專利名稱：用于單細(xì)胞檢測的多功能探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于單細(xì)胞檢測領(lǐng)域的多功能探針，特別涉及玻璃管表面的薄膜熱電偶的制作，PH敏感微電極以及離子濃度微電極制作。
背景技術(shù)：
人們對生命現(xiàn)象的觀察和研究已經(jīng)深入到單細(xì)胞、單分子的水平，如何在這樣一個尺度范圍內(nèi)獲取有用的生物理化信息對各個研究領(lǐng)域均提出了新的要求。單細(xì)胞檢測技術(shù)的應(yīng)用漸漸成為現(xiàn)代分析研究的主流領(lǐng)域之一。可進(jìn)行實時、在線、原位、活體檢測的分子探針和超微型生物傳感器成為人們研究的熱點和重點。其中德國馬普生物物理研究所Neher和^tkmarm在1976年創(chuàng)建了膜片鉗技術(shù)，這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細(xì)胞膜單一的(或多個的離子通道分子活動的技術(shù))。以后由于吉?dú)W姆阻抗封接方法的確立和幾種方法的創(chuàng)建。這種技術(shù)點燃了細(xì)胞和分子水平的生理學(xué)研究的革命之火，它和基因克隆技術(shù)并架齊驅(qū)，給生命科學(xué)研究帶來了巨大的前進(jìn)動力。這一偉大的貢獻(xiàn)，使Neher和Mkmarm獲得1991年度的諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎。發(fā)展至今，已經(jīng)成為現(xiàn)代細(xì)胞電生理的常規(guī)方法，它不僅可以作為基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究的工具，而且直接或間接為臨床醫(yī)學(xué)研究服務(wù)，目前膜片鉗技術(shù)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)(腦) 科學(xué)、心血管科學(xué)、藥理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、病理生理學(xué)、中醫(yī)藥學(xué)、植物細(xì)胞生理學(xué)、運(yùn)動生理等多學(xué)科領(lǐng)域研究?；谀てQ技術(shù)，在探測細(xì)胞膜離子電流的同時測量其他的生物信號，如細(xì)胞內(nèi)的溫度、PH值、離子濃度等，則可為研究單細(xì)胞的生命過程提供更多的理化參數(shù)，為單細(xì)胞基礎(chǔ)研究提供研究工具，也可作為藥物篩選提供高效的工具。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種用于單細(xì)胞檢測的多功能探針，可同時檢測多種生理信號的單細(xì)胞探針，為測量單細(xì)胞理化參數(shù)和研究細(xì)胞生命過程提供新的研究工具。技術(shù)方案本發(fā)明的用于單細(xì)胞檢測的多功能探針包括細(xì)胞內(nèi)測溫薄膜熱電偶和三個微電極，所述的三個微電極為膜電位測量和離子通道檢測微電極，PH值測量微電極， 離子濃度檢測微電極；所述三個微電極都為圓錐形，三個微電極緊靠在一起，三個微電極的圓錐尖位于同一方向；所述測溫薄膜熱電偶由兩種金屬薄膜和絕緣層組成，其中兩種金屬薄膜在三個微電極的外側(cè)尖端形成測溫結(jié)，其余部分相互絕緣。三個微電極通過含有三內(nèi)管芯的玻璃管熱處理拉制而成。所述PH值測量微電極，采用PH敏感液膜、PH敏感玻璃或固態(tài)PH傳感器實現(xiàn)。所述離子濃度測量微電極，采用離子敏感玻璃或離子敏感聚合物膜。所述的測溫薄膜熱電偶，采用可濺射或蒸鍍的靶材；其中選擇鉬-鎢、鉬-金、 鉬-銀或鉬-銅在常溫下有較大熱電動勢差的金屬材料對，或使用銅鎳-銅、鉬銠-鉬、鎳鉻-銅鎳商用合金材料對。所述所述絕緣層采用SiA或MgO，通過磁控濺射絕緣材料實現(xiàn)。有益效果通過此方法得到的單細(xì)胞檢測探針，在實現(xiàn)傳統(tǒng)的離子通道、膜電位測量功能的同時，也可實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外溫度的測量，以及細(xì)胞內(nèi)PH值和離子濃度。其中溫度測量功能提供的溫度反饋也進(jìn)一步的提高了 PH值測量的精度。


圖1是本發(fā)明多功能探針結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明第二步，在其中一根微管內(nèi)使用PH敏感玻璃和使用PH敏感材料液膜。圖3是本發(fā)明第三步，在其中一根微管內(nèi)使用離子敏感玻璃和離子敏感聚合物膜。圖4是本發(fā)明第四步，在玻璃電極外側(cè)制作的薄膜熱電偶。以上圖中包含測溫薄膜熱電偶11，膜電位測量和離子通道檢測微電極12，PH值測量微電極13，離子濃度檢測微電極14 ；玻璃微電極21，PH敏感玻璃22，PH敏感玻璃尖端封接23，PH敏感玻璃和玻璃微電極內(nèi)壁封接M，PH敏感液膜25 ；玻璃微電極31，離子敏感玻璃32，離子敏感玻璃尖端封接33，離子敏感玻璃和玻璃微電極內(nèi)壁封接34，離子濃度敏感聚合物膜35 ；玻璃微電極41，薄膜熱電偶42 ；金屬薄膜一 43，絕緣層44，金屬薄膜二 45。
具體實施例方式本發(fā)明用于單細(xì)胞檢測的多功能探針，包括細(xì)胞內(nèi)測溫薄膜熱電偶11和三個微電極，所述的三個微電極為膜電位測量和離子通道檢測微電極12，PH值測量微電極13， 離子濃度檢測微電極14 ；所述三個微電極都為圓錐形，三個微電極緊靠在一起，三個微電極的圓錐尖位于同一方向；所述測溫薄膜熱電偶11由兩種金屬薄膜和絕緣層組成，其中兩種金屬薄膜在三個微電極的外側(cè)尖端形成測溫結(jié)，其余部分相互絕緣。其中三根管芯分別實現(xiàn)膜片鉗基本功能(膜電位測量、離子通道、微注射)，PH測量功能，離子濃度測量功能。制備方法為第一步通過玻璃電極拉制儀拉制三芯玻璃電極，通過熱拋光處理，使電極尖端變得更加光滑，從而可提高與細(xì)胞膜的封接率。第二步，在其中一根微管內(nèi)集成PH敏感傳感器，可以使用PH敏感玻璃，采用熱封接的方法，或者采用PH敏感材料液膜法。第三步，在其中另一根微管內(nèi)集成離子濃度敏感傳感器?？梢允褂秒x子敏感玻璃， 和離子敏感材料聚合物膜。第四步，在玻璃電極外側(cè)，使用濺射或蒸鍍的方法，制備金屬薄膜以及絕緣層。實例首先選用含三內(nèi)管的硼硅酸玻璃管，IOcm長，單管外徑1mm，內(nèi)徑0. 75mm，無細(xì)絲。 在玻璃電極拉制儀上拉制出尖端直徑為Ium的玻璃微電極，通過熱拋光處理使電極尖端變得更加光滑，從而可提高封接率。其次選用PH敏感玻璃管和鉀離子敏感玻璃管，長10cm，管外徑為0. 7mm,內(nèi)徑為0.35mm，無細(xì)絲。通過玻璃電極拉制儀拉制出尖端直徑0. 2um的玻璃電極，通過環(huán)形熱處理，使尖端封接閉合?？刂苾筛Ａ㈦姌O插入含三內(nèi)管的玻璃電極中的其中兩根，并緩緩插入至最尖端。然后在兩根電極的末端通入氮?dú)獠⒕S持一定的氣壓，同時利用熱處理對其進(jìn)行加熱，使內(nèi)管外壁和外管內(nèi)壁封接。 通過磁控濺射在硼硅酸玻璃管外壁濺射IOOnm厚的鉬金屬薄膜，鉬金屬薄膜外側(cè)濺射覆蓋20nm厚的S^2絕緣層，通過離子束刻蝕去除尖端SiO2層，使鉬金屬薄膜在玻璃管尖端裸露出來，在最外層濺射IOOnm厚的金薄膜。這樣就在硼硅酸玻璃管外壁尖端形成了鉬-金熱電偶測溫結(jié)。
權(quán)利要求
1.一種用于單細(xì)胞檢測的多功能探針，其特征在于該探針包括細(xì)胞內(nèi)測溫薄膜熱電偶 (11)和三個微電極，所述的三個微電極為膜電位測量和離子通道檢測微電極(12)，PH值測量微電極(13)，離子濃度檢測微電極(14)；所述三個微電極都為圓錐形，三個微電極緊靠在一起，三個微電極的圓錐尖位于同一方向；所述測溫薄膜熱電偶(11)由兩種金屬薄膜和絕緣層組成，其中兩種金屬薄膜在三個微電極的外側(cè)尖端形成測溫結(jié)，其余部分相互絕緣。
2.按權(quán)利要求1所述的用于單細(xì)胞檢測的多功能探針，其特征在于，三個微電極通過含有三內(nèi)管芯的玻璃管熱處理拉制而成。
3.按權(quán)利要求1所述的用于單細(xì)胞檢測的多功能探針，其特征在于，所述PH值測量微電極(13)，采用PH敏感液膜、PH敏感玻璃或固態(tài)PH傳感器實現(xiàn)。
4.按權(quán)利要求1所述的用于單細(xì)胞檢測的多功能探針，其特征在于，所述離子濃度測量微電極(14 )，采用離子敏感玻璃或離子敏感聚合物膜。
5.按權(quán)利要求2所述的用于單細(xì)胞檢測的多功能探針，其特征在于所述的測溫薄膜熱電偶(11)，采用可濺射或蒸鍍的靶材；其中選擇鉬一鶴、鉬-金、鉬-銀或鉬-銅在常溫下有較大熱電動勢差的金屬材料對，或使用銅鎳-銅、鉬銠-鉬、鎳鉻-銅鎳商用合金材料對。
6.按權(quán)利要求2所述的用于單細(xì)胞檢測的多功能探針，其特征在于所述所述絕緣層采用SiO2或1%0，通過磁控濺射絕緣材料實現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明所述用于單細(xì)胞檢測的多功能探針包括溫度測量、膜電位測量和離子通道檢測、pH檢測、離子濃度檢測。該探針包括細(xì)胞內(nèi)測溫薄膜熱電偶(11)和三個微電極，所述的三個微電極為膜電位測量和離子通道檢測微電極(12)，pH值測量微電極(13)，離子濃度檢測微電極(14)；所述三個微電極都為圓錐形，三個微電極緊靠在一起，三個微電極的圓錐尖位于同一方向；所述測溫薄膜熱電偶(11)由兩種金屬薄膜和絕緣層組成，其中兩種金屬薄膜在三個微電極的外側(cè)尖端形成測溫結(jié)，其余部分相互絕緣?？梢詫崿F(xiàn)多參數(shù)的共同測量，有助于更好的研究亞細(xì)胞層面的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)。
文檔編號G01N27/30GK102262113SQ20111021191
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月27日
發(fā)明者汪長嶺, 顧寧 申請人:東南大學(xué)