N21/76GK103018454SQ20111028212
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者何方洋, 萬宇平, 吳鵬, 馮月君, 扶勝, 岳新榮, 段盈盈, 韓京朋 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司