專利名稱：基于場效應(yīng)晶體管的腫瘤診斷儀及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用場效應(yīng)集晶體管快速、早期診斷人是否患有癌癥的裝置和檢測方法。
背景技術(shù)：
癌癥對人類健康和生命的威脅很大。它和心血管疾病一起，已成為醫(yī)學(xué)上的兩大難關(guān)。全世界60億人口中，每年約有700萬人新患癌癥，每年約有500多萬人死于癌癥，幾乎每6秒鐘就有一名癌癥患者死亡。近年來，我國癌癥的發(fā)病率呈上升趨勢，惡性腫瘤居城市人口死因的首位。隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展，診斷方法不斷進(jìn)步可以使大約80-90%的癌癥得到確診，而且，1/3的癌癥患者能在早期發(fā)現(xiàn)。世界衛(wèi)生組織作出的最新權(quán)威性結(jié)論癌癥患者如果能早期發(fā)現(xiàn)，治愈率可達(dá)80%以上。因此，早期腫瘤診斷已成為全世界醫(yī)務(wù)人員長期以來極盡全力研究的重要方向。腫瘤標(biāo)志物(Tumor Marker)是由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的，存在于細(xì)胞、組織或體液中， 能用化學(xué)或免疫方法定量的、能證實(shí)癌腫存在(或在某一臟器存在)的、能監(jiān)測腫瘤治療和預(yù)后的物質(zhì)。這些物質(zhì)必須在正常人中不存在或者是在癌腫患者中出現(xiàn)的水平顯著高于正常人。如癌胚抗原CEAkarcinoembryonic antigen)，是一種可溶性糖蛋白，胚胎期主要存在于胎兒的胃腸管、胰腺和肝臟。胃腸道惡性腫瘤時(shí)可見血清CEA升高，在乳腺癌、 肺癌及其他惡性腫瘤中也可出現(xiàn)表達(dá)，并分泌于體液中。CEA是一個(gè)結(jié)腸癌標(biāo)記物，CEA 與CA242聯(lián)合應(yīng)用目前被認(rèn)為是對結(jié)腸癌的最佳標(biāo)記物的搭配。在整個(gè)直腸癌治療其間， CEA是一個(gè)有效的監(jiān)視指標(biāo)，是發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)的理想指標(biāo)，其敏感性高于X線和直腸鏡。又如 PSA (prostate-specific antigen)，前列腺特異抗原，是前列腺癌最敏感的腫瘤標(biāo)志物，在判斷前列腺癌體積時(shí)要優(yōu)于前列腺酸性磷酸酶。它對早期沒有癥狀的前列腺癌的診斷很有意義。正常情況下，PSA是由前列腺上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，是一種糖蛋白，直接分泌到前列腺導(dǎo)管系統(tǒng)內(nèi)。它的正常功能是邦助精液凝塊水解液化，與男性生育力有關(guān)。正常的前列腺導(dǎo)管系統(tǒng)周圍存在著一種血-上皮之間的屏障，避免了前列腺上皮產(chǎn)生的PSA直接進(jìn)入血液之中，從而維持了血液中PSA的低濃度。一般認(rèn)為，血清PSA小于 4. Ong/ml為正常，PSA大于lOng/ml則患前腺癌的危險(xiǎn)性增加。當(dāng)前列腺發(fā)生癌時(shí)就破壞了血-上皮之間的屏障，而癌分泌的PSA亦多了，致使PSA直接進(jìn)入血內(nèi)，癌的惡性程度越高，對于正常前列腺組織破壞越大，血清中PSA越高。除了人血液中某些特定的腫瘤標(biāo)志物代表著腫瘤將要或者已經(jīng)產(chǎn)生外，還有一些特定蛋白也有預(yù)示疾病的功效，檢測這些蛋白對于疾病的早期診斷、防治，也非常有意義。 可以通過相同的方法為本裝置檢測到。如急性心肌梗死(AMI)是臨床常見的急性多發(fā)病， 正確診斷及時(shí)救治對挽救瀕死心肌，改善預(yù)后降低急性期病死率和死亡率具有重要意義。 心肌肌鈣蛋白(Cardiac Troponin，CTn)是心肌收縮的調(diào)節(jié)蛋白，存在于心肌收縮蛋白的細(xì)肌絲上。肌鈣蛋白的作用之一是把原肌凝蛋白(Tropomyosin)附著于肌動(dòng)蛋白(Action) 上，三者共同組成細(xì)肌絲。心臟損傷如AMI的早期，心肌細(xì)胞未壞死，但細(xì)胞膜破壞，游離形式的心肌肌鈣蛋I白進(jìn)入組織間隙，經(jīng)淋巴回流入血。血清心肌肌鈣蛋白I于6小時(shí)升高， 其后肌原纖維不斷崩解破壞，固定形式的心肌肌鈣蛋白I不斷釋放，血清水平于18-M小時(shí)達(dá)高峰。所以在AMI時(shí)釋放入血是心肌損傷的特異性標(biāo)志物，并具有靈敏度高，在血中出現(xiàn)時(shí)間早，診斷窗口時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)。此外CTn在預(yù)測梗塞面積，評價(jià)溶栓療效，AMI愈后心功能判定，不穩(wěn)定心絞痛愈后評估等方面也具有重要的臨床價(jià)值。傳統(tǒng)的生物醫(yī)學(xué)檢測血液中的蛋白或者DNA的方法一般是用ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或者PCR(Polymerase Chain Reaction) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，這些檢測方法大多對實(shí)驗(yàn)條件要求較高，需要特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)備或儀器 (如PCR儀)，且過程繁瑣，試劑昂貴，不利于高通量、快速、廉價(jià)、現(xiàn)場檢測腫瘤標(biāo)記物。所以開發(fā)一種能夠早期、快速、靈敏、微量(少于1毫升)檢測人血液中的腫瘤標(biāo)志物的裝置與方法具有重要的意義。為了滿足以上對人體腫瘤標(biāo)志物或者血液中一些重要的疾病標(biāo)志性蛋白質(zhì)檢測，我們設(shè)計(jì)了一種集合了場效應(yīng)晶體管的高靈敏、集成化特性與針對某特異標(biāo)志物的抗原-抗體高特異性的血液檢測儀，可以用來檢測人血液中的各種腫瘤標(biāo)志物及含量。基于納米材料構(gòu)建的場效應(yīng)晶體管生物芯片，能夠直接、超靈敏的檢測到人血液中的微量的腫瘤標(biāo)志物，從而突破了傳統(tǒng)檢測方法的束縛，且裝置構(gòu)建簡單、便攜， 可實(shí)現(xiàn)快速、現(xiàn)場檢測人體內(nèi)的腫瘤標(biāo)志物。具有實(shí)時(shí)靈敏、快速便攜、高通量、集成化、自動(dòng)化等特點(diǎn)，是診斷人是否患癌癥、是否有腫瘤病灶的極佳方法與裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是構(gòu)建一套只利用待測者微量的血液，就能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地診斷人是否患有癌癥或是否有腫瘤的病灶的裝置和方法。本方法能夠解決現(xiàn)有的傳統(tǒng)方法的不足之處，更簡單廉價(jià)、快速靈敏檢測人血液中的腫瘤標(biāo)志物。利用生物學(xué)的免疫反應(yīng)捕獲腫瘤標(biāo)志物，快速準(zhǔn)確，具有特異性，結(jié)合場效應(yīng)晶體管這一物理學(xué)器件進(jìn)行信號檢測，使得本裝置更易于集成化、自動(dòng)化、高通量的檢測樣本，適合于當(dāng)今社會癌癥、腫瘤發(fā)病現(xiàn)象越來越普遍化，需要對數(shù)量巨大的樣本對于高通量、快速檢測。本發(fā)明提供了一種新型的腫瘤標(biāo)志物的檢測方法，其原理是將待檢測者的血液收集在一普通的容器中，經(jīng)過一個(gè)簡單的稀釋、純化過程，再通入與場效應(yīng)晶體管檢測芯片整合的PDMS(聚二甲基硅氧烷)微流體通道中，當(dāng)流過場效應(yīng)晶體管的敏感溝道材料時(shí)， 如果有目標(biāo)腫瘤標(biāo)記物，即會與修飾在溝道上的特異性抗體結(jié)合，吸附在溝道上面，由于腫瘤標(biāo)志物多數(shù)是蛋白或DNA，他們在人的血液中多數(shù)是帶負(fù)電的，所當(dāng)他們吸附在半導(dǎo)體場效應(yīng)晶體管的溝道上時(shí)，會對場效應(yīng)晶體管產(chǎn)生電場的作用，減弱或加強(qiáng)半導(dǎo)體溝道的耗盡，從而影響載流子的遷移速率或者濃度，所以會有電流的增加或者減弱，產(chǎn)生一定程度的電信號。腫瘤標(biāo)志物的含量越高，這種電信號越強(qiáng)。且場效應(yīng)晶體管輸出的電學(xué)信號易于被電腦識別。本裝置和方法流動(dòng)進(jìn)樣、即時(shí)檢測，檢測完畢后樣品流出、再通入一定量的洗滌緩沖溶液數(shù)十秒，即可進(jìn)行下一樣品的診斷檢測，是對人血液中的腫瘤標(biāo)記物的快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是，構(gòu)建了用于腫瘤標(biāo)記物的檢測的場效應(yīng)晶體管的生物芯片(如圖1)，其構(gòu)建步驟為
(1)將各種材料的納米線或薄膜通過一定方法置于有SiO2絕緣層的硅襯底上，作為場效應(yīng)晶體管的溝道。
(2)通過磁控濺射等方式在溝道的兩側(cè)，構(gòu)建出長1至2厘米、寬5毫米、厚200納米左右的金屬電極，作為場效應(yīng)晶體管源極、漏極。
(3)兩電極距離50至100微米。
(4)構(gòu)建好芯片后，在溝道處滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷) 或GPTMS (γ 0，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷))有機(jī)連接試劑，修飾反應(yīng)3小時(shí)。
(5)修飾上有機(jī)連接試劑后，在溝道處再滴加含有針對某種特定腫瘤標(biāo)記物的抗體蛋白溶液，反應(yīng)1小時(shí)。即得到具有檢測腫瘤標(biāo)記物能力的場效應(yīng)晶體管生物芯片。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是，提供了一種腫瘤標(biāo)記物的檢測裝置與方法，其組成和作用為
(1)用于裝納人血液的容器瓶及其連接軟管。容器的下端開一小口，連接上帶有機(jī)械閥門如鐵夾的塑料或硅膠軟管。本部分裝置的作用在于裝容人的血液，下一步檢測時(shí)即可打開控制液流的機(jī)械閥門，讓容器里的血液通過軟管流入與聚二甲硅氧烷整合的場效應(yīng)晶體管生物芯片檢測裝置。所有的容器、軟管等裝置均進(jìn)行滅菌、消毒處理，確保不讓其他病原微生物或雜質(zhì)影響檢測結(jié)果。
(2)與軟管相連接的聚二甲基硅氧烷微流體芯通道。它與修飾好某腫瘤標(biāo)志物抗體的場效應(yīng)晶體管芯片緊密粘合。采用可塑的聚二甲基硅氧烷高分子聚合物材料與場效應(yīng)晶體管芯片緊密貼合的目的在于構(gòu)建出一個(gè)可以進(jìn)樣品溶液、流過晶體管溝道、再流出溶液的密閉通道，這樣易于控制液流方向與線路。流出微流體通道后再連接一燒杯，當(dāng)做廢液池。
(3)場效應(yīng)晶體管生物芯片。在場效應(yīng)晶體管的敏感溝道部分修飾上腫瘤標(biāo)志物抗體，再連接外部的測量、檢測設(shè)備，當(dāng)含有腫瘤標(biāo)志物的溶液流經(jīng)場效應(yīng)晶體管的溝道部分時(shí)，溶液中的腫瘤標(biāo)志物分子就會與修飾在溝道上的抗體特異性的結(jié)合，由于腫瘤標(biāo)志物大多是蛋白或者核酸，它們在溶液中帶電性，結(jié)合在溝道上后會對半導(dǎo)體溝道內(nèi)的載流子產(chǎn)生電場的作用，會增強(qiáng)或減弱半導(dǎo)體的耗盡，從而改變場效應(yīng)晶體管源極、漏極間的電學(xué)信號，可以被測量儀器所檢測到。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是構(gòu)建了與場效應(yīng)晶體管生物芯片整合的微流體通道，其構(gòu)建的步驟、方法是其制備方法為，利用半導(dǎo)體光刻工藝，在硅襯底上構(gòu)建一條長數(shù)厘米， 寬100微米、深50微米的凸起的SU-8光刻膠作用模板，然后將液態(tài)的聚二甲基硅氧烷與一定劑量的固化劑混合后覆蓋于模板上。隨后放入真空干燥箱，真空狀態(tài)，90度下加熱20分鐘后取出。將凝固的聚二甲基硅氧烷塊與模板分離，再與硅襯底緊密貼合即構(gòu)建完成。本腫瘤標(biāo)志物檢測裝置與方法的可行性和靈敏度來源于場效應(yīng)晶體管生物芯片對于患者血液中微量的帶一定電性的腫瘤標(biāo)志物的敏感響應(yīng)，本方法的選擇性來源于固定在場效應(yīng)晶體管溝道上的通過一般生物方法制備的針對某種腫瘤標(biāo)志物的抗體，通過固定不同種類的抗體，可實(shí)現(xiàn)對不同部位腫瘤的特異性診斷。本方法能實(shí)現(xiàn)快速性、便攜性現(xiàn)場診斷的原因是場效應(yīng)晶體管生物芯片和電子檢測系統(tǒng)易于小型化、集成化、耗能低，且可重復(fù)利用，適合于在缺少常規(guī)生物醫(yī)學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件下進(jìn)行快速診斷。本裝置和方法易于自動(dòng)化、高通量診斷樣本的原因是，場效應(yīng)晶體管輸出的電學(xué)信號易于被電腦快速識別，且流動(dòng)進(jìn)樣、即時(shí)檢測，檢測完畢后樣品流出、再通入一定量的洗滌緩沖溶液數(shù)十秒，即可進(jìn)行下一樣品的診斷檢測，使本裝置易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、高通量診斷大量樣品。
本發(fā)明方法與裝置的突出特點(diǎn)與顯著進(jìn)步在于
(1)本發(fā)明基于的場效應(yīng)晶體管生物芯片，構(gòu)建材料靈活多變，可以是有機(jī)薄膜、無機(jī)金屬氧化物材料，構(gòu)建方法和抗體連接的方法都簡單易行。如若使用某些生物相容性好的有機(jī)材料(如石墨烯)作為溝道，抗體蛋白可無需中介直接連接在晶體管上，大大降低診斷時(shí)間和成本。
(2)本發(fā)明基于的場效應(yīng)晶體管生物芯片，在檢測時(shí)利用聚二甲基硅氧烷微流體通道和SiO2鈍化層對電極和芯片進(jìn)行保護(hù)，有效提高芯片使用率和重復(fù)性。
(3)本方法可構(gòu)建數(shù)個(gè)場效應(yīng)晶體管陣列，可一次性直接檢測人血液中的數(shù)種腫瘤標(biāo)記物，高效、快速，取血量微小(幾十微升即可)，減少患者的痛苦。
(4)本方法由于使用納米級的有機(jī)、無機(jī)半導(dǎo)體材料構(gòu)建場效應(yīng)晶體管生物芯片，可實(shí)現(xiàn)靈敏、快速檢測，靈敏度比傳統(tǒng)方法提高IO3到106，檢測時(shí)間在1分鐘內(nèi)就能完成。實(shí)時(shí)、 快速，無需熒光或其他分子標(biāo)記物。
(5)本方法將場效應(yīng)晶體管與現(xiàn)在高發(fā)的癌癥的普及化檢測結(jié)合起來，制備出的檢測儀，輸出電信號，易于集成化、自動(dòng)化、廉價(jià)檢測，適合對樣本數(shù)量巨大的癌癥普查檢測。


圖1是本發(fā)明所述方法場效應(yīng)晶體管生物芯片檢測血液中腫瘤標(biāo)志物的原理圖。圖1標(biāo)記含義見下表
權(quán)利要求
1.一種基于場效應(yīng)晶體管生物芯片的診斷血液中腫瘤標(biāo)志物的裝置和方法，其特征是以功能化修飾的場效應(yīng)晶體管生物芯片為核心，加上輔助進(jìn)液、出液的PDMS(聚二甲基硅氧烷)微流體通道和電子檢測系統(tǒng)組成，能夠檢測人血液中的某種微量特定腫瘤標(biāo)志物的含量。
2.如權(quán)利1所述的場效應(yīng)晶體管的生物芯片，其特征是在硅襯底上利用半導(dǎo)體工藝制造的金屬性的源極電極、漏極電極和和連接在源極和漏極電極間的半導(dǎo)體溝道。半導(dǎo)體敏感材料溝道可以是硅納米線、碳納米管、SnO2納米線、TiO2納米線、GaN納米線、石墨烯納米帶、有機(jī)物薄膜中的一種或幾種。源極電極和漏極電極上鈍化一層S^2以適應(yīng)在水溶液中的檢測。
3.如權(quán)利1所述的場效應(yīng)晶體管的生物芯片，其特征在于所述的半導(dǎo)體溝道可以是一根或由多條組成的陣列。
4.如權(quán)利1所述的功能化修飾的場效應(yīng)晶體管，其特征在于晶體管的半導(dǎo)體溝道上通過有機(jī)連接劑APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷)或GPTMS (γ 0，3-環(huán)氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷)等的中介作用，將某種腫瘤標(biāo)記物的抗體蛋白連接在半導(dǎo)體敏感溝道上面。
5.如權(quán)利1所述的場效應(yīng)晶體管的生物芯片能夠檢測人血液中的特定腫瘤標(biāo)志物的含量的原理是指，將針對某種腫瘤標(biāo)志物的抗體蛋白修飾在半導(dǎo)體敏感溝道上面，當(dāng)取待檢測者的血液，通過微流體通道，流過連接有抗體的溝道時(shí)，抗體可以和腫瘤標(biāo)志物發(fā)生特異性的結(jié)合，吸附在溝道上面，由于腫瘤標(biāo)志物大多數(shù)是蛋白或DNA，他們在人的血液中是帶負(fù)電的，所當(dāng)他們吸附在溝道上時(shí)，會對半導(dǎo)體溝道產(chǎn)生電場的作用，減弱或加強(qiáng)溝道的耗盡，從而影響載流子的遷移速率或者濃度，最終會有電流的增加或者減弱，從而檢測系統(tǒng)檢測到電信號的變化。
6.如權(quán)利3所述的針對某種腫瘤標(biāo)志物的抗體，其來源可用常規(guī)的生物學(xué)制備單克隆抗體的方法事先制備，再修飾在場效應(yīng)晶體管的溝道上。
7.如權(quán)利1所述的輔助進(jìn)液、出液的PDMS微流體通道，其特征是由PDMS構(gòu)建的，控制液體流動(dòng)范圍和方向的，與硅襯底緊密貼合的長方體塊狀物，與硅襯底貼合的一面上有長數(shù)厘米，寬50微米到1毫米、深50微米到100微米的凹陷下去的通道，當(dāng)與硅襯底緊密貼合時(shí)，即構(gòu)建出了一個(gè)介于硅襯底與PDMS塊之間的密閉通道，在通道入口和出口處再各接一塑料或硅膠軟管。整個(gè)微流體通道裝置的作用是控制樣品流入檢測裝置，并讓液流緩慢、 有序地流過場效應(yīng)晶體管的溝道部分，再流出至廢液池。
8.如權(quán)利6所述的輔助進(jìn)液、出液的PDMS微流體通道，其制備方法為，利用半導(dǎo)體光刻工藝，在硅襯底上構(gòu)建一條長數(shù)厘米，寬100微米、深50微米的凸起的SU-8光刻膠作用模板，然后將液態(tài)的PDMS加入一定劑量的固化劑后覆蓋與模板上，隨后放入真空干燥箱，真空狀態(tài)、90度下加熱20分鐘后取出，將凝固的PDMS塊與模板分離，再與硅襯底緊密貼合即構(gòu)建完成。
9.如權(quán)利1所述的電子檢測系統(tǒng)，主要由能在場效應(yīng)晶體管的三個(gè)電極端(源極、漏極、柵極)給予電壓的電源裝置和一個(gè)電流表構(gòu)成。
全文摘要
一種基于場效應(yīng)晶體管的人腫瘤的快速診斷裝置，由場效應(yīng)晶體管生物芯片、微流體通道進(jìn)樣封裝系統(tǒng)、電子檢測系統(tǒng)三部分組成。利用半導(dǎo)體制作工藝在硅襯底上構(gòu)建一對源、漏電極和在源、漏兩極間的半導(dǎo)體溝道，在溝道上共價(jià)修飾硅烷試劑作為連接分子，連接某腫瘤標(biāo)志物的特異性抗體蛋白，然后用聚二甲基硅氧烷構(gòu)建的微流體通道與硅襯底緊密貼合封裝，最后將源、漏兩電極與一套信號檢測系統(tǒng)相連?？赏ㄟ^對人血液中的腫瘤標(biāo)記物的檢測，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、早期地診斷出患者是否患有某種癌癥，是一種集成化、高通量、便攜式的腫瘤診斷裝置。
文檔編號G01N27/414GK102435655SQ20111026014
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者張恩迪, 徐成, 李秋紅, 王太宏, 許志, 陳立寶 申請人:湖南大學(xué)