專(zhuān)利名稱(chēng)：一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的pcr-dgge技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的PCR-DGGE技術(shù)，屬轉(zhuǎn)基因生物安全性評(píng)估和微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1983年世界上首例轉(zhuǎn)基因植物獲得成功以來(lái)，利用基因工程對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行改良和優(yōu)化后在提高產(chǎn)量、改善農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分、縮短育種周期、增強(qiáng)抗病蟲(chóng)性等方面均取得了巨大成就。許多轉(zhuǎn)基因作物如玉米、棉花、大豆等已經(jīng)進(jìn)入了商業(yè)化生產(chǎn)。然而這些轉(zhuǎn)入了外源基因的作物是否會(huì)給人們帶來(lái)不可預(yù)料的風(fēng)險(xiǎn)卻備受爭(zhēng)議，轉(zhuǎn)基因作物的安全問(wèn)題也是目前國(guó)際社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化的重要場(chǎng)所，土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定與否直接關(guān)系到賴(lài)以其生存的作物的生長(zhǎng)和發(fā)育，并最終影響到整個(gè)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。土壤生態(tài)系統(tǒng)中蘊(yùn)含著極其豐富的微生物群落，參與土壤中諸多生物化學(xué)過(guò)程、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)、有機(jī)物的分解轉(zhuǎn)化等，是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化及有機(jī)物質(zhì)分解的基礎(chǔ)。土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)中起著舉足輕重的作用，是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其多樣性與活性的保持是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)健康、穩(wěn)定的基礎(chǔ)，因此，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)及功能的影響具有重要的生態(tài)學(xué)意義。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于轉(zhuǎn)Bt基因水稻對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究主要采用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法，誤差極大，遠(yuǎn)不如分子生物學(xué)方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、直觀。變形梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)因穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好，靈敏度高，能提供群落中優(yōu)勢(shì)種群信息并且可同時(shí)分析多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)Bt基因作物對(duì)根際土壤微生物安全性評(píng)價(jià)的報(bào)道較少，建立適用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)Bt基因作物對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的PCR-DGGE技術(shù)，對(duì)于完善轉(zhuǎn)基因作物土壤生態(tài)安全評(píng)價(jià)技術(shù)體系至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種快速、穩(wěn)定、直觀的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的PCR-DGGE技術(shù)，以解決傳統(tǒng)培養(yǎng)方法工作量繁重、誤差大、 不全面、分辨水平低等問(wèn)題，從而將PCR-DGGE技術(shù)成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物對(duì)根際土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)中。本發(fā)明根據(jù)植物根際土壤特性，結(jié)合土壤微生物多樣性研究方法，摸索出一種適用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生物群落影響的PCR-DGGE技術(shù)體系，該技術(shù)可以不經(jīng)過(guò)培養(yǎng)而直接提取根際土壤微生物基因組總DNA。DNA分子的種類(lèi)及相對(duì)比例可以反應(yīng)土壤樣品中微生物種群的數(shù)量及相對(duì)比例，使在獲得的DGGE圖譜中，每一條帶可以代表一種微生物的基因組DNA片段，即條帶信息反應(yīng)該樣品微生物群落組成，這樣根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)信息就被間接的記錄在DGGE圖譜上，分析該圖譜并結(jié)合聚類(lèi)分析就可以比較分析轉(zhuǎn)基因作物對(duì)根際土壤微生物群落的影響。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明所述的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的PCR-DGGE技術(shù)， 具體包括以下步驟1)收集不同生育期的轉(zhuǎn)基因作物、非轉(zhuǎn)基因作物的根際土壤樣品，進(jìn)行基因組 DNA提取通過(guò)采用酶裂解、化學(xué)裂解并結(jié)合反復(fù)凍融裂解法，以及重復(fù)氯仿、異戊醇抽提步驟，有效提高了細(xì)胞裂解效率和DNA得率，并減少了土壤中腐植酸、有機(jī)分子等雜質(zhì)對(duì)核酸提取和PCR擴(kuò)增過(guò)程的抑制作用，提高了所得DNA的純度。其中，所述的生育期包括苗期、分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期；所述的轉(zhuǎn)基因作物優(yōu)選轉(zhuǎn)Bt基因作物，更優(yōu)選轉(zhuǎn)Bt基因水稻。2)分別用細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌的特異性引物對(duì)對(duì)上述提取的各基因組DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序采用降落PCR由于DGGE電泳要求在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段，擴(kuò)增所用一條引物的5’-端含有一段約40bp的GC夾子，其退火溫度較高，使得使用常規(guī)的PCR擴(kuò)增方法效率較低。因此，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種降落PCR擴(kuò)增方法，即以高于退火溫度10°C的溫度為起點(diǎn)，每個(gè)循環(huán)降低0. 5°C，反應(yīng)20個(gè)循環(huán)后溫度降為退火溫度，在此退火溫度下再進(jìn)行15 個(gè)循環(huán)，從而大大提高了 PCR擴(kuò)增質(zhì)量及擴(kuò)增效率。具體來(lái)講，本發(fā)明采用種群特異性引物，即細(xì)菌引物對(duì)341f_GC/518r、真菌引物對(duì) NS7-GC/NS8、放線(xiàn)菌引物對(duì)R513-GC/F243分別針對(duì)性的研究了不同生育期轉(zhuǎn)Bt基因和非轉(zhuǎn)Bt基因作物根際土壤中主要的三大類(lèi)微生物群落的結(jié)構(gòu)。其中細(xì)菌引物對(duì)序列如下341f-GC :cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cctacgggag gcagca (參看 SEQ ID No 1)；518r :gtattaccgc ggctgctgg(參看 SEQ ID No 2)；真菌引物對(duì)序列如下NS7-GC :cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccc aggcaataac aggtctg (參看 SEQ ID No 3)；NS8 :tccgcaggtt cacctacgga(參看 SEQ ID No 4)；放線(xiàn)菌引物對(duì)序列如下R513-GC :cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccc cgcggctgct ggcacgta (參看 SEQ ID No 5)；F243 :ggatgagccc gcggccta (參看 SEQ ID No 6)。PCR 反應(yīng)體系(50μ 1) :2. 5mmol/l MgCl2,0. 2mmol/l dNTPs，0. 2pmol/L 引物， IXPCR buffer (試劑盒)，IU Taq DNA聚合酶(試劑盒)，1 μ 1 DNA模板，ddH20補(bǔ)齊。每個(gè)基因組樣品平行擴(kuò)增3管，混合之后用于后續(xù)試驗(yàn)。降落PCR擴(kuò)增程序94 V解鏈5min ；94 V解鏈45s，55 °C (細(xì)菌)/50 V (真菌)/63°C (放線(xiàn)菌)退火45s，72°C延伸45s，運(yùn)行32個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。3)DGGE電泳分離得指紋印記圖譜^t DCode Universal Mutation Detection System(Bio-Rad)巾iiif DGGE ^}。 具體為在7. 5%的聚丙烯酰胺凝膠上，200V電壓、60°C溫度下運(yùn)行5個(gè)小時(shí)，細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌DGGE電泳的變性劑濃度梯度分別是20-70%、30-60%和30_70%。其中100%變性劑中含有7M的尿素和40% (ν/ν)的去離子甲酰胺。電泳后，在400ml 0. 25 μ g/ml的溴化乙錠溶液中染色，洗滌數(shù)次后于Gel Doc2000紫外凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)上成像檢測(cè)。4)對(duì)圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理及聚類(lèi)分析首先應(yīng)用Bio-rad的Quantity One軟件獲得DGGE圖譜的數(shù)字化信息，然后使用 NTSYSpc軟件分析獲得UPGMA聚類(lèi)圖，從而直觀比較轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因親本作物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。有益效果本發(fā)明建立了一種適用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的 PCR-DGGE技術(shù)體系，為轉(zhuǎn)基因植物的土壤微生物安全性評(píng)價(jià)體系的建立提供了新的思路和依據(jù)。此方法直接提取根際土壤樣品中總DNA，避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)過(guò)程中的篩選和富集作用， 能更真實(shí)、直接的反應(yīng)根際土壤樣品中微生物多樣性及群落組成情況，與傳統(tǒng)方法相比，節(jié)省了大量時(shí)間和財(cái)力，避免了傳統(tǒng)方法菌種培養(yǎng)和篩選過(guò)程導(dǎo)致的微生物信息的缺失。另外此方法又可同時(shí)分析多個(gè)土壤樣品，從而更直觀、客觀地分析不同樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)差異。


圖1為不同生育期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻親本根際土壤DNA提取的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000，1 10依次為苗期Bt，苗期non Bt ； 分蘗Bt，分蘗non Bt ；拔節(jié)Bt，拔節(jié)non Bt ；抽穗Bt，抽穗non Bt ；成熟Bt，成熟non Bt。 其中苗期Bt指苗期轉(zhuǎn)Bt基因水稻，苗期non Bt指苗期非轉(zhuǎn)Bt基因水稻，其他類(lèi)推。圖2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中A為細(xì)菌，B為真菌，C為放線(xiàn)菌； M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，0為空白對(duì)照，1 10與圖1所述相同。圖3為不同生育期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻親本根際土壤細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌的DGGE電泳圖，其中A為細(xì)菌，B為真菌，C為放線(xiàn)菌；1-10與圖1所述一致。圖4為不同生育期的轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻親本根際土壤細(xì)菌、真菌、 放線(xiàn)菌的UPGMA聚類(lèi)圖，其中A為細(xì)菌，B為真菌，C為放線(xiàn)菌，其中苗期Bt指苗期轉(zhuǎn)Bt基因水稻，苗期non Bt指苗期非轉(zhuǎn)Bt基因水稻，其他類(lèi)推。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，所述實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1
以轉(zhuǎn)Bt基因水稻為研究對(duì)象，采用PCR-DGGE技術(shù)研究盆栽條件下不同生育期 (如苗期、分蘗、拔節(jié)、抽穗、成熟)下該轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻親本根際土壤的微生態(tài)安全性情況。1)轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤微生物基因組DNA的提取分別提取轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因親本水稻在各個(gè)生育期的根際土壤，采用反復(fù)凍融法進(jìn)行DNA提取將0. 5g樣品放入2ml離心管中，加入Iml抽提緩沖液(lOOmmol/L Tris-HCl, 1 OOmmo 1/L EDTA (pH 8. 0)，IOOmmol/L 磷酸鈉緩沖液(pH 8. 0)，1. 5mol/L NaCl，
CTAB)，加入 50 μ 1 濃度為 100mg/ml 的溶菌酶，37°C水浴 IOmin ；加入 200 μ 1 20% SDS, 65°C水浴0. 5h ；6000Xg離心5min ；取上清液，分別置于_70°C超低溫冰箱中及微波爐中反復(fù)凍融三次，6000Xg離心5min;上清液中加入等體積氯仿異戊醇(體積比對(duì)1)， 6000Xg離心lOmin，收集上層水相，重復(fù)抽提一次；加入0. 6倍等體積異丙醇過(guò)夜沉淀， 12000Xg離心IOmin ；沉淀用70%預(yù)冷的冰乙醇洗滌1次，室溫下晾干后用100 μ 1 TE溶解沉淀。應(yīng)用同樣方法，提取了非轉(zhuǎn)Bt基因水稻各個(gè)生育期的根基土壤基因組DNA。圖1為不同生育期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻親本根際土壤基因組DNA 提取的瓊脂糖凝膠電泳圖?？梢钥闯?，從根際土壤樣品中提取得到了較高質(zhì)量的的基因組 DNA，點(diǎn)樣孔無(wú)蛋白殘留，基因組無(wú)拖尾現(xiàn)象。因此，使用該方法獲得了完整、無(wú)降解、純度高的各個(gè)生育期的轉(zhuǎn)Bt基因水稻和非轉(zhuǎn)Bt基因的根際土壤基因組DNA，充分說(shuō)明該提取方法適用于轉(zhuǎn)基因植物根際土壤基因組DNA的獲取。2)分別用細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌的特異性引物對(duì)對(duì)上述提取的不同生育期的各基因組DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序采用降落PCR其中采用的特異性引物對(duì)分別為細(xì)菌引物對(duì)341f_GC/518r、真菌引物對(duì)NS7-GC/ NS8、放線(xiàn)菌引物對(duì)R513-GC/F243。細(xì)菌的引物對(duì)序列如下341f-GC :cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cctacgggag gcagca (參看 SEQ ID No 1)；518r :gtattaccgc ggctgctgg(參看 SEQ ID No 2)；真菌的引物對(duì)序列如下NS7-GC :cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccc aggcaataac aggtctg (參看 SEQ ID No 3)；NS8 :tccgcaggtt cacctacgga(參看 SEQ ID No 4)；放線(xiàn)菌的引物對(duì)序列如下R513-GC :cgcccgccgc gccccgcgcc cgtcccgccg cccccgcccc cgcggctgct ggcacgta (參看 SEQ ID No 5)；F243 :ggatgagccc gcggccta (參看 SEQ ID No 6)。PCR 反應(yīng)體系(50μ 1) :2. 5mmol/l MgCl2,0. 2mmol/l dNTPs，0. 2pmol/L 引物， IXPCR buffer (Fermentas)，IU Taq DNA 聚合酶(Fermentas)，1 μ 1 DNA 模板，ddH20 補(bǔ)齊。 每個(gè)基因組樣品平行擴(kuò)增3管，混合之后用于后續(xù)試驗(yàn)。擴(kuò)增程序如下94 V解鏈5min ；94 V解鏈45s，55 °C (細(xì)菌)/50 V (真菌)/63°C (放線(xiàn)菌)退火45s，72°C延伸45s，運(yùn)行32個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果參看圖2。可以看出三對(duì)引物對(duì)擴(kuò)增后分別獲得了長(zhǎng)度約為200bp、350bp、310bp不等的細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌DNA片段， 擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，擴(kuò)增效果良好。3)DGGE電泳分離得指紋印記圖譜將上述擴(kuò)增得到的DNA片段進(jìn)行DGGE電泳，DGGE電泳在DCode Universal Mutation Detection System(Bio-Rad)中進(jìn)行。即在7. 5%的聚丙烯酰胺凝膠上，200V電壓、60°C溫度下運(yùn)行5個(gè)小時(shí)，其中細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌DGGE電泳的變性劑(100%變性劑含有7M的尿素和40% (ν/ν)的去離子甲酰胺)濃度梯度分別是20-70^^30-60%和30-70%。 電泳后，在400ml 0. 25 μ g/ml的溴化乙錠溶液中染色，洗滌數(shù)次后于Gel Doc2000紫外凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)上成像檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯鲛D(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤細(xì)菌和放線(xiàn)菌的DGGE指紋圖譜在同一生育時(shí)期的差異不大，只有一些微弱的變化，然而真菌的DGGE圖譜差異稍微明顯；另外，在不同生育期內(nèi)轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻的根際土壤細(xì)菌、真菌及放線(xiàn)菌群落均表現(xiàn)出差異性，這可能與水稻不同生育期的生理代謝不同有關(guān)。由此可見(jiàn)，從DGGE圖譜可以直觀的分析比較轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，從而判斷轉(zhuǎn)Bt基因水稻對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響程度。4)對(duì)圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理及聚類(lèi)分析首先應(yīng)用Bio-rad的Quantity One軟件獲得DGGE圖譜的數(shù)字化信息，然后使用NTSYSpc軟件對(duì)不同生育期轉(zhuǎn)Bt水稻與非轉(zhuǎn)Bt水稻根際土壤細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌進(jìn)行 UPGMA聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果可以看出在苗期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌群落的相似性分別為83^^78^^89%,在各生育期中相似性最高；在分蘗期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤細(xì)菌和真菌群落未聚在一起，表現(xiàn)一定的差異性，而放線(xiàn)菌群落有高達(dá)80 %的相似性；在拔節(jié)期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt 基因水稻根際土壤細(xì)菌群落有80%的相似性，真菌群落相似性較低，放線(xiàn)菌群落有72%的相似性；抽穗期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌群落的相似性分別為70^,52^,80% ；在成熟期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌群落的相似性是相對(duì)各生育期中最低的，分別為61 %，41 %和72%。從上述相似性指數(shù)可以看出，轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤細(xì)菌和放線(xiàn)菌群落結(jié)構(gòu)在同一生育期內(nèi)差異較小，只有真菌群落差異稍大；在不同生育期內(nèi)三個(gè)微生物群落具有一定差異。從上述試驗(yàn)可以確定本發(fā)明所采用的土壤微生物基因組DNA提取方法、PCR擴(kuò)增方法及其DGGE電泳技術(shù)對(duì)于研究轉(zhuǎn)Bt基因作物對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響是可行的。并且本發(fā)明用非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法UPGMA聚類(lèi)分析方法比較了轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，成功地鑒別了不同生育期轉(zhuǎn)Bt基因水稻與非轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異，此方法也可應(yīng)用于評(píng)價(jià)其他轉(zhuǎn)Bt基因作物對(duì)根際土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于， 包括以下步驟1)收集不同生育期的轉(zhuǎn)基因作物、非轉(zhuǎn)基因作物的根際土壤樣品，進(jìn)行基因組DNA提??；2)分別用細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌的特異性引物對(duì)對(duì)上述提取的各基因組DNA片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序采用降落PCR;3)DGGE電泳分離得指紋印記圖譜；4)對(duì)圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理及UPGMA聚類(lèi)分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，所述的生育期包括苗期、分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因作物優(yōu)選轉(zhuǎn)Bt基因作物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，采用酶裂解、化學(xué)裂解并結(jié)合反復(fù)凍融裂解法，以及重復(fù)氯仿、異戊醇抽提步驟，進(jìn)行基因組DNA提取。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，所述細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌的特異性引物對(duì)序列如SEQ ID No 1 6所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，所述降落PCR擴(kuò)增程序以高于退火溫度10°c的溫度為起點(diǎn)，每個(gè)循環(huán)降低0. 5°C，反應(yīng)20個(gè)循環(huán)后溫度降為退火溫度，在此退火溫度下再進(jìn)行15個(gè)循環(huán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，所述DGGE電泳是在7.5 %的聚丙烯酰胺凝膠上，200V電壓、60°C溫度下運(yùn)行5個(gè)小時(shí)，細(xì)菌、真菌和放線(xiàn)菌DGGE電泳的變性劑濃度梯度分別是20-70%、30-60%和30-70%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR-DGGE技術(shù)，其特征在于，所述對(duì)圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理及聚類(lèi)分析是指首先應(yīng)用Bio-rad的Quantity One軟件獲得DGGE圖譜的數(shù)字化信息，然后使用NTSYSpc軟件做聚類(lèi)分析。
9.權(quán)利要求1 8任一項(xiàng)所述的PCR-DGGE技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的PCR-DGGE技術(shù)，具體包括以下步驟1)收集不同生育期的轉(zhuǎn)基因作物、非轉(zhuǎn)基因作物的根際土壤樣品，進(jìn)行基因組DNA提??；2)使用細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌的特異性引物對(duì)對(duì)上述提取的各基因組DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序采用降落PCR；3)DGGE電泳分離得指紋印記圖譜；4)對(duì)圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理及UPGMA聚類(lèi)分析。本發(fā)明可用于評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，并由此評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對(duì)根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)的潛在安全風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)G01N27/447GK102286618SQ20111020619
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者唐雪明, 朱宏, 王金斌, 程凱, 趙凱, 魏曼曼 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院