專利名稱：一種分離檢測afp亞型的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種肝癌特異性AFP亞型 (Hepatoma-specific Alpha-fetoprotein Isoform,HS-AFP)分離檢測法，具體為應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合免疫印跡技術(shù)定性檢測血清樣本中的HS-AFP。人外周血中HS-AFP的增加與原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)，運(yùn)用該方法檢測外周血中HS-AFP，對原發(fā)性肝癌的診斷、鑒別診斷、肝癌監(jiān)測、手術(shù)預(yù)后判斷及肝硬化癌變預(yù)測均具有較高價(jià)值。
背景技術(shù)：
肝癌是最常見惡性腫瘤之一，其預(yù)后在很大程度上取決于能否得到早診早治。肝
癌
的診斷包括影像學(xué)的定位診斷和肝癌標(biāo)志物的定性診斷。許多早期肝癌缺乏典型的影像學(xué)改變，此時(shí)定性診斷尤為重要。在我國肝癌發(fā)病的高危人群為慢性肝病尤其是乙肝后肝硬化患者，對這部分肝癌高危人群定期進(jìn)行肝癌標(biāo)志物檢測對肝癌的早期診斷具有重要價(jià)值。血清甲胎蛋白(AFP)是公認(rèn)最佳肝癌標(biāo)志物，對肝癌的篩選、診斷以及復(fù)發(fā)監(jiān)測均有重要價(jià)值。但許多小肝癌AFP濃度較低，出現(xiàn)AFP假陰性，而良性肝病有時(shí)也可出現(xiàn)AFP升高假陽性。因此單靠檢測AFP水平不能滿足臨床需要。為進(jìn)一步提高AFP對肝癌的診斷價(jià)值，許多學(xué)者對AFP亞型進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)AFP存在糖鏈異構(gòu)體。不同AFP糖鏈異構(gòu)體與植物凝集素的親和力不同，據(jù)此利用植物凝集素親和電泳可將AFP分離出不同的亞型。肝癌患者血清中巖藻糖化的AFP增多，后者可與扁豆凝集素(lens culinaris agglutinin A) 有親和作用，被命名為AFP-L3。近年來國外不少學(xué)者對AFP-L3對肝癌的診斷價(jià)值進(jìn)行了研究，證實(shí)AFP-L3升高(占總AFP 15%以上)主要見于肝癌。良性肝病盡管會出現(xiàn)總AFP升高，但AFP-L3很少升高。AFP-L3在臨床發(fā)現(xiàn)肝癌9 12個(gè)月之前即可出現(xiàn)陽性，AFP-L3 還與患者的轉(zhuǎn)移及生存期相關(guān)。因此，AFP-L3對肝癌的診斷、鑒別診斷以及病情監(jiān)測價(jià)值遠(yuǎn)比血清AFP濃度為高。AFP亞型的另一種分離方法是根據(jù)不同AFP亞型間等電點(diǎn)的差別采用等電聚焦電泳法進(jìn)行分離。Burditt等用等電點(diǎn)聚膠電泳將血清AFP分為4條區(qū)帶，發(fā)現(xiàn)區(qū)帶III和IV為肝癌特異性區(qū)帶。Ho等也發(fā)現(xiàn)2條不同等電點(diǎn)的肝癌特異性區(qū)帶，有助于AFP升高的良性肝病與肝癌的鑒別診斷。目前用于AFP亞型的檢測方法都根據(jù)AFP糖鏈異構(gòu)體與植物凝集素親和力或等電點(diǎn)的差異而進(jìn)行的。不但方法繁瑣，更由于親和電泳所需凝集素和等電聚焦電泳所需兩性電解質(zhì)價(jià)格都非常昂貴，故AFP亞型檢測未能在臨床上推廣應(yīng)用。我們利用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳體系分離AFP亞型，結(jié)合免疫印跡技術(shù)檢測肝癌特異性AFP。既省去了昂貴的植物凝集素和兩性電解質(zhì)，大大降低檢測成本， 又簡化操作，具有價(jià)廉、簡便及重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，且無需特殊條件及儀器，使肝癌特異性AFP 檢測能在臨床推廣應(yīng)用。該方法國內(nèi)外均未見其他相關(guān)報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏特異、價(jià)廉、簡便及重復(fù)性好的肝癌特異性AFP亞型檢測方法。本發(fā)明的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的制備2個(gè)濃度梯度的聚丙烯酰胺凝膠，自上而下分別為88.0 g/L和50.0 g/L，在每個(gè)加樣孔中分別加入上樣緩沖液及血清樣品(混勻)，以自然聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離肝癌特異性AFP亞型，再將AFP亞型從聚丙烯酰胺凝膠上轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，并與兔抗人AFP Ig G—抗反應(yīng)，再加入HRP-羊抗兔Ig G 二抗， 最后以DAB顯色。肉眼觀察AFP區(qū)帶分布情況。本發(fā)明檢測肝癌特異性AFP亞型方法，其包括以下組份
(1)聚丙烯酰胺溶液準(zhǔn)確稱取四.2 g聚丙烯酰胺，0.9 g亞甲基雙丙烯酰胺，均放入 100 ml的燒杯中，加入去離子水6 0ml，加熱并攪拌使之完全溶解，倒入100 ml的容量瓶中，去離子水沖洗燒杯數(shù)次均倒入容量瓶中，定容至100 ml，過濾備用，冷藏保存。(2)分離膠緩沖液準(zhǔn)確稱取Tris 18. 10 g，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml攪拌，用濃鹽酸滴定至pH 8. 30，去離子水定容至 100 ml，冷藏保存。(3)濃縮膠緩沖液準(zhǔn)確稱取Tris 6. 0 g，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml攪拌，用濃鹽酸滴定至pH 6. 80，去離子水定容至100
毫升，冷藏保存。(4)過硫酸銨溶液準(zhǔn)確稱取0. 14 g過硫酸銨，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水50 ml攪拌溶解，避光冷藏保存。(5)上樣緩沖液1.0 M Tris-HCl 緩沖液(pH6. 8)3. 1 ml, 5. 0 ml 甘油，1.0 g/L溴酚藍(lán)0.5 ml，加去離子水至10 ml，冷藏保存。(6)陽極電泳緩沖液準(zhǔn)確稱取Tris 37. 85g，吸取濃鹽酸20. 8 ml，放入500 ml的燒杯中，加入去離子水300 ml，攪拌使之完全溶解，去離子水定容至1000 ml。冷藏保存。(7)陰極電泳緩沖液準(zhǔn)確稱取Tris 22. 8 g，硼酸45. 0g，放入500 ml的燒杯中， 加入去離子水300 ml，攪拌使之完全溶解，去離子水定容至1000 ml。冷藏保存。(8)蛋白印跡(轉(zhuǎn)移)緩沖液準(zhǔn)確稱取甘氨酸2. 90 g，Tris 5. 80 g，放入100 ml 的燒杯中，加入去離子水50 ml，攪拌使之完全溶解，倒入1000 ml的容量瓶中，加入200 ml 無水甲醇，去離子水定容至1000 ml。冷藏保存。(9)顯色液準(zhǔn)確稱取 DAB 7. 0 mg，放入 100 ml 的燒杯，加 0. 01 M PBS (pH7. 4) 10 ml，攪拌使之完全溶解，加入飽和硫酸鎳銨0. 2 ml。顯色前加入H2A 20 μ 。(10)—抗為兔抗人AFP Ig G :DAK0公司生產(chǎn)。(11) 二抗為HRP-羊抗兔Ig G 西安華美公司生產(chǎn)。(12)磷酸鹽緩沖液(0.01 M PBS):稱 7.9 g NaCl,0. 2 g KCl,0. 24 g KH2PO4 和 1.8 g K2HPO4，溶于800 ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4，去離子水定容至1 L。
冷藏保存。(13)硝酸纖維膜德國Protran TM公司生產(chǎn)。本發(fā)明檢測肝癌特異性AFP亞型步驟如下
(1)制膠使用Hml體積垂直平板電泳槽，膠厚1mm，玻璃板間下端先以10.0 g/L瓊脂糖封口，按下表所示量分別配制聚丙烯酰胺濃度分別為88. Og/L的分離膠及50. Og/L的濃縮膠，靜置待凝。 表膠板配制中各溶液所取量(ml)
權(quán)利要求
1.聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合免疫印跡技術(shù)檢測血清樣本中的肝癌特異性AFP亞型其特征在于包括以下組份(1)聚丙烯酰胺溶液準(zhǔn)確稱取四.2g聚丙烯酰胺，0.9 g亞甲基雙丙烯酰胺，均放入 100 ml的燒杯中，加入去離子水6 0ml，加熱并攪拌使之完全溶解，倒入100 ml的容量瓶中，去離子水沖洗燒杯數(shù)次均倒入容量瓶中，定容至100 ml，過濾備用，冷藏保存；(2)分離膠緩沖液準(zhǔn)確稱取1Tris18.10 g，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水50 ml及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml攪拌，用濃鹽酸滴定至pH 8. 30，去離子水定容至100 ml，冷藏保存；(3)濃縮膠緩沖液準(zhǔn)確稱取Tris6. 0 g，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水50 ml 及四甲基乙二胺(TEMED) 1.0 ml攪拌，用濃鹽酸滴定至pH 6. 80，去離子水定容至100毫升，冷藏保存；(4)過硫酸銨溶液準(zhǔn)確稱取0.14 g過硫酸銨，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水 50 ml攪拌溶解，避光冷藏保存；(5)上樣緩沖液1.0 M Tris-HCl 緩沖液(pH6. 8) 3. 1 ml, 5.0 ml 甘油，1.0 g/L 溴酚藍(lán)0.5 ml，加去離子水至10 ml，冷藏保存；(6)陽極電泳緩沖液準(zhǔn)確稱取Tris37. 85g，吸取濃鹽酸20. 8 ml，放入500 ml的燒杯中，加入去離子水300 ml，攪拌使之完全溶解，去離子水定容至1000 ml冷藏保存；(7)陰極電泳緩沖液準(zhǔn)確稱取Tris22.8 g，硼酸45. 0g，放入500 ml的燒杯中，加入去離子水300 ml，攪拌使之完全溶解，去離子水定容至1000 ml冷藏保存；(8)蛋白印跡(轉(zhuǎn)移)緩沖液準(zhǔn)確稱取甘氨酸2.90 g，Tris 5. 80 g，放入100 ml的燒杯中，加入去離子水50 ml，攪拌使之完全溶解，倒入1000 ml的容量瓶中，加入200 ml無水甲醇，去離子水定容至1000 ml冷藏保存；(9)顯色液準(zhǔn)確稱取DAB7.0 mg，放入100 ml的燒杯，加0.01 M PBS(pH7. 4)10 ml, 攪拌使之完全溶解，加入飽和硫酸鎳銨0.2 ml，顯色前加入H2A 20 μ ；(10)—抗為兔抗人AFPIg G :DAK0公司生產(chǎn)；(11)二抗為HRP-羊抗兔Ig G 西安華美公司生產(chǎn)；(12)磷酸鹽緩沖液(0.01 M PBS):稱 7. 9 g NaCl,0. 2 g KCl,0. 24 g KH2PO4 和 1. 8 g K2HPO4，溶于800 ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 4，去離子水定容至1 L，冷藏保存；(13)硝酸纖維膜德國ProtranTM公司生產(chǎn)。
2.聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合免疫印跡技術(shù)檢測血清樣本中的肝癌特異性AFP亞型其特征在于包括以下步驟(1)制膠使用14ml體積垂直平板電泳槽，膠厚1mm，玻璃板間下端先以10.0 g/L瓊脂糖封口，按下表所示量分別配制聚丙烯酰胺濃度分別為88. Og/L的分離膠及50. Og/L的濃縮膠，靜置待凝；(2)加樣電泳取4μ 上樣緩沖液及14 μ 血清樣品混勻，分別加入電泳膠板的每個(gè)加樣孔，將電泳膠板放入電泳槽，在上槽中加入陰極電泳緩沖液，下槽中加入陽極電泳緩沖液，并將電泳槽放入4°C冰箱內(nèi)接通電源，60 V穩(wěn)壓電泳約1 h后，調(diào)整電壓為100 V，電泳 3.5 h結(jié)束電泳；(3 )轉(zhuǎn)移小心取下凝膠，在左下角做好標(biāo)記，放入已加入轉(zhuǎn)移緩沖液的培養(yǎng)皿內(nèi)，搖床上平穩(wěn)搖動(dòng)，換液三次，每次搖動(dòng)5分鐘，在此之前約半小時(shí)事先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸透轉(zhuǎn)移電泳槽、濾紙和硝酸纖維膜(NC膜)，在轉(zhuǎn)移電泳槽的下層碳板(即陽極碳板)上按從下到上的順序依次放好M層濾紙、NC膜、凝膠、M層濾紙，每層均要小心緩慢趕走氣泡，輕輕放上陰極碳板，電泳槽放入4°C冰箱內(nèi)接通電源，設(shè)置為穩(wěn)流，按每平方厘米NC膜面積電流為ImA 設(shè)置，轉(zhuǎn)移3. 5 h；(4)包被轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC膜置培養(yǎng)皿中，以0.01M PBS洗膜三次，每次5 min ； 稱取1. 0 g脫脂奶粉，溶解于20 ml的0. 01 M PBS中，倒入洗好的NC膜上，37°C水浴、1 h；(5)抗原抗體反應(yīng)棄去牛奶，0.01M PBS洗膜三次，每次5 min，加入1:100稀釋的兔抗人AFP IgG，置濕盒4°C冰箱過夜或37°C水浴1 h，再以0.01 M PBS洗NC膜三次，每次5 min，再加入1:100稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，37°C水浴1 h;(6)顯色以0.01M PBS洗膜三次，每次5 min，置DAB顯色液中避光顯色3 min，棄去 DAB顯色液，流水沖洗終止反應(yīng)，肉眼觀察AFP區(qū)帶分布情況。
全文摘要
本發(fā)明應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合免疫印跡技術(shù)定性檢測血清樣本中的肝癌特異性AFP亞型(HS-AFP)。包括以下組份聚丙烯酰胺溶液；分離膠緩沖液；濃縮膠緩沖液；過硫酸銨溶液；上樣緩沖液；陽極電泳緩沖液；陰極電泳緩沖液；蛋白印跡(轉(zhuǎn)移)緩沖液；顯色液；一抗(兔抗人AFPIgG)；二抗(HRP-羊抗兔IgG)；磷酸鹽緩沖液(0.01MPBS)；硝酸纖維膜。其檢測步驟包括(1)制膠自上而下2個(gè)濃度梯度分別為88.0g/L和50.0g/L；(2)加樣電泳；(3)轉(zhuǎn)移；(4)包被；(5)抗原抗體反應(yīng)；(6)顯色，肉眼觀察AFP區(qū)帶分布情況。
文檔編號G01N33/68GK102353791SQ20111018121
公開日2012年2月15日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者倪潤洲, 肖明兵, 陳不尤 申請人:倪潤洲, 肖明兵, 陳不尤