專(zhuān)利名稱：一種加壓毛細(xì)管電色譜檢測(cè)鰻魚(yú)中磺胺類(lèi)藥物殘留的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全-獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種采用毛細(xì)管電色譜儀檢測(cè)鰻魚(yú)中磺胺類(lèi)藥物的分析方法，具體的說(shuō)是采用毛細(xì)管電色譜法同時(shí)測(cè)定魚(yú)肉中磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺二甲異噁唑五種磺胺類(lèi)藥物的方法。
背景技術(shù)：
磺胺類(lèi)藥物是指具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類(lèi)藥物的總稱，是一類(lèi)用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病的化學(xué)治療藥物。因其具有抗菌譜廣、抗球蟲(chóng)和價(jià)廉易得等特點(diǎn)，至·今仍在獸醫(yī)臨床和畜牧業(yè)中廣泛應(yīng)用?；前奉?lèi)藥物是國(guó)家允許限量使用的一類(lèi)抗菌藥物，可被飼料生產(chǎn)者采用。目前，國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY 5070無(wú)公害食品水產(chǎn)品中魚(yú)藥殘留限量》中規(guī)定，磺胺類(lèi)藥物在水產(chǎn)品組織中的最高殘留總量為O. lmg/kg。該藥在體內(nèi)的代謝時(shí)間較長(zhǎng)，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)就會(huì)對(duì)人體的機(jī)能產(chǎn)生損害，破壞人的造血系統(tǒng)，造成溶血性貧血，磺胺二甲基嘧啶等還存在潛在的致癌性。因此，為保護(hù)消費(fèi)者的健康安全，建立靈敏、準(zhǔn)確、快速的水產(chǎn)品中磺胺類(lèi)藥物的檢測(cè)方法是十分緊迫的。目前磺胺類(lèi)藥物的檢測(cè)方法主要包括免疫學(xué)方法、微生物學(xué)法、高效液相色譜法、氣相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、薄層色譜法和毛細(xì)管電泳法等。我國(guó)農(nóng)業(yè)部頒布的檢測(cè)方法有“動(dòng)物源食品中磺胺類(lèi)藥物殘留檢測(cè)方法-高效液相色譜法”、“動(dòng)物性食品中磺胺二甲嘧啶檢測(cè)方法-高效液相色譜法”。這些方法優(yōu)缺點(diǎn)各異微生物學(xué)法檢測(cè)速度較快，但檢測(cè)靈敏度和特異性較差；薄層色譜法靈敏度、選擇性較好，但重復(fù)性不夠好；毛細(xì)管電泳最大的不足是其進(jìn)樣量小，限制了靈敏度、無(wú)法測(cè)定μ g/kg級(jí)或更低濃度的殘留量。液質(zhì)聯(lián)用儀雖然檢測(cè)靈敏度和分辨率很高，但一般實(shí)驗(yàn)室很難配置這樣的儀器。加壓毛細(xì)管電色譜(pCEC)是近幾年來(lái)興起的一種微分離技術(shù)，它結(jié)合了電泳的高效性和高效液相色譜的保留機(jī)制，通過(guò)在填有HPLC填料的毛細(xì)管色譜柱的兩端施加高壓，提高了樣品的分離能力和效率，使以前需很長(zhǎng)時(shí)間才能出現(xiàn)的峰現(xiàn)在只需很短時(shí)間就可出現(xiàn)，并且試劑和樣品的消耗量減少，近幾年開(kāi)始也用于獸藥殘留的分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測(cè)鰻魚(yú)中磺胺類(lèi)藥物殘留的方法，能同時(shí)測(cè)定鰻魚(yú)中多種磺胺類(lèi)藥物殘留，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測(cè)鰻魚(yú)中磺胺類(lèi)藥物殘留的方法，其特征在于包括以下步驟I)樣品制備將鰻魚(yú)肌肉組織樣品剪碎后均質(zhì)，冷凍保存；2)樣品預(yù)處理將樣品經(jīng)乙酸乙酯離心提取，HLB固相萃取柱凈化，再經(jīng)O. 20
O.24 μ m濾膜過(guò)濾后供毛細(xì)管電色譜測(cè)定用；3)配制磺胺標(biāo)準(zhǔn)溶液；
4)采用加壓毛細(xì)管電色譜進(jìn)行分析以反相鍵和C18為填料的毛細(xì)管電色譜柱作為檢測(cè)柱；流動(dòng)相采用4 6mmol/L，pH 5. 5 6. 5的磷酸氫二鈉溶液與乙腈的混合液，其體積比為80 60 20 40;在所加電壓為9 llkv，柱壓為7.5 8MP，柱溫為常溫，流動(dòng)相的流速40 60 μ L/min ;進(jìn)樣量0. 9 I. I μ L的工藝條件下，用紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)270nm處進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；5)將樣品經(jīng)檢測(cè)分析后根據(jù)其保留時(shí)間進(jìn)行定量分析，利用外標(biāo)法根據(jù)其峰面積進(jìn)行定量分析。作為改進(jìn)，所述步驟2)中的乙酸乙酯離心提取的具體過(guò)程為準(zhǔn)確稱取5±0. Olg均質(zhì)樣品置于50mL離心管中，加入4 6g干燥的無(wú)水硫酸鈉和10 20mL乙酸乙酯，用渦旋混合器充分混勻2 3min，4000 6000r/min離心8 12min，將上清液轉(zhuǎn)移到IOOmL分液漏斗中，再向原離心管中加入10 15mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次上清液于分液漏斗中，加入10 20mL正己烷，振蕩使其充分混合，靜置，棄正己烷層，將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到150mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，25 35°C真空旋轉(zhuǎn)蒸至無(wú)液體殘留，用O. 8 I. 2mL乙腈、I. 5 2. 5mL體積分?jǐn)?shù)為O. 9 I. I %磷酸溶液溶解得到提取液。作為改進(jìn)，所述步驟2)中的HLB固相萃取柱凈化的具體過(guò)程為用4 6mL乙腈活化HLB固相萃取小柱，再用4 6mL去離子水沖洗小柱，轉(zhuǎn)移過(guò)多的乙腈，將提取液加到小柱上，保持I. 5 2. 5mL/min的流速過(guò)柱,再依次用4 6mL水、2 4mL體積分?jǐn)?shù)I. 8
2.2%乙腈溶液淋洗小柱，最后用5 7mL 95%乙腈水溶液洗脫固相萃取小柱，分步洗脫，收集濾液并用氮吹儀吹干，用O. 9 I. ImL流動(dòng)相定容。作為改進(jìn)，所述磺胺為磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑和磺胺二甲異噁唑五種，所述磺胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制為稱取各磺胺類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品10. 0mg±0.01g，用乙腈溶解并定容于IOOml容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。再改進(jìn)，所述磷酸氫二鈉溶液為5mmol/L，pH 6. 0，所述流動(dòng)相的配制過(guò)程為取乙腈、重蒸水、50mmol/L磷酸二氫鈉按體積比30 60 10的比例配制流動(dòng)相，超聲波脫氣20 40min。再改進(jìn)，所述磺胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在檢測(cè)前需用流動(dòng)相稀釋成O. 5 5μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。進(jìn)一步優(yōu)選，所述毛細(xì)管電色譜柱選用規(guī)格為EP-100-20/45-3-C18，內(nèi)徑100 μ m，有效柱長(zhǎng)20cm，填料粒徑3 μ m 0DS。最后,所述步驟4)的所述電壓為IOkv,柱壓為7. 8MP,柱溫為常溫,流動(dòng)相的流速50 μ L/min ;進(jìn)樣量:1. O μ L。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用液-液萃取的經(jīng)典樣品處理方法結(jié)合固相萃取對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，可以有效減少魚(yú)肉組織中雜質(zhì)的含量和基質(zhì)干擾；同時(shí)采用低毒溶劑乙酸乙酯代替二氯甲烷，減少了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有機(jī)溶劑對(duì)操作者和環(huán)境的污染；采用毛細(xì)管電色譜進(jìn)行分析檢測(cè)，有機(jī)試劑消耗少，通過(guò)施加外電壓，可以減少5種磺胺類(lèi)藥物的保留時(shí)間，并且靈敏度得到提高，可以同時(shí)分離檢測(cè)5種磺胺類(lèi)藥物，不僅能滿足鰻魚(yú)磺胺類(lèi)殘留量的常規(guī)檢測(cè)，也可用于其它水產(chǎn)品樣品中的磺胺類(lèi)藥物的測(cè)定。本發(fā)明的分析方法高效、準(zhǔn)確，有機(jī)試劑消耗少，有較高的靈敏度，可以滿足日常檢測(cè)磺胺類(lèi)藥物的需求。


圖I是5種磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品的毛細(xì)管電色譜圖，加-IOkV電壓時(shí)的出峰順序圖，其中I.磺胺嘧啶2.磺胺間甲氧嘧啶3.磺胺甲噁唑4.磺胺二甲異噁唑5.磺胺喹噁啉；圖2是不加電壓的uHPLC圖，其中I.磺胺嘧啶2.磺胺二甲異噁唑3.磺胺間甲氧嘧啶4.磺胺甲噁唑5.磺胺喹噁啉；圖3是市售魚(yú)肉樣品的檢測(cè)電色譜圖。
具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。I樣品制備將鰻魚(yú)肌肉組織樣品，用剪刀剪碎后用高速均質(zhì)器均質(zhì)，冷凍保存。2樣品前處理(I)提取將樣品解凍，準(zhǔn)確稱取5g(精確至O. Olg)均質(zhì)樣品置于50mL離心管中，加入5g干燥的無(wú)水硫酸鈉和15mL乙酸乙酯,用潤(rùn)旋混合器充分混勻2min, 5000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移到IOOmL分液漏斗中，再向原離心管中加入15mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次上清液于分液漏斗中，加入15mL正己烷，振蕩使其充分混合，靜置，棄正己烷層，將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到150mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，30°C真空旋轉(zhuǎn)蒸至無(wú)液體殘留，用ImL乙腈、2mL體積分?jǐn)?shù)為I %磷酸溶液溶解。(2)凈化預(yù)先用5mL乙腈活化HLB固相萃取小柱，再用5mL超純水沖洗小柱，轉(zhuǎn)移過(guò)多的乙腈。將提取液加到小柱上，保持2mL/min的流速過(guò)柱，再依次用5mL水、3mL體積分?jǐn)?shù)2%乙腈溶液淋洗小柱，最后用6mL95%乙腈水溶液洗脫固相萃取小柱，分2mL、2mL、2mL分步洗脫，收集濾液并用氮吹儀吹干,用ImL流動(dòng)相定容，溶液經(jīng)O. 22 μ m濾膜過(guò)濾后，供毛細(xì)管電色譜測(cè)定。3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置磺胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稱取各磺胺類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品10. Omg (準(zhǔn)確至O. Img)，用乙腈溶解并定容于IOOml容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，避光冷藏保存。臨用前用流動(dòng)相稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液。4流動(dòng)相配制及色譜條件取乙腈、重蒸水、磷酸二氫鈉(50mmol/L)按30 : 60 : 10 (V/V/V)的比例配制流動(dòng)相，超聲波脫氣30min后備用。所用色譜條件(I)色譜柱選用規(guī)格EP-100-20/45-3-C18，內(nèi)徑100 μ m，有效柱長(zhǎng)20cm，填料粒徑3 μ mODS 柱；(2)紫外檢測(cè)波長(zhǎng)270nm ；(3)流動(dòng)相乙腈:磷酸氫二鈉(5mmol/L, pH 6. O) = 30 : 70 (V/V),(4)流速50 μ L/min ;進(jìn)樣量1 μ L ；(5)柱壓電壓-10kV，柱壓為7· 8MP，柱溫為常溫。5工作曲線和檢出限
用流動(dòng)相稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液為O. 5 5 μ g/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按試驗(yàn)條件進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)表明，5種磺胺在O. 5 5 μ g/mL范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限列于表I。表I 5種磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與檢出限
權(quán)利要求
1.一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測(cè)鰻魚(yú)中磺胺類(lèi)藥物殘留的方法，其特征在于包括以下步驟 1)樣品制備將鰻魚(yú)肌肉組織樣品剪碎后均質(zhì)，冷凍保存； 2)樣品預(yù)處理將樣品經(jīng)乙酸乙酯離心提取，HLB固相萃取柱凈化，再經(jīng)O.20 O. 24 μ m濾膜過(guò)濾后供毛細(xì)管電色譜測(cè)定用； 3)配制磺胺標(biāo)準(zhǔn)溶液； 4)采用加壓毛細(xì)管電色譜進(jìn)行分析以反相鍵和C18為填料的毛細(xì)管電色譜柱作為檢測(cè)柱；流動(dòng)相采用4 6mmol/L，pH 5. 5 6. 5的磷酸氫二鈉溶液與乙腈的混合液，其體積比為80 60 20 40;在所加電壓為9 llkv，柱壓為7.5 8MP，柱溫為常溫，流動(dòng)相的流速40 60μ 7π η ;進(jìn)樣量0. 9 I. I μ L的工藝條件下，用紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)270nm處進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 5)將樣品經(jīng)檢測(cè)分析后根據(jù)其保留時(shí)間進(jìn)行定量分析，利用外標(biāo)法根據(jù)其峰面積進(jìn)行定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的乙酸乙酯離心提取的具體過(guò)程為準(zhǔn)確稱取5±0. Olg均質(zhì)樣品置于50mL離心管中，加入4 6g干燥的無(wú)水硫酸鈉和10 20mL乙酸乙酯，用潤(rùn)旋混合器充分混勻2 3min,4000 6000r/min離心8 12min，將上清液轉(zhuǎn)移到IOOmL分液漏斗中，再向原離心管中加入10 15mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次上清液于分液漏斗中，加入10 20mL正己烷，振蕩使其充分混合，靜置，棄正己烷層，將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到150mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，25 35°C真空旋轉(zhuǎn)蒸至無(wú)液體殘留，用O. 8 I. 2mL乙腈、I. 5 2. 5mL體積分?jǐn)?shù)為O. 9 I. I %磷酸溶液溶解得到提取液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟2)中的HLB固相萃取柱凈化的具體過(guò)程為用4 6mL乙腈活化HLB固相萃取小柱，再用4 6mL去離子水沖洗小柱，轉(zhuǎn)移過(guò)多的乙腈，將提取液加到小柱上，保持I. 5 2. 5mL/min的流速過(guò)柱，再依次用4 6mL水、2 4mL體積分?jǐn)?shù)I. 8 2. 2%乙腈溶液淋洗小柱，最后用5 7mL 95% (體積比)乙腈水溶液洗脫固相萃取小柱，分步洗脫，收集濾液并用氮吹儀吹干，用O. 9 I. ImL流動(dòng)相定容。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述磺胺為磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑和磺胺二甲異噁唑的五種，所述磺胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制為稱取各磺胺類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品10. 0mg±0. Olg，用乙腈溶解并定容于IOOml容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述磷酸氫二鈉溶液為5mmol/L，pH6.0，所述流動(dòng)相的配制過(guò)程為取乙腈、重蒸水、50mmol/L磷酸二氫鈉按體積比30 60 10的比例配制流動(dòng)相，超聲波脫氣20 40min。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述磺胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在檢測(cè)前需用流動(dòng)相稀釋成O. 5 5 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述毛細(xì)管電色譜柱選用規(guī)格為EP-100-20/45-3-C18,內(nèi)徑 100 μ m,有效柱長(zhǎng) 20cm，填料粒徑 3 μ m 0DS。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟4)的所加電壓為10kv，柱壓為7.8MP，柱溫為常溫，流動(dòng)相的流速50μ L/min ;進(jìn)樣量1. O μ L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測(cè)鰻魚(yú)中磺胺類(lèi)藥物殘留的方法，其特征在于先將樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，HLB固相萃取柱凈化，0.22μm濾膜過(guò)濾后使用，采用加壓毛細(xì)管電色譜進(jìn)行分析，以反相鍵和C18為填料的毛細(xì)管電色譜柱作檢測(cè)柱，紫外檢測(cè)器在270nm處進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈∶磷酸二氫鈉(5mmol/L，pH 6.0)＝30∶70(V/V)。本發(fā)明采用液-液萃取的經(jīng)典樣品處理方法結(jié)合固相萃取對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，可以有效減少魚(yú)肉組織中雜質(zhì)的含量和基質(zhì)干擾；采用毛細(xì)管電色譜進(jìn)行分析檢測(cè)，有機(jī)試劑消耗少，通過(guò)施加外電壓，可以減少5種磺胺類(lèi)藥物的保留時(shí)間，并且靈敏度得到提高，可以同時(shí)分離檢測(cè)5種磺胺類(lèi)藥物，不僅能滿足鰻魚(yú)磺胺類(lèi)殘留量的常規(guī)檢測(cè)，也可用于其它水產(chǎn)品樣品中的磺胺類(lèi)藥物的測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N30/74GK102955008SQ201110246660
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者王陽(yáng)光, 歐陽(yáng)小琨, 董潔瑩, 楊立業(yè), 李大東 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院