專利名稱：檢測(cè)群勃龍的磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種直接化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及其測(cè)試方法。特別是檢測(cè)飼料、水產(chǎn)、尿液、組織等樣本中群勃龍藥物殘留量的磁顆粒競(jìng)爭(zhēng)直接化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
群勃龍化學(xué)名為去甲雄三烯醇酮，是人工合成的留類雄性激素，也是家畜的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，人食用殘留有這類物質(zhì)的肉制品會(huì)給身體健康帶來危害。此外，群勃龍也成為體育比賽興奮劑的一個(gè)可能來源。歐盟禁止進(jìn)口使用該類產(chǎn)品的食品，也是我國(guó)海關(guān)禁止檢出的31種獸藥之一。目前，群勃龍的檢測(cè)方法有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等方法。 I、高效液相色譜法(HPLC)具有檢測(cè)精度高、假陽性率低的特點(diǎn)。HPLC法的主要缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴，操作比較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用昂貴，對(duì)檢測(cè)人員專業(yè)要求較高，樣本前處理較復(fù)雜。2、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)，樣品不需要衍生化處理，可對(duì)尿液、血液、肝臟、毛發(fā)和眼球樣品進(jìn)行檢測(cè)。LC-MS/MS聯(lián)用，可進(jìn)一步提高信噪比，所以可用于對(duì)陽性結(jié)果的確認(rèn)手段。但是，無論LC-MS還是LC-MS/MS，儀器檢測(cè)法與GC-MS —樣，并未能解決儀器造價(jià)昂貴，操作步驟繁瑣，樣本前處理復(fù)雜，對(duì)操作人員專業(yè)素養(yǎng)要求高等問題。3、酶聯(lián)免疫法(ELISA)是20世紀(jì)70年代出現(xiàn)，用于微量物質(zhì)的檢測(cè)，最早應(yīng)用于傳染病、腫瘤標(biāo)志物、激素水平等臨床檢測(cè)，90年代開始在我國(guó)食品安全檢測(cè)領(lǐng)域推廣應(yīng)用，目前依托ELISA技術(shù)的試劑盒、試紙條已經(jīng)成為食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域的主導(dǎo)產(chǎn)品，同時(shí)也是我公司研發(fā)和銷售的主要產(chǎn)品類型。酶聯(lián)免疫檢測(cè)法基于抗原-抗體的特異性反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度較高、特異性較好，技術(shù)操作簡(jiǎn)易，容易掌握，確實(shí)解決了大量的以前難以解決的許多微量小分子物質(zhì)如抗生素、激素、農(nóng)藥殘留等的定性、定量分析工作，對(duì)食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展起到了積極的促進(jìn)作用。但是，ELISA方法存在許多自身無法克服的缺陷，主要表現(xiàn)在I)非均相反應(yīng)檢測(cè)過程中為分離游離物與結(jié)合物，需要多步洗板過程，耗時(shí)費(fèi)力，難以提高操作的自動(dòng)化程度。2)酶催化反應(yīng)借助酶催化底物顯色，測(cè)定反應(yīng)液吸光度值。反應(yīng)的時(shí)間與溫度對(duì)酶活力存在較大影響，試劑穩(wěn)定性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測(cè)群勃龍的磁顆粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，采用該試劑盒進(jìn)行群勃龍殘留的檢測(cè)時(shí)不僅具備較高的靈敏度，特異性，而且具有較高的反應(yīng)速度。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種群勃龍殘留的測(cè)試方法，該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性好。實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種群勃龍檢測(cè)試劑盒，其包含的主要試劑有發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。所述的分離試劑是包被有羊抗FITC抗體的順磁性納米微珠。所述的順磁性納米微珠，表面含有-OH、-COOH或-NH2活性基團(tuán)的微珠，用于包被羊抗FITC單克隆抗體，其內(nèi)芯是Fe3O4或Y -Fe2O3,使得微珠具有順磁性。所述的發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾衍生物標(biāo)記的群勃龍半抗原。所述的異魯米諾衍生物是 ABEI、AHEI 或 ABEN。所述的試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)控品和濃縮洗液。所述的熒光素標(biāo)記物是FITC標(biāo)記群勃龍單克隆抗體。 本發(fā)明還提供一種利用試劑盒檢測(cè)群勃龍的方法，包括下列步驟I)分別吸取20 μ 1-100 μ I標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標(biāo)記物，再加20 μ 1-100 μ I突光素標(biāo)記物,充分混勻后,37°C溫育15min ；2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C溫育5min ；3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ I沖洗復(fù)合物沉淀；4)上述清洗步驟重復(fù)2-4次；5) 4)所得分離好的復(fù)合物直接放入測(cè)量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測(cè)發(fā)出的相對(duì)光強(qiáng)度(RLU)，樣本中的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過RLU集合標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算群勃龍的濃度。所述的發(fā)光底物的主要成分是NaOH和Η202。本發(fā)明中分析測(cè)試方法所用的分析儀是包括電源電路、自動(dòng)注射泵I和2、測(cè)量室、發(fā)光室、光電倍增管計(jì)數(shù)器和輸出系統(tǒng)，同時(shí)還配置有計(jì)算機(jī)與中文界面的Windows控制軟件，可進(jìn)行資料錄入、結(jié)果匯總、質(zhì)量控制、結(jié)果儲(chǔ)存和結(jié)果查詢等功能，可完成多種分析模式的編程，定量或定性報(bào)告結(jié)果，自動(dòng)生成并儲(chǔ)存、更新功能，兩點(diǎn)自動(dòng)修正標(biāo)準(zhǔn)曲線，所采用的系統(tǒng)是CI-2008系統(tǒng)。本發(fā)明所述的分離試劑是包被羊抗FITC單克隆抗體，其表面基團(tuán)的含量是O. 1-0. 3eqm/g，其保存于 ρΗ7· 2，含有 3-5 % 卵清蛋白，O. 1-0. 3% Tween-20,0. 4 % NaN3 的PBS緩沖液中。所述的FITC是異硫氰酸熒光素。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。所述的發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾衍生物ABEI、AHEI或ABEN標(biāo)記的群勃龍半抗原，其保存于含PH7. 2,0.3% Tween-20,0. I % NaN3的PBS緩沖液中。所述百分含量是質(zhì)量百分含量。所述的熒光素標(biāo)記物是FITC標(biāo)記的群勃龍單克隆抗體，其保存于PH7. 2，含4_6%卵清蛋白，O. 2-0. 4% NaN3的PBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。群勃龍標(biāo)準(zhǔn)品溶液(Ong/ml,O.Olng/ml,O. 03ng/ml,0. lng/ml,O. 5ng/ml, I. Ong/ml)，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為pH7. 4,0. 03% NaN3,0. lmol/LPBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。群勃龍質(zhì)控品溶液濃度分別為0. 02ng/ml，0. 8ng/ml，質(zhì)控品稀釋液pH7. 4，0. 03% NaN3,0. lmol/LPBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。
所述的濃縮洗液為ΡΗ7·2,0. 2-0. 4% Tween-20,0. 2-0. 4% NaN3,0. 1-0. 2mol/LPBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。本發(fā)明的有益效果如下I)本發(fā)明試劑盒可特異性檢測(cè)群勃龍，對(duì)其他藥物無交叉。2)本發(fā)明試劑盒的靈敏度較高，對(duì)群勃龍的檢測(cè)靈敏度可達(dá)O. Olng/ml。3)本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)快捷，檢測(cè)時(shí)間低于20min。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一試劑盒具體組分的制備I)群勃龍半抗原的合成將群勃龍用琥珀酸酐法合成群勃龍半抗原。2)人工抗原的制備將群勃龍半抗原與牛血清蛋白采用碳化二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)都到免疫原。3)單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫以免疫原對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，免疫劑量為100 μ g/只，使其產(chǎn)生抗血清。細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按9 I比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，得到單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成IX IO9個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油O. 5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5X IO7個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，得到單克隆抗體。4)發(fā)光標(biāo)記物的制備取4. 5mmol/L ABEI,溶于4ml蒸懼水中，5. Ommol/L N-輕基琥拍酰亞胺溶于O. 5mlN，N-二甲基甲酰胺中，二者充分混勻后室溫反應(yīng)3-4h。取上述制備的群勃龍半抗原15mg，用pH7. 4PBS調(diào)節(jié)體積到I. 5ml，然后加入上述活化的ABEI溶液，充分混勻后室溫反應(yīng)過夜，過G-25凝膠柱純化。5)熒光標(biāo)記物制備用O. 025mol/L, pH9. O的碳酸鹽緩沖液將群勃龍單克隆抗體稀釋成I %質(zhì)量百分比濃度；根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加O. Olmg FITC，用分析天平準(zhǔn)確稱取所需的FITC粉末。用同一緩沖液將FITC配成O. lmg/ml的溶液，按上述抗體溶液體積的3-5倍，混入FITC稀釋液；在4 。C避光條件下電磁攪拌、標(biāo)記30-48h ;將標(biāo)記溶液3000r/min，室溫離心20min，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再pH7. 4的PBS緩沖液透析2-3天，期間至少更換透析液3次；取透析過夜的標(biāo)記物,通過SephadexG-25或G_50柱，分離游離熒光素，收集標(biāo)記的熒光標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，分裝，貯存于4°C冰箱中。6)分離試劑制備a)磁珠活化
表面-COOH基團(tuán)的磁珠(購(gòu)于DYNALJigS 2. 8 μ m)，其含量是O. 15eq/g;取100 μ I 磁珠,用 100 μ I 25mmol/L, pH5. 0,0. 05% Tween_20MES 溶液洗漆兩次,磁分離后移除上清；使用前，用4°C貯存的25mmol/L MES溶液分別配置50mmol/L的EDC、NHS溶液；分別加入50 μ I新配置的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勻，室溫活化30min ；離心管置于磁分離架 上磁分離4min,移除上清,加入100 μ I, 25mmol/L,pH5. O,MES清洗2_3次后即可得表面羧基活化的磁珠。b)磁珠偶聯(lián)羊抗FITC單克隆抗體將50-100 μ g羊抗FITC單克隆抗體溶解到60 μ 1，25mmol/L，pH5. OMES中，用所述MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100 μ 1，輕柔混勻磁珠與抗體；室溫條件下至少偶聯(lián)30min或4V偶聯(lián)2h，該期間可利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài)；離心管置于磁分離架上磁分離3-5min，移除上清；為了淬滅未反應(yīng)的-C00H，可加入100 μ 1，ρΗ7. 4，TRIS反應(yīng)15min或100μ 1，ρΗ8· 0，含有 50mmol/L 乙醇胺的 PBS 封閉磁珠；用 100 μ 1,0. 1-0. 3% BSA, O. 1% Tween-20的PBS或TRIS清洗封閉好的磁珠3-5次；最后將磁珠復(fù)溶于含O. 1-0. 5% BSA, O. 01-0. I %Tween-20,0. 02% NaN3 的 PBS 或 TRIS 緩沖液中，2_8°C保藏。實(shí)施例二試劑盒的組建組建檢測(cè)群勃龍的磁顆粒化學(xué)發(fā)光試劑盒，使其含有下列組分FITC標(biāo)記的群勃龍單克隆抗體的熒光標(biāo)記物ABEI標(biāo)記的群勃龍半抗原的發(fā)光標(biāo)記物表面包被羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠的分離試劑群勃龍標(biāo)準(zhǔn)品溶液(Ong/ml,O.Olng/ml,O. 03ng/ml,0. lng/ml,O. 5ng/ml, I. Ong/ml)，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為pH7. 4,0. 03% NaN3,0. lmol/LPBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。群勃龍質(zhì)控品溶液濃度分別為0. 02ng/ml，0. 8ng/ml，質(zhì)控品稀釋液pH7. 4，0. 03% NaN3,0. lmol/LPBS緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。濃縮洗液為PH7. 2,0. 2-0. 4% Tween-20,0. 2-0. 4% NaN3,0. 1-0. 2mol/L PBS 緩沖液。所述百分含量為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例三實(shí)際樣品中群勃龍的檢測(cè)I、樣本前處理(一 )飼料、組織(雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等)前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)組織、飼料樣本；稱取2. 0±0. 05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中加入IOml乙腈-0. IM氫氧化鈉溶液，用振蕩器振蕩10min，3000g以上，室溫(20_25°C )離心IOmin ;移取0. 5ml上清液至50ml聚苯乙烯離心管中，加入0. 5ml 0. IM氫氧化鈉溶液，振蕩后加入5ml三氯甲烷，用渦旋儀渦動(dòng)2min，3000g以上，室溫(20_25°C )離心lOmin。(如果樣本出現(xiàn)乳化現(xiàn)象需在70°C水浴2-4min，再次離心直至下層清亮為止)；除去上層，取Iml下層清亮有機(jī)相至IOml干凈的玻璃試管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；用Iml復(fù)溶液工作液溶解干燥的殘留物；取50μ I水相用于分析，樣本稀釋倍數(shù)50。( 二)尿液前處理方法取2ml尿液到離心管中，將尿液于3000g以上，室溫(20_25°C )離心5min，直至尿液樣本清亮；移取Iml清亮尿液樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入10 μ !Glucuronidase/Arylsulfatase (葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶)，在37°C水解2h,加入5ml三氯甲燒,用振蕩器振蕩5min,3000g以上,室溫(20_25°C )離心IOmin ;去除上層,取Iml下層清亮有機(jī)相至IOml干燥的玻璃試管中，于50 60°C水浴氮?dú)饬飨麓蹈?；用Iml復(fù)溶工作液溶解干燥的殘留物；取50μ I水相用于分析，樣本稀釋倍數(shù)5。2、用試劑盒檢測(cè)與結(jié)果分析分別吸取20 μ 1-100 μ I標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標(biāo)記物，再加20 μ 1-100 μ I熒光素標(biāo)記物，充分混勻后，37°C溫育15min ;加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150 μ 1，混勻后在37°C溫育5min ;用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500 μ I沖洗復(fù)合物沉淀；所得分離好的復(fù)合物直接放入測(cè)量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測(cè)發(fā)出的相對(duì)光強(qiáng)度(RLU)，樣本中群勃龍的含量與 RLU成一定比例關(guān)系，可以通過RLU結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算群勃龍的濃度。激發(fā)底物I是NaOH，激發(fā)底物2是H2O2。底物裝載前，用蒸餾水清洗底物泵10-20遍，排空管道內(nèi)殘存的水跡后，再將相應(yīng)的底物直接放入儀器內(nèi)，將泵管插入底物瓶中；用底物沖洗管道5次，并測(cè)定底物的RLU值，正常情況下，底物的RLU值不應(yīng)超過1200。若超過1200，需重新用蒸餾水對(duì)管道和底物泵進(jìn)行更多次清洗，直至空白值降至合理范圍內(nèi)。若超過三天不做實(shí)驗(yàn)，需卸載底物瓶，并蓋上蓋子，以防蒸發(fā)。隨后用蒸餾水清洗管道，并排空，以免強(qiáng)堿溶液腐蝕底物泵。本發(fā)明采用6 個(gè)群勃龍標(biāo)準(zhǔn)品(Ong/ml,O. Olng/ml,O. 03ng/ml,0. lng/ml,O. 5ng/ml, I. Ong/ml)進(jìn)行曲線測(cè)繪。儀器根據(jù)所述方法檢測(cè)得到一條RLU值與群勃龍濃度相關(guān)的定標(biāo)曲線，此后測(cè)量中，每一個(gè)樣本中的群勃龍濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較得出樣本中的群勃龍含量。實(shí)施例四試劑盒質(zhì)量的測(cè)定I、試劑盒的靈敏度試劑盒靈敏度的定義為測(cè)定20次零標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差。該試劑盒的靈敏度為O. Olng/ml。2、樣本的準(zhǔn)確度和精密度準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與真值間的符合程度，試劑盒準(zhǔn)確度常用回收率表示。精密度又稱可重復(fù)性，常用變異系數(shù)表示。按照實(shí)施例三的樣本提取方法，以lng/g、2ng/g兩個(gè)濃度的群勃龍對(duì)雞肉進(jìn)行添力口，以O(shè). lng/ml,O. 2ng/ml兩個(gè)濃度的群勃龍對(duì)尿液樣本進(jìn)行添加回收，每種樣本每個(gè)濃度各4個(gè)平行，用三批試劑盒進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣本的平均回收率及精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表。表I準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定ng/g (ml)
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)群勃龍的磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述的分離試劑是包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的順磁性納米微珠是里面包覆有Fe3O4或Y -Fe2O3,表面含有_0H、-COOH或-NH2活性基團(tuán)的微珠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述的發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾衍生物標(biāo)記的群勃龍半抗原。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于所述的異魯米諾發(fā)光標(biāo)記物是ABEI、AHEI 或 AffiN。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)液、質(zhì)控品和濃縮洗液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的試劑盒，其特征在于所述的熒光素標(biāo)記物是FITC標(biāo)記的群勃龍單克隆抗體。
8.一種利用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測(cè)群勃龍的方法，包括下列步驟 1)分別吸取20μ 1-100 μ I標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，然后加入20 μ 1-100 μ I發(fā)光標(biāo)記物，再加.20 μ 1-100 μ I突光素標(biāo)記物,充分混勻后,37°C溫育15min ； 2)加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80-150μ 1，混勻后在37°C溫育5min ； 3)用磁分離架分離5min，棄上清后用清洗液300-500μ I沖洗復(fù)合物沉淀； 4)上述清洗步驟重復(fù)2-4次； 5)4)所得分離好的復(fù)合物直接放入測(cè)量暗箱，加入激發(fā)底物I和激發(fā)底物2，延遲3-5s后檢測(cè)發(fā)出的相對(duì)光強(qiáng)度(RLU)，樣本中群勃龍的含量與RLU成一定比例關(guān)系，可以通過RLU集合標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算群勃龍的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)群勃龍的磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒，包括的試劑有發(fā)光標(biāo)記物、熒光素標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、分離試劑。發(fā)光標(biāo)記物是異魯米諾發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的群勃龍半抗原，熒光標(biāo)記物是指熒光素或其衍生物標(biāo)記的群勃龍單克隆抗體，分離試劑是指包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠。本發(fā)明還涉及一種采用所述的試劑盒檢測(cè)動(dòng)物源性食品中群勃龍的方法，本方法對(duì)群勃龍檢測(cè)具備較高的靈敏度、特異性和較快的檢測(cè)速度。
文檔編號(hào)G01N33/533GK102928592SQ20111022746
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2011年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月9日
發(fā)明者馮才偉, 羅曉琴, 馮月君, 扶勝, 聶雯瑩, 張荃 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司