一種從三七根際土壤提取分離化感自毒物質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥用植物種植技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體涉及一種從三七根際土壤中提取 化感自毒物質(zhì)的方法。 技術(shù)背景
[0002] 三七[Panax notoginseng(Burk)F. H. Chen]為五加科人參屬植物，以根、根狀莖入 藥，具有活血化瘀、消腫定痛等功效。目前，三七的應用已十分廣泛，統(tǒng)計表明僅國內(nèi)就有 1300多家企業(yè)以三七為原料，獲3207個生產(chǎn)批文，生產(chǎn)400多個產(chǎn)品，其中中成藥品種超過 了 300個，幾乎涵蓋了所有的中藥制藥企業(yè)。
[0003] 三七起源于2500萬年前的第三紀古熱帶中國西南山區(qū)，分布范圍僅局限于中國 西南部海拔1500~1800m、23. 5° N附近的狹窄地帶?，F(xiàn)已未發(fā)現(xiàn)野生群體，均為栽培種。 云南省文山州為藥材三七原產(chǎn)地及道地產(chǎn)區(qū)，是目前三七的主產(chǎn)區(qū)，其栽培面積和產(chǎn)量均 占全國90%以上。2013年三七農(nóng)業(yè)產(chǎn)值達130億元，且市場份額還在迅猛擴大，市場對三七 的需求有增無減。因此，三七是云南省目前生物資源開發(fā)最成功的品種。
[0004] 與其他人參屬藥用植物一樣，三七種植忌地性極強，存在嚴重的連作障礙問題。一 般認為栽種過三七的地塊需要連續(xù)栽種玉米、旱稻、苜蓿等作物10年以上才能再次種植 三七。市場需求的驅(qū)動，加之連作障礙暫無有效克服辦法導致三七傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)的適宜土地逐 漸緊張，種植區(qū)不斷外延，藥材生產(chǎn)的道地性難以保證。
[0005] 現(xiàn)一般認為，連作障礙成因主要有：（1) 土壤微生物群落的改變，病原微生物增 加，有益微生物減少，土傳病蟲害加??；（2)化感物質(zhì)引起的自毒作用；（3) 土壤鹽漬化和酸 漬化加重及土壤養(yǎng)分等理化性狀的改變等（陳長寶，人參化感作用及其忌連作機制研宄， 博士學位論文，吉林農(nóng)業(yè)大學，2006,2 - 9)。土壤環(huán)境災變或惡變是三七不能連作的主要原 因，當然可能與三七自身的適應能力也有關(guān)聯(lián)。
[0006] 然而，土壤環(huán)境災變的驅(qū)動因素又來源于三七本身，即三七的栽種改變了土壤環(huán) 境，而改變的土壤環(huán)境超越了三七本身的適應和調(diào)整能力，從而使得三七不能連作。因此， 研宄三七連作驅(qū)動的土壤環(huán)境變化是解析連作障礙形成機制的有效途徑。目前大多數(shù)關(guān)于 三七連作障礙成因的研宄都是從土壤環(huán)境變化中尋找答案。而化感自毒物質(zhì)是導致土壤災 變的核心原因，化感自毒物質(zhì)是指某些植物通過雨霧淋溶、根系分泌及殘茬降解而釋放的 一類對同茬或再茬同種或同科植物產(chǎn)生生長抑制作用的一類化合物。這些化合物雖然分子 量較小，結(jié)構(gòu)簡單，但釋放到土壤環(huán)境中后，不僅會改變植物根際土壤的理化性質(zhì)，同時對 根際土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)造成影響，最終導致植物生長受到抑制或直接致其死亡。因此， 探索一種快速并有效提取分析三七根際土壤中化感自毒物質(zhì)組成的方法對探宄三七連作 障礙產(chǎn)因，及緩解并克服三七連作障礙效應有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供的一種從三七根際土壤提取化感自毒物質(zhì)，并對其提取物進 行有效分離的方法。
[0008] 本發(fā)明的主要內(nèi)容包括：三七根際土壤的采集、土壤樣品的處理、土壤樣品的提 取、及化感物質(zhì)的分離，具體技術(shù)方案如下：
[0009] -種從三七根際土壤中提取分離化感自毒物質(zhì)的方法，其特征在于：
[0010] (1) 土壤樣品采集：通過交叉五點法在種植三七三年的土地中進行土壤采集，取 三七植株根際土壤樣品；
[0011] ⑵土壤樣品處理：將步驟⑴所采集的土壤樣品帶回室內(nèi)，風干，除雜，過l-2mm 篩，裝入自封袋中，貼上標簽，待用；
[0012] (3)稱取經(jīng)步驟（2)處理的土壤樣品20g，置于200ml甲醇中，所述甲醇為分析純， 超聲處理30min ;用濾紙過濾，收集濾液，所收集的濾液即為提取得到的化感自毒物質(zhì)提取 液；于4°C保存，待測；
[0013] (4)將步驟⑶所保存的濾液用高效液相色譜法進行分離，色譜條件為：色譜儀 為 Agilent 1260,色譜柱為 Agilent Zorbax SB_C18、250mmX 4. 6mm、5 μ m，流動相 A 為質(zhì)量 分數(shù)為0. 1 %的H3PO4水溶液，流動相B為甲醇，所述甲醇為色譜純，流速1.0 ml/min，柱溫 25°C，檢測波長203nm，并按如下表1所述梯度洗脫參數(shù)進行梯度洗脫，分離得到的單個色 譜峰對應的物質(zhì)即代表具有化感自毒效應的單個化合物，
[0014] 表1梯度洗脫參數(shù)表
[0015]
【主權(quán)項】
1. 一種從三七根際土壤中提取分離化感自毒物質(zhì)的方法，其特征在于： (1) 土壤樣品采集：通過交叉五點法在種植三七三年的土地中進行土壤采集，取三七 植株根際土壤樣品； (2) 土壤樣品處理：將步驟（1)所采集的土壤樣品帶回室內(nèi)，風干，除雜，過l-2mm篩， 裝入自封袋中，貼上標簽，待用； (3) 稱取經(jīng)步驟⑵處理的土壤樣品20g，置于200ml甲醇中，所述甲醇為分析純，超聲 處理30min;用濾紙過濾，收集濾液，所收集的濾液即為提取得到的化感自毒物質(zhì)提取液， 于4°C保存，待測； (4) 將步驟（3)所保存的濾液用高效液相色譜法進行分離，色譜條件為：色譜儀為 Agilent1260,色譜柱為AgilentZorbaxSB_C18、250mmX4. 6mm、5iim，流動相A為質(zhì)量 分數(shù)為0. 1 %的H3P04水溶液，流動相B為甲醇，所述甲醇為色譜純，流速1.Oml/min，柱溫 25°C，檢測波長203nm，并按如下表1所述梯度洗脫參數(shù)進行梯度洗脫，分離得到的單個色 譜峰對應的物質(zhì)即代表具有化感自毒效應的單個化合物， 表1梯度洗脫參數(shù)表
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【專利摘要】本發(fā)明公開一種從三七根際土壤提取分離化感自毒物質(zhì)的方法，包括土壤樣品采集，處理，稱取經(jīng)處理的土壤樣品20g，用甲醇提取，超聲處理，用高效液相色譜法對化感自毒物質(zhì)進行分離，色譜條件為：色譜儀為Agilent 1260，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18、250mm×4.6mm、5μm，流動相A為質(zhì)量分數(shù)為0.1％的H3PO4水溶液，流動相B為甲醇,流速1.0ml/min，柱溫25℃，檢測波長203nm，并進行梯度洗脫。經(jīng)實驗證明，本發(fā)明方法提取分離獲得的化感自毒物質(zhì)種類最多，且這種方法簡便易行，減少了對樣品提取過程中繁復提取工藝造成的提取溶劑對樣品中目標化合物的干擾和損失。
【IPC分類】G01N30-06
【公開號】CN104807925
【申請?zhí)枴緾N201510136116
【發(fā)明人】陳軍文, 孫雪婷, 龍光強, 馬春花, 張廣輝, 趙明, 徐祥增, 孟珍貴, 李龍根
【申請人】云南農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年3月26日