專利名稱：一種精子頂體酶活性定量檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于體外檢測的方法及裝置，尤其是一種適用于檢測精子頂體酶活性的方法及試劑盒。
背景技術：
頂體酶存在于精子頭部頂體內膜與赤道膜之間。當精子與卵母細胞結合后，精子頭部發(fā)生頂體反應，頂體外膜破裂，頂體酶釋放。頂體酶是受精過程中重要的蛋白水解酶， 可溶解卵母細胞周圍的放射冠和透明帶，使精子穿過透明帶與卵細胞融合完成受精。精子頂體酶活性降低可影響精子穿透卵母細胞透明帶，從而導致不育。除精子自身質量之外，嚴重的生殖系統(tǒng)感染，也可造成精子頂體酶活性降低。目前在實驗室對精子頂體酶活性檢測的方法有免疫學測定與酶活性測定兩大類，免疫學測定操作復雜且反映的是總酶含量，而不是總酶活性；酶活性測定以Kennedy法為代表，是檢測對苯甲脒敏感的人精子精氨酸酰胺酶活性，它能反映幾乎全部精子頂體酶活性。但Kennedy法操作比較煩瑣精子在反應結束后必須再次離心分離，每標本均需設立測定和對照孔，批量檢測時難以實現(xiàn)同步反應從而影響了檢測結果的準確性，反應時間較長(3小時)等等。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種方法學特異、操作簡單、易于批量化檢測、能實現(xiàn)手工操作和半自動化批量檢測、清潔環(huán)保的精子頂體酶活性定量檢測方法和試劑盒。為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種精子頂體酶活性的固相濾膜檢測方法，其特征在于，包括如下步驟將精子吸附于固相濾膜表面；以離心或傾倒的方法去除固相濾膜表面除精子之外的液體和雜質；啟動頂體酶活性檢測反應吸附于固相濾膜表面的精子與底物溶液接觸，啟動頂體酶活性檢測反應；反應4 40°C反應30 120分鐘；終止反應將底物與固相表面精子分離或者加入質控終止液；反應產物比色； 根據(jù)比色結果計算精子頂體酶活性。所述的一種精子頂體酶活性的固相濾膜檢測方法，其特征在于，所述精子頂體酶活性的固相濾膜檢測的同時，同步進行質控液檢測，即使質控液與底物溶液在同樣條件下反應相同時間后，加入終止液終止反應，然后對質控液的反應產物進行比色，并根據(jù)比色結果計算質控液頂體酶活性；所述將精子吸附于固相濾膜表面之前還可以包括如下步驟調整精子濃度；所述將精子吸附于固相濾膜表面之前還可以包括如下步驟以重量比為 0. 001% 10%具旋光性的氨基己酸高分子聚合物包被濾膜。
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所述的一種精子頂體酶活性的固相濾膜檢測方法，其特征在于，所述固相濾膜孔徑為0. 2 20 μ m ；所述底物溶液為重量比為0. 1 % 10% N α -苯甲酰-DL-精胺酸-P -硝?；桨返拇既苄匀芤?；所述反應條件是孵育60分鐘。所述的一種精子頂體酶活性的固相濾膜檢測方法，其特征在于，所述質控終止液為重量比為每100毫升水含有0. 1-10克溶劑的苯甲脒或KF-950 水溶液；所述比色的方法包括以標準比色皿比色或以非標準比色容器比色；所述頂體酶活性的計算公式為精子標本測定標準比色皿比色頂體酶活性(μ IU/106精子)=(標本吸光度-試劑空白吸光度)Χ106)/[9·9Χ反應時間(分鐘)X精子數(shù)量(106)]，或，非標準比色皿比色頂體酶活性(μ IU/106精子)=(標本吸光度-試劑空白吸光度)X (吸光度校準品的標準吸光度X IO6)/[吸光度標準品的實際吸光度Χ9.9Χ反應時間(分鐘)X精子數(shù)量(106)]；質控液測定標準比色皿比色頂體酶活性(μ IU/5ul)=(質控吸光度-試劑空白吸光度)χ IO6)/[9. 9X反應時間(分鐘)X加入質控液體積+5]，或，非標準比色皿比色頂體酶活性(yIU/5ul)=(質控吸光度-試劑空白吸光度)X (吸光度校準品的標準吸光度X IO6)/[吸光度標準品的實際吸光度Χ9.9Χ反應時間(分鐘)X加入質控液體積+5]。本發(fā)明還提供一種精子頂體酶活性定量檢測試劑盒，包括反應裝置、精子洗液、緩沖液、底物溶液和質控終止液。還可以包括吸光度校準品、和/或微孔板條或試管，和/或泡沫板。本發(fā)明優(yōu)選采用如下反應裝置進行檢測，這是一種離心分離反應裝置，包括一端敞口的離心管10，其特征在于，還包括反應管20和底蓋30 ；所述反應管20為中空管身21， 一端為可與裝有試劑的測定管40可拆卸密封連接的敞口端211，另一端則為可安裝固相濾膜50的帶篩網(wǎng)223的端口 22 ；所述帶篩網(wǎng)的端口 22的底端設有可與所述離心管10的敞口端可拆卸地密封連接從而連通反應管和離心管、也可與所述底蓋30可拆卸地密封連接從而將帶篩網(wǎng)的端口封堵的接口 222。所述反應管20的管身21和帶篩網(wǎng)的端口 22為分體制造、拆卸連接。所述帶篩網(wǎng)的端口 22兩端均為敞口凹槽、中部橫截面上一體成型有一個篩網(wǎng) 223，該篩網(wǎng)上設有多個網(wǎng)眼221 ；所述帶篩網(wǎng)的端口 22的底端的凹槽壁形成所述接口 222、 所述反應管20的管身21可部分伸入并連接在所述帶篩網(wǎng)的端口 22另一端的凹槽中。所述反應管20的管身21與帶篩網(wǎng)的端口 22螺紋連接。所述離心分離反應裝置還包括固相濾膜50，所述固相濾膜的孔徑為0. 2 20 μ m。所述管身21下方，至少一層所述固相濾膜50緊貼在所述篩網(wǎng)223上。在所述固相濾膜50與所述管身21端面之間還設有彈性墊圈60。所述帶篩網(wǎng)的端口 22的接口 222可密封插接在所述離心管10內；也可密封插接在所述底蓋30內。所述底蓋30中間為一個上表面為平面的柱狀的塞柱32，在塞柱外、沿底蓋邊緣則為一圈連續(xù)的縱截面為U形的U形凹槽31 ；所述接口 222為可緊密適配于所述U形凹槽31 中的環(huán)形，所述塞柱32上表面可緊貼在所述篩網(wǎng)223下表面以防液體自網(wǎng)眼泄露。所述離心分離反應裝置還包括裝有試劑的測定管40，所述裝有試劑的測定管40 一端敞口，敞口端可與所述反應管20的敞口端211螺紋連接。所述固相濾膜孔徑為0. 2 20 μ m ；所述固相濾膜被重量比為0. 001% 10% 具旋光性的氨基己酸高分子聚合物包被，方法為所述固相濾膜被用重量比為0.001% 10%的有旋光性的氨基己酸高分子聚合物溶液浸泡，溶劑為PH5 9、濃度為0. 01 lmol/ L的磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖、醋酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液、硼酸緩沖液、 羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液的一種或其中至少兩種的混合溶液，浸炮后的濾膜在烤箱內80°C以下烘干或晾干。所述精子洗液為滲透壓200 400m0sm/kg的鹽溶液，為等滲的氯化鈉溶液、氯化鉀溶液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖、醋酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液、硼酸緩沖液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液中的一種或其中至少二種的混合液；所述的緩沖液為含陰離子表面活性劑、pH5 9、濃度為0. 01 lmol/L的磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖、醋酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液、硼酸緩沖液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液中的一種或其中至少兩種的混合溶液；所述的陰離子表面活性劑為脂肪酸鹽、磺酸鹽、硫酸酯鹽或磷酸脂鹽中的一種或其中至少兩種的混合溶液；所述的底物溶液為含重量比為0. 10% Na-苯甲酰-DL-精胺酸-P-硝?；桨返拇既苄匀芤?；所述的吸光度校準品為有色溶液，具體為在比色光徑為1cm、波長為400 420nm 時比色，吸光度為0. 2 3的有色溶液，例如硝?；桨啡芤夯驅ο趸尤芤海凰龅馁|控終止液為0. 10% (此處意思是每100毫升水中含有溶質0. 1-10 克)的苯甲脒水溶液或KF-950水溶液；所述的泡沫板為其孔直徑與反應裝置相適應的泡沫板。本發(fā)明的試劑盒可用于檢測精子頂體酶活性的用途。本發(fā)明還提供了利用所述的試劑盒進行精子頂體酶活性的固相濾膜檢測的具體方法，如下所述1)標本準備采集精液標本，待精液標本完全液化；以上泳法或密度梯度法收集高活力精子，或者以生理鹽水洗滌精子；調整精子濃度為35 175 X 106/ml，然后加入到所述反應管20和離心管10結合起來的反應裝置的反應管中，其中反應管帶篩網(wǎng)的端口 22裝有固相濾膜50， 加入反應管的精子數(shù)量為1 35 X IO6個；在水平式離心機上離心，使精子粘附在固相濾膜上，液體則容納于離心管10中；移除離心管10，并以底蓋30封緊反應管的帶篩網(wǎng)的端口， 待用；2)檢測步驟
臨用前60min內，將裝緩沖液的0. 4ml 1. 5ml/管的多個小管插入到泡沫板上， 在裝有緩沖液的小管內加入所述底物溶液0. 05 0. 5ml,即反應液；設立并標記試劑空白管、質控管和測定管；試劑空白管擰緊管蓋即可；質控管內加入質控液5 175 μ 1后，擰緊管蓋；其余為精子頂體酶檢測的測定管；將步驟1)得到的反應裝置的反應管敞口端朝下與所述測定管敞口端結合在一起；輕輕來回顛倒泡沫板混合，翻轉泡沫板使質控管內的反應液流入質控管的管底、測定管中的反應液則與反應管中固相濾膜上的精子接觸、啟動頂體酶活性檢測反應； 40C -40°C準確孵育30 120min ；輕輕來回顛倒泡沫板混合，翻轉泡沫板，使反應管的底蓋端朝上、反應液與固相濾膜分離從而終止反應；并迅速在質控管中加入2 50 μ 1質控終止液，混勻即可；將小管中的液體轉移至微孔板內，每測試均設復孔，每孔加入液量100 300μ 1， 依次在微孔內設立標準、試劑空白、質控和測定孔，標準孔每孔直接加入吸光度校準品相同的體積；進行吸光度值的測定；3)通過比色得到的吸光度值計算頂體酶活性IIU頂體酶活性=M°C每分鐘水解1. Oymol BAPNA ；吸光度校準品的標準吸光度指吸光度校準品在光徑lcm、405nm條件下的吸光度；待測精子標本頂體酶活性(μ υ/106精子)=(標本吸光度_試劑空白吸光度)X (吸光度校準品的標準吸光度X IO6)/[吸光度標準品的實際吸光度Χ9.9Χ反應時間(分鐘)X精子數(shù)量(106)]，或=(標本吸光度-試劑空白吸光度)X IO6)/[9. 9X反應時間(分鐘)X精子數(shù)量(106)]；質控液頂體酶活性(μ IU/5ul)=(質控吸光度-試劑空白吸光度)X (吸光度校準品的標準吸光度X IO6)/[吸光度標準品的實際吸光度Χ9.9Χ反應時間(分鐘)Χ加入質控液體積+5]，或=(質控吸光度-試劑空白吸光度)X IO6)/[9. 9X反應時間(分鐘)X加入質控液體積+5]；式中“9. 9”為BAPNA被頂體酶分解后的產物硝?；桨返哪栁庀禂?shù)，IO6表示將IU轉換成uiu。本發(fā)明的質控液中頂體酶活性需位于試劑的檢測范圍內，在精液標本進行檢測的同時同步檢測質控液中頂體酶的活性，用于監(jiān)測試劑是否失效、檢測結果是否可信，便于實驗室開展質量控制。本發(fā)明為固相BAPNA法，以有旋光性的氨基己酸高分子聚合物將待測精子固著于濾膜表面，通過特制的反應裝置控制反應液與濾膜表面精子的接觸與分離，達到實現(xiàn)檢測精子頂體酶和終止反應的目的。檢測被固相捕獲的精子的精氨酸酰胺酶活性，精子頂體內的精氨酸酰胺酶活性可反映全部頂體酶的活性。Na -苯甲酰-DL-精胺酸-P -硝酰基苯胺 (ΒΑΡΝΑ)在精氨酸酰胺酶的作用下，分解產生黃色的硝酰基苯胺，通過測定硝?；桨返漠a量推算出精氨酸酰胺酶的活性。本發(fā)明操作簡單，靈敏度高，特異性強，適合臨床使用，突出的技術效果在于
1、配備有反應裝置，通過離心，可直接去除對檢測反應有干擾的精漿，而待檢精子則粘附在濾膜表面，反應完成后可直接吸取反應液進行測定，由于檢測的是去除精漿后的精子，每標本不必設立標本對照管，從而簡化了檢測過程。2、通過翻轉反應裝置控制精子與反應液的接觸與分離，實現(xiàn)了批量化同步檢測、 準確控制反應時間、方便終產物比色，從而簡化了操作步驟、提高了檢測的準確性、縮短了檢測時間。3、通過設立吸光度校準品，可實現(xiàn)最終反應產物在非標準的Icm光徑條件下進行比色，檢測手段靈活；吸光度校準品具有的固定吸光度值，可減少實驗室間因比色儀引起的誤差，使不同檢測機構的檢測結果一致、更具可比性。4、通過設立質控終止液，可檢測頂體酶質控液，方便實驗室進行室內質量控制和室間質量評價。5、由于操作簡單、采用即用型試劑且性能穩(wěn)定、無需特殊檢測儀器，便于臨床常規(guī)應用與推廣。


圖1是本發(fā)明反應裝置的部件分解立體外形圖。圖2是本發(fā)明反應裝置組裝為離心裝置的主視示意圖。圖3是圖2的縱向剖視示意圖。圖4是本發(fā)明反應裝置組裝為檢測裝置的主視示意圖。圖5是圖4的縱向剖視示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明優(yōu)選采用如下反應裝置進行精子頂體酶活性定量檢測。如圖1-5所示，是本發(fā)明的離心分離反應裝置，主要包括離心管10、反應管20和底蓋30，還可以包括裝有試劑的測定管40、固相濾膜50和彈性墊圈60。所述離心管10 —端封閉、一端敞口，其敞口端(圖1-3中所示的上端)可與反應管可拆卸連接。圖1-5所示，所述反應管20為中空管身21，一端為可與裝有試劑的測定管40可拆卸密封連接的敞口端211、另一端則為帶篩網(wǎng)223的端口 22。為便于安裝固相濾膜50、將固相(例如精子)與液體(例如精漿等液體)過濾，如圖1、3、5，所述反應管20的管身21 和帶篩網(wǎng)的端口 22為分體制造、并可拆卸地連接在一起，可采用螺紋連接。所述帶篩網(wǎng)的端口 22兩端均為敞口凹槽、中部橫截面上一體成型有一個篩網(wǎng)223，該篩網(wǎng)上設有多個網(wǎng)眼221。所述帶篩網(wǎng)的端口 22的底端的凹槽壁形成接口 222 ；而頂端的凹槽內則可安裝固相濾膜50、彈性墊圈60，其凹槽壁則與反應管的管身21可密封適配，所述反應管20的管身 21可部分伸入并螺紋連接在該凹槽壁上。本發(fā)明的離心分離反應裝置還可以包括固相濾膜50，所述固相濾膜的孔徑為 0. 2 20 μ m，可以是濾紙或纖維素或醋酸纖維或硝酸纖維或再生纖維素或混合纖維素酯或玻璃纖維或聚碳酸酯或聚酰胺或尼龍或聚四氟乙烯或聚丙烯纖維或聚砜或聚偏二氟乙烯或聚氯乙烯等材質制成。固相濾膜20位于所述管身21下方，至少一層(通常為一層或二層，根據(jù)實驗需要也可以為更多層)，所述固相濾膜50緊貼在所述篩網(wǎng)223上，為壓緊固相濾膜50，在所述固相濾膜50的上表面安放有彈性墊圈60，所述管身21的下邊緣壓緊在彈性墊圈60上表面(如圖3和圖5所示)，從而將固相濾膜壓緊。如圖1、3、5所示，所述帶篩網(wǎng)的端口 22的接口 222為環(huán)形，與所述離心管10或所述底蓋30的連接為插接，在該具體實施方式
中，所述接口 222密封適配于所述離心管10內壁或所述底蓋30的U形凹槽中。所述底蓋30中間為一個上表面為平面的柱狀的塞柱32， 在塞柱外、沿底蓋邊緣則為一圈連續(xù)的縱截面為U形的U形凹槽31 ；如圖5所示，所述接口 222緊密適配于所述U形凹槽31中，這時，所述塞柱32上表面緊貼在所述篩網(wǎng)223下表面以防液體自網(wǎng)眼221泄露。利用該裝置進行檢測的工作過程是將所述反應管20的接口 222密封地插接到所述離心管10的敞口端內，反應管與離心管連通，形成離心裝置，如圖2和圖3所示；需要離心的樣品自反應管敞口端裝入后進行離心，當離心完成后，待檢測的固相(如精子)粘附在所述固相濾膜上表面，而液體(如精漿或其它雜質等)濾入離心管中；移除離心管，使接口 22緊密地插接到所述底蓋30的U形凹槽中，底蓋將反應管下端封堵，可防止液體向外泄露，將底蓋30朝上，這時待檢測的固相粘附在固相濾膜上不會掉下，取裝有試劑的測定管40(其內裝有反應試劑)，將裝有試劑的測定管的敞口端螺紋連接在反應管20的敞口端 211，密封連接好后，形成了反應裝置，再倒轉為裝有試劑的測定管朝上，試劑流到固相濾膜處與固相(例如精子)進行反應，如圖4、5所不。實施例1一、制備本發(fā)明的精子頂體酶活性定量檢測試劑盒1.安裝反應裝置1)稱取磷酸二氫鉀13. 61克溶于IL純化水，稱取12水磷酸氫二鈉35. 814克溶于 IL純化水，在pH計監(jiān)測下，將二種溶液混合至pH值為7，此混合液即為pH7、0. lmol/L磷酸鹽緩沖液。(PH7、0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液)2)稱取L-氨基己酸-球蛋白聚合物0.5克，置于燒杯內，加入pH7、0. lmol/L磷酸鹽緩沖液攪拌溶解后，用pH7、0. lmol/L磷酸鹽緩沖液定容至1L，混勻后保存。(旋光性氨基己酸高分子聚合物的濃度為0.05%，表示每100毫升緩沖液中含有L-氨基己酸-球蛋白聚合物0. 05克)3)選取孔徑5.0 μ m的聚四氟乙烯膜(PTFE)作為固相濾膜，將該膜浸泡于L-氨基己酸-球蛋白聚合物溶液內，取出后烤箱內80°C以下烘干或晾干。4)將上述幻得到的固相濾膜放入反應管帶篩網(wǎng)的端口 22的篩網(wǎng)223上，在該端口上擰上管身21，并將離心管10扣在反應管20下部(即帶篩網(wǎng)的端口 22上)，從而組成了離心裝置，如圖2和圖3所示。2.配制精子洗液稱取氯化鈉8. 766克，置于燒杯內，加入適量純化水攪拌溶解后，用純化水定容至 1L，混勻后保存。(氯化鈉溶液滲透壓為300m0sm/kg。)3.配制緩沖液1)稱取羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPEQ 23. 831克，加入適量純化水攪拌溶解后，在 PH計監(jiān)測下，用濃鹽酸或濃氫氧化鈉溶液調整pH值至7，用純化水定容至1L。(pH7、0. lmol/
10L HEPES緩沖液)2)稱取1克十二烷基硫酸鈉(SDS)，溶入IL的pH7、0. lmol/L HEPES緩沖液內，攪拌混勻。(SDS濃度為0. 1%，表示每IOOml緩沖液內含有0. 1克SDS)4.配制底物溶液稱取N α -苯甲酰-DL-精胺酸-P -硝?；桨?ΒΑΡΝΑ) 10克，溶入IL的二甲基亞砜中，攪拌混勻。(ΒΑΡΝΑ濃度為1 %，表示每IOOml 二甲基亞砜內含有1克ΒΑΡΝΑ)5.配制吸光度校準品1)稱取氫氧化鈉4克，溶入IL的純化水中。(氫氧化鈉濃度為0. lmol/L)2)稱取對硝基酚0. 01克，溶入IL的0. lmol/L氫氧化鈉溶液中，用濃對硝基酚溶液或0. lmol/L氫氧化鈉溶，調整其比色波長為405nm、比色光徑為Icm時的吸光度為1。(對硝基酚溶液吸光度為1。)6.配制質控終止液稱取苯甲脒或KF-950(4_胍基苯甲酸鹽)50克，溶入IL純化水中。7.泡沫板板上空間直徑與反應管相適應，以能固定反應管為宜。8.微孔板條市購。從以上步驟可進一步量取、封裝得到本發(fā)明的試劑盒
反應裝置30套精子洗液3瓶100ml/瓶緩沖液45管0.8ml/管底物溶液1瓶IOml/瓶吸光度校準品1瓶IOml/瓶質控終止液1瓶0.15ml/瓶泡沫板1塊微孔板條8孔/條12條以上試劑盒中每樣物品的用量不限于以上公布的。二、用上述試劑盒進行精子頂體酶活性定量檢測(一)標本準備1.受試者禁欲2-7天后，通過手淫法(或用特制的精液采集套以性交方式)留取全部精液標本，待精液標本完全液化后進行檢測。標本室溫放置不得超過3小時，勿將頂體酶待測標本冷凍或長時間冷藏。2.在離心管或試管中加入液化完全的新鮮精液標本anl，加入精子洗液細1，顛倒混勻或以巴氏管吹打混勻。3. 800g離心lOmin。去除上層液體，保留底部精子沉淀。4.加入0. 5ml精子洗液，使精子重新懸浮。5.充分混勻后準確計數(shù)，精子的濃度為35X 106/ml。6.向PTFE反應管底加入0. 2ml精子懸液，即加入的精子數(shù)量為7. OX IO6個。
7.在水平式離心機上1500g離心lOmin。8.移除反應裝置底部的離心管10，以底蓋30封緊反應管底端，待用。(二)檢測步驟1.臨用前60min內，將裝有緩沖液的多支小管插入到泡沫板上，在裝有緩沖液的小管內加入底物溶液o.ani (此為反應液)。以其中ι支裝有反應液的小管作為試劑空白 (RB)，1支裝有反應液的小管作為質控(QC)，另1支為測定精子頂體酶活性的測定管，在各小管管體上進行標本標記。本發(fā)明可不設同步的質控液檢測、而單獨進行精子頂體酶活性檢測，而設質控液檢測是為了更方便評估實驗結果的準確性和可靠性等，實施例2、實施例 3也是如此。2.將經(jīng)上述步驟(一)處理得到的反應裝置倒轉后，與裝有反應液的測定管結合在一起，如圖4和圖5所示。試劑空白和質控無需使用反應裝置，檢測在裝有反應液的測定管內完成。每次檢測均需設置試劑空白(RB)將1支裝有反應液的小管擰緊管蓋即可；質控管OiC)在1支裝有反應液的小管內加入質控液(含頂體酶的精漿，通過真空冷凍干燥制成凍干粉，使用前用純化水復溶，復溶后其中頂體酶的活性需要在10 ΙΟΟΟμ IU/5ul范圍內方可用于檢測，本實施例中的質控液頂體酶活性為400-500 μ IU/5ul。)35 μ 1后，擰緊管蓋即可。3.輕輕顛倒混合泡沫板2次，180°翻轉泡沫板，使反應液流入PTFE管底，反應液接觸反應管中固相濾膜上的精子，啟動頂體酶活性檢測反應，4°C準確孵育60min。4.輕輕顛倒混合泡沫板2次，180°翻轉泡沫板，使反應液從固相濾膜分離從而終止反應。迅速在質控管OiC)中加入10μ1質控終止液，混勻。擰開、移出與測定管小管結合的反應管。5.將小管中的液體轉移至微孔板內，每測試均設復孔，每孔加入液量200μ1。 依次在微孔內設立標準、試劑空白、質控和測定孔。標準孔每孔直接加入吸光度校準品 200 μ 1。6.酶標儀405nm比色，以空氣作為空白，讀取各孔吸光度為標本吸光度為1. 752， 試劑空白吸光度為0. 307，質控吸光度為1. 928，吸光度校準品的實際吸光度為0. 817。(非標準比色皿為比色光徑不是Icm的其它比色皿，可用的比色皿種類很多，不限于酶標儀，實施例2、3也是如此。)7.分光光度計上比色波長為405nm，比色光徑為1cm，以空白比色皿調零，讀取各孔吸光度為標本吸光度為2. 144，試劑空白吸光度為0. 376，質控吸光度為2. 36。(標準比色皿為比色光徑是Icm的比色皿，可用的比色皿種類很多，不限于分光光度計，實施例2、3 也是如此。)(三)結果計算1.酶標儀上讀數(shù)后計算IIU頂體酶活性=4°C每分鐘水解1. 0 μ mo 1 ΒΑΡΝΑ。PNP校準液在光徑lcm、405nm條件下的吸光度=1. 0 (此處即為吸光度校準品的標
準吸光度)
待測標本頂體酶活性(μ υ/106精子)
=(標本吸光度一試劑空白吸光度)χ (吸光度校準品的標準吸光度XlO6)
/[吸光度標準品的實際吸光度x9.9x反應時間(分鐘)χ精子數(shù)量(106)]
權利要求
1.一種精子頂體酶活性的固相濾膜檢測方法，其特征在于，包括如下步驟 將精子吸附于固相濾膜表面；以離心或傾倒的方法去除固相濾膜表面除精子之外的液體和雜質； 啟動頂體酶活性檢測反應吸附于固相濾膜表面的精子與底物溶液接觸，啟動頂體酶活性檢測反應；反應4 40°C反應30 120分鐘； 終止反應將底物與固相表面精子分離或者加入質控終止液； 反應產物比色；根據(jù)比色結果計算精子頂體酶活性。
2.如權利要求1所述的一種精子頂體酶活性的固相濾膜檢測方法，其特征在于， 所述精子頂體酶活性的固相濾膜檢測的同時，同步進行質控液檢測，即使質控液與底物溶液在同樣條件下反應相同時間后，加入終止液終止反應，然后對質控液的反應產物進行比色，并根據(jù)比色結果計算質控液頂體酶活性；所述將精子吸附于固相濾膜表面之前還可以包括如下步驟調整精子濃度； 所述將精子吸附于固相濾膜表面之前還可以包括如下步驟以重量比為0. 001% 10 %具旋光性的氨基己酸高分子聚合物包被濾膜。
3.如權利要求1或2所述的一種精子頂體酶活性的固相濾膜檢測方法，其特征在于， 所述固相濾膜孔徑為0. 2 20 μ m ；所述底物溶液為重量比為0. 10%Να -苯甲酰-DL-精胺酸-P -硝?；桨返拇既苄匀芤海凰龇磻獥l件是孵育60分鐘。
4.如權利要求1或2所述的一種精子頂體酶活性的固相濾膜檢測方法，其特征在于， 所述質控終止液為重量比為每100毫升水含有0. 1-10克溶劑的苯甲脒或KF-950水溶液；所述比色的方法包括以標準比色皿比色或以非標準比色容器比色；所述頂體酶活性的計算公式為精子標本測定標準比色皿比色頂體酶活性(μ υ/ιο6精子)=(標本吸光度-試劑空白吸光度)Χ106)/[9·9Χ反應時間(分鐘)X精子數(shù)量(106)]， 或，非標準比色皿比色頂體酶活性(μ υ/106精子)=(標本吸光度-試劑空白吸光度)X (吸光度校準品的標準吸光度X IO6)/[吸光度標準品的實際吸光度Χ9.9Χ反應時間(分鐘)X精子數(shù)量(106)]；質控液測定標準比色皿比色頂體酶活性(μ IU/5ul)=(質控吸光度-試劑空白吸光度)Χ106)/[9.9Χ反應時間(分鐘)Χ加入質控液體積+5]， 或，非標準比色皿比色頂體酶活性(μ IU/5ul)=(質控吸光度-試劑空白吸光度)X (吸光度校準品的標準吸光度XlO6)/[吸光度標準品的實際吸光度Χ9.9Χ反應時間(分鐘)X加入質控液體積+5]。
5.一種用于權利要求1或2所述的固相濾膜檢測方法的定量檢測試劑盒，其特征在于，包括反應裝置、精子洗液、緩沖液、底物溶液和質控終止液。
6.如權利5所述的精子頂體酶活性的定量檢測試劑盒，其特征在于還包括吸光度校準品、和/或微孔板條或試管，和/或泡沫板。
7.如權利6所述的精子頂體酶活性定量檢測試劑盒，其特征在于所述反應裝置為離心分離反應裝置，包括離心管(10)、反應管00)和底蓋(30)；所述反應管00)為中空管身(21)，一端為可與裝有試劑的測定管00)可拆卸密封連接的敞口端011)，另一端則為可安裝固相濾膜(50)的帶篩網(wǎng)的端口 02)；所述帶篩網(wǎng)的端口 02)可與所述離心管(10) 的敞口端可拆卸地密封連接從而連通反應管和離心管，也可與所述底蓋(30)可拆卸地密封連接從而將帶篩網(wǎng)的端口封堵。
8.如權利7所述的精子頂體酶活性定量檢測試劑盒，其特征在于，所述固相濾膜孔徑為0. 2 20 μ m ；所述固相濾膜被重量比為0. 001% 10%具旋光性的氨基己酸高分子聚合物包被，方法為所述固相濾膜被用重量比為0. 001% 10%的有旋光性的氨基己酸高分子聚合物溶液浸泡，溶劑為PH5 9、濃度為0. 01 lmol/L的磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖、醋酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液、硼酸緩沖液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液的一種或其中至少兩種的混合溶液，浸炮后的濾膜在烤箱內80°C以下烘干或晾干。
9.如權利5或6所述的精子頂體酶活性定量檢測試劑盒，其特征在于所述精子洗液為滲透壓200 400m0sm/kg的鹽溶液，為等滲的氯化鈉溶液、氯化鉀溶液、磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖、醋酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液、硼酸緩沖液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液中的一種或其中至少二種的混合液；所述的緩沖液為含陰離子表面活性劑、PH5 9、濃度為0. 01 lmol/L的磷酸鹽緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖、醋酸鹽緩沖液、巴比妥緩沖液、硼酸緩沖液、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液中的一種或其中至少兩種的混合溶液；所述的陰離子表面活性劑為脂肪酸鹽、磺酸鹽、硫酸酯鹽或磷酸脂鹽中的一種或其中至少兩種的混合溶液；所述的底物溶液為含重量比為0. 1 % 10% N α -苯甲酰-DL-精胺酸-P -硝?；桨返拇既苄匀芤海凰龅奈舛刃势窞橛猩芤?，具體為在比色光徑為1cm、波長為400 420nm時比色，吸光度為0. 2 3的有色溶液，例如硝酰基苯胺溶液或對硝基酚溶液；所述的質控終止液為0. 10%的苯甲脒水溶液或KF-950水溶液；所述的泡沫板為其孔直徑與反應裝置相適應的泡沫板。
10.利用權利要求7所述的試劑盒進行精子頂體酶活性的固相濾膜檢測的具體方法為1)標本準備采集精液標本，待精液標本完全液化；以上泳法或密度梯度法收集高活力精子，或者以生理鹽水洗滌精子；調整精子濃度為35 175 X 106/ml，然后加入到所述反應管Q0)和離心管(10)結合起來的反應裝置的反應管中，其中反應管帶篩網(wǎng)的端口 02)裝有固相濾膜 (50)，加入反應管的精子數(shù)量為1 35X IO6個；在水平式離心機上離心，使精子粘附在固相濾膜上，液體則容納于離心管(10)中；移除離心管(10)，并以底蓋(30)封緊反應管的帶篩網(wǎng)的端口，待用；2)檢測步驟臨用前60min內，將裝緩沖液的0. 4ml 1. 5ml/管的多個小管插入到泡沫板上，在裝有緩沖液的小管內加入所述底物溶液0. 05 0. 5ml,即反應液；設立并標記試劑空白管、質控管和測定管；試劑空白管擰緊管蓋即可；質控管內加入質控液5 175 μ 1后，擰緊管蓋； 其余為精子頂體酶檢測的測定管；將步驟1)得到的反應裝置的反應管敞口端朝下與所述測定管敞口端結合在一起；輕輕來回顛倒泡沫板混合，翻轉泡沫板使質控管內的反應液流入質控管的管底、測定管中的反應液則與反應管中固相濾膜上的精子接觸、啟動頂體酶活性檢測反應；4°C -40°C 準確孵育30 120min ；輕輕來回顛倒泡沫板混合，翻轉泡沫板，使反應管的底蓋端朝上、反應液與固相濾膜分離從而終止反應；并迅速在質控管中加入2 50μ 1質控終止液，混勻即可；將小管中的液體轉移至微孔板內，每測試均設復孔，每孔加入液量100 300μ 1，依次在微孔內設立標準、試劑空白、質控和測定孔，標準孔每孔直接加入吸光度校準品相同的體積；進行吸光度值的測定；3)通過比色得到的吸光度值計算頂體酶活性IIU頂體酶活性=M°C每分鐘水解1. 0 μ mo 1 ΒΑΡΝΑ ；吸光度校準品的標準吸光度指吸光度校準品在光徑lcm、405nm條件下的吸光度；待測精子標本頂體酶活性(μ IU/106精子)=(標本吸光度-試劑空白吸光度)X (吸光度校準品的標準吸光度XlO6)/[吸光度標準品的實際吸光度Χ9.9Χ反應時間(分鐘)X精子數(shù)量(106)]，或=(標本吸光度-試劑空白吸光度)Χ106)/[9.9Χ反應時間(分鐘)X精子數(shù)量 (106)]；質控液頂體酶活性(μ IU/5ul)=(質控吸光度-試劑空白吸光度)X (吸光度校準品的標準吸光度X IO6)/[吸光度標準品的實際吸光度Χ9.9Χ反應時間(分鐘)Χ加入質控液體積+5]，或=(質控吸光度-試劑空白吸光度)X IO6)/[9. 9X反應時間(分鐘)Χ加入質控液體積+5]；式中“9. 9”為BAPNA被頂體酶分解后的產物硝酰基苯胺的摩爾吸光系數(shù)，IO6表示將 IU轉換成uIU。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種精子頂體酶活性的固相濾膜檢測方法，包括將精子吸附于固相濾膜表面；以離心或傾倒的方法去除固相濾膜表面除精子之外的液體和雜質；啟動頂體酶活性檢測反應吸附于固相濾膜表面的精子與底物溶液接觸，啟動頂體酶活性檢測反應；4～40℃反應30～120分鐘；將底物與固相表面精子分離或者加入質控終止液；反應產物比色；通過比色得到的吸光光度值計算頂體酶活性；本發(fā)明還涉及一種精子頂體酶活性定量檢測試劑盒。本發(fā)明配以專門的反應裝置，操作簡單、結果準確，檢測手段靈活，便于批量化檢測、易于推廣應用。
文檔編號G01N21/78GK102353672SQ20111018134
公開日2012年2月15日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權日2011年6月30日
發(fā)明者莊學敏, 張翔, 王希上, 程錦軍, 胡家純, 鐘彩顏 申請人:深圳市博銳德生物科技有限公司