專利名稱：一種檢測孔雀石綠的免疫層析試紙及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及孔雀石綠殘留物的檢測試劑，具體涉及一種檢測孔雀石綠的免疫層析試紙及其制備方法。
背景技術：
孔雀石綠(malachite green, MG)又名堿性綠、鹽基塊綠、孔雀綠，苯胺綠、維多利亞綠或中國綠等，屬三苯甲烷類染料，曾被廣泛用于預防和治療各類水產(chǎn)動物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等。但孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠在水產(chǎn)品體內(nèi)會產(chǎn)生高殘留。 人食用后易引起致癌、致畸和致突變等副作用。歐盟、美國以及部分東亞國家均已禁止將孔雀石綠用作漁類的抗真菌藥物，我國于2002年5月也將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中。我國是水產(chǎn)品生產(chǎn)、消費和出口大國，孔雀石綠是近幾年對水產(chǎn)品主要監(jiān)控的藥殘之一。目前現(xiàn)場篩查用檢測試劑多用孔雀石綠膠體金試紙進行檢測，但因其靈敏度低不能很好滿足要求，因此需要開發(fā)可在現(xiàn)場更為準確和快速的檢測方法?；诳乖?抗體免疫學反應的側流免疫層析檢測技術(LFIAs)是20世紀90年代初發(fā)展起來的新興技術，因其快捷方便的特性，非常適宜用于現(xiàn)場的快速監(jiān)測。但目前該類技術多采用膠體金作為信號標記分子，受其靈敏度等的限制，只能用于定性檢測。超順磁性復合粒子具有良好的磁學特性，由于其受背景干擾小，特別適宜于不含磁性物質(zhì)的生物樣品的檢測。膠體金和熒光標記分子用于測流免疫層析檢測時，只可在其檢測區(qū)膜表面觀測到約10%的信號分子強度，而用超順磁性復合粒子作為標記材料，則可檢測到檢測區(qū)膜三維立體結構中的所有磁信號分子，可極大提高靈敏度，并可用對應的磁信號檢測儀達到定量測定，因此，超順磁性復合粒子是近年來在LFIAs中受到關注的材料。然而，目前報道的生物檢測用磁性納米復合粒子多采用化學法如共沉淀法先制備得到有機相的磁性納米粒子后，再采用硅(SiO2)或聚苯乙烯、聚丙烯酸、明膠等高分子材料對其表面進行穩(wěn)定化包覆修飾，以得到穩(wěn)定的、水溶性的磁性標記材料。但這些制備修飾方法往往較為繁瑣復雜，得到的超順磁性復合粒子在尺寸大小、生物相容性、飽和磁強度、外磁場響應速度、穩(wěn)定性和標記效率等方面不能同時滿足LFIAs的要求其尺寸多在200 300nm之間，由于磁珠顆粒偏大，在試紙上的泳動時間較慢，顯色時間較長；而太小的粒子又無法提供足夠的磁共振信號；另外還有生物相容性不穩(wěn)定、磁珠容易聚合等問題；這些不足限制了超順磁性復合粒子在LFIAs中的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測孔雀石綠的免疫層析試紙。本發(fā)明提供的檢測孔雀石綠的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的反應墊、連接于所述反應墊另一端的吸水墊；所述反應墊包被有相互分離的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線含有孔雀石綠抗原，所述質(zhì)控線含有能與所述孔雀石綠抗體特異結合的抗抗體。
所述反應墊為硝酸纖維素膜；所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體為將孔雀石綠抗體和超順磁性復合粒子的以肽鍵共價結合形成的聚合體；所述孔雀石綠抗體為孔雀石綠單克隆抗體或孔雀石綠多克隆抗體，所述孔雀石綠抗體具體為孔雀石綠單克隆抗體(北京邁克隆興生物技術有限公司，0010)；所述孔雀石綠抗原為孔雀石綠半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；小分子抗原物質(zhì)與載體蛋白偶聯(lián)時，每個載體蛋白分子上所連接的半抗原的平均數(shù)目稱為偶聯(lián)比或結合比。為達到載體蛋白與NC膜的良好結合，同時又能最大程度地保證孔雀石綠半抗原空間位點的延展，選擇合適的偶聯(lián)比是非常重要的。偶聯(lián)比的大小與半抗原功能基團的活性、位阻、反應投料比及反應條件有關。一般通過調(diào)節(jié)半抗原與載體的摩爾比、反應環(huán)境PH值、溫度、離子強度等來控制偶聯(lián)比。所述載體蛋白與所述孔雀石綠半抗原的偶聯(lián)比為1 6 1 8，適于抗原的包被和孔雀石綠半抗原空間位點的延展，所述載體蛋白與所述孔雀石綠半抗原的偶聯(lián)比具體為 1:8;所述與所述孔雀石綠抗體特異結合的抗抗體為羊抗鼠IgG抗體；所述孔雀石綠抗原和所述羊抗鼠IgG抗體的濃度均為lmg/ml。所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體按照如下方法制備1)將每2.5mg超順磁性復合粒子、0.96mgl-乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)U. 15mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和Iml濃度為0. 1Μ、ρΗ值為4. 7的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液(稱取1. 066g MES,0. 45g NaCl溶于50ml純水，調(diào)pH至4. 7)混勻，反應，得到活化后磁性粒子；2)將每2. 5mg步驟1)得到活化后磁性粒子、0. 15mg孔雀石綠抗體和0. 8ml濃度為50mM pH為8. 5的硼砂緩沖液混勻、反應，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應液；3)向步驟2)得到的反應液中加入BSA混勻得到混合液、反應，得到含有封閉后磁性粒子的反應液；所述BSA在所述混合液中的濃度為5% (質(zhì)量百分含量)，所述孔雀石綠抗原按照如下方法制備A)將每60ml無水乙醇、24g無水SiCl2、5mg固體強酸離子交換樹脂(阿拉丁公司， 1098585)、0.9g 4-對羧基苯甲醛、2.細11 N，N-二甲苯胺混勻，反應，得到反應液a ；B)冷卻步驟A)得到的反應液a，在每62. 4ml冷卻后反應液a中再加入2ml濃度為lmol/L的鹽酸、30ml無水甲醇，混勻至出現(xiàn)結晶，得到羧基化孔雀石綠；C)將每82mg步驟B)得到的羧基化孔雀石綠溶解于8ml N, N- 二甲苯胺，再加入 20. 6mg DCC (N, N- 二環(huán)己基碳化二亞胺)混合，再加入8. 6mgNHS (N-羥基丁二酰亞胺)反應，得到活化的孔雀石綠；D)將每IOOmg載體蛋白溶解于8ml濃度為0. lmol/L、pH為8. 5的硼酸鈉溶液，得到載體蛋白硼酸溶液；E)將每82mg步驟C)得到的活化的孔雀石綠加入8ml步驟D)得到的載體蛋白硼酸溶液，反應，得到反應液b。所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的制備方法中
步驟1)中，反應溫度為37°C，反應時間為0. 5h ；步驟2)中，反應溫度為25°C，反應時間為3. 5h ；步驟3)中，反應溫度為37°C，反應時間為0.證。所述孔雀石綠抗原的制備方法中步驟A)中，所述反應溫度為85°C，所述反應時間為25h ；所述反應在氮氣條件下進行；步驟B)中，所述冷卻的時間為12小時；步驟C)中，所述混合的溫度為25°C，所述混合的時間為15min，所述反應為先在 25°C下反應lh，再在4°C下反應1. 5h ；步驟E)中，所述反應溫度為4°C，所述反應時間為3. ^！。所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的制備方法中在所述步驟幻后，還包括將所述含有封閉后磁性粒子的反應液中的封閉后磁性粒子進行洗滌、懸浮，得到超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的步驟，所述洗滌液和懸浮液均為0. 02M pH為7. 4的PBS緩沖液。所述孔雀石綠抗原的制備方法中在所述步驟E)后還包括將步驟E)得到的反應液b透析、凍干，得到孔雀石綠抗原的步驟。所述透析液為濃度為0. 02mol/L、pH為7. 4的PBS緩沖液，透析時間為Mh，每Mi
更換一次透析液。所述孔雀石綠半抗原為孔雀石綠；所述載體蛋白為BSA;由于孔雀石綠是小分子物質(zhì)，其分子表面特性不利于與反應區(qū)即NC膜的直接結合，需要將其與載體蛋白進行偶聯(lián)后才能借助于載體蛋白的表面特性而達成與NC膜的良好結合?？捎米鬏d體蛋白的有各種動物的血清白蛋白，如牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)，還有鑰孔血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、甲狀腺球蛋白、兔血清白蛋白(RSA)、卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)、纖維蛋白原或兔和雞的丙種球蛋白等。研究發(fā)現(xiàn)，BSA理化性質(zhì)穩(wěn)定，賴氨酸含量高， 自由氨基多，在不同的PH和離子強度下均有較大的溶解度，在含有有機溶劑(如吡啶、DMF 等)的情況下均可和半抗原進行偶聯(lián)，且在偶聯(lián)后仍保持可溶狀態(tài)，是作為載體蛋白的極佳選擇，故本發(fā)明選用BSA作為偶聯(lián)蛋白。所述超順磁性復合粒子為!^e3O4納米粒子；由于該超順磁性復合粒子要由上述反應板中的樣品墊泳動至反應板中間的測試區(qū)實現(xiàn)抗原-抗體的特異結合和標記反應，其粒徑太大(> 300nm)在試紙上的泳動時間長，顯色時間慢；在偶聯(lián)時較容易發(fā)生聚集，并容易產(chǎn)生非特異反應；粒徑太小則磁強度又往往不夠。所述超順磁性復合粒子的粒徑為60 300nm，所述粒徑具體為80 200nm，所述粒徑尤其優(yōu)選為IOOnm ；其粒徑的偏差(CV)在10 30%之間，較好為10 20%之間， 優(yōu)選15%。超順磁性復合粒子的飽和磁強度及其外磁場響應速度直接決定了檢測靈敏度及其精確性的高低，傳統(tǒng)方法制備的超順磁性復合粒子的飽和磁強度通常都< 30emU/g，外磁場響應速度則在100 200秒。為提高其靈敏度及準確性，所述超順磁性復合粒子的磁飽和強度為30 80emu/g，對應的外磁場響應速度為20 100秒，所述超順磁性復合粒子的磁飽和強度具體為35 70emu/g，對應的外磁場響應速度為20 50秒，所述超順磁性復合粒子的磁飽和強度尤其優(yōu)選為40emu/g，對應的外磁場響應速度為20秒；為用于孔雀石綠殘留物檢測，超順磁性復合粒子表面需帶有易于與孔雀石綠抗體偶聯(lián)的基團，這些基團可以是羧基、氨基等基團，優(yōu)化的基團是帶羧基的表面官能團，通常采用化學方法連接抗體，即用EDC和NHS活化超順磁性復合粒子后，再與抗體發(fā)生羧合反應而完成偶聯(lián)反應。在將孔雀石綠抗體和超順磁性復合粒子的以肽鍵共價結合形成的聚合體前，還包括將超順磁性復合粒子表面官能團即羧基的活化的步驟。超順磁性復合粒子表面的羧基含量不同會影響到檢測的靈敏度，為提高靈敏度，所述官能團具體為羧基，所述羧基的含量為50 500ymol/g，所述羧基的含量具體為50 300 μ mol/g，所述羧基的含量尤其優(yōu)選為80 μ mol/g;在免疫檢測中，抗體的性能指標對于檢測的準確性至關重要，通常而言，特異性強、親和力高的抗體，可以顯著地提高檢測的準確性。研究發(fā)現(xiàn)，為提高靈敏度，所述孔雀石綠抗體親和常數(shù)為IO6 IO8M-1 ；所述孔雀石綠抗體親和常數(shù)具體為IO7 IO8M-1 ；所述孔雀石綠抗體親和常數(shù)尤其優(yōu)選為IO8MA本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備檢測孔雀石綠的免疫層析試紙的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟I、分別制備樣品墊和含有檢測線和質(zhì)控線的反應墊；II、將步驟I得到的樣品墊、步驟I得到的含有檢測線和質(zhì)控線的反應墊與吸水墊依次粘貼到背板上，得到檢測孔雀石綠的免疫層析試紙；所述含有檢測線和質(zhì)控線的反應墊按照如下方法制備將所述孔雀石綠抗原和所述與孔雀石綠抗體特異結合的抗抗體分別噴在反應墊的兩端不同區(qū)域，形成檢測線和質(zhì)控線，得到含有檢測線和質(zhì)控線的反應墊；所述樣品墊按照如下方法制備將所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體噴到玻璃纖維紙上，得到樣品墊。在所述樣品墊制備方法中在將所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體噴到所述玻璃纖維紙上前，還包括預處理所述玻璃纖維紙和預處理所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的步驟所述預處理所述玻璃纖維紙為將所述玻璃纖維紙在緩沖液中浸泡1小時，所述緩沖液按照如下方法制備將每aiilTritonX100、10g BSA、50g蔗糖和950ml 濃度為0. 02M、pH為7. 4的PBS緩沖液混合得到緩沖液，調(diào)pH到7. 4，并定容到1000ml。所述浸泡的時間為1小時，浸泡的溫度為37°C ；所述預處理所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體為將所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體稀釋，所述稀釋倍數(shù)為50倍。所述稀釋液為預處理玻璃纖維紙中所用的緩沖液。所述反應墊為硝酸纖維素膜。在步驟I后，步驟II前，還包括干燥步驟I得到的樣品墊與步驟I得到的含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的步驟。
所述試紙在檢測樣品中殘留孔雀石綠中的應用也是本發(fā)明保護的范圍，所述樣品具體為動物組織樣本、動物尿樣、飼料、蜂蜜或牛奶樣本，所述樣品尤其具體為蝦仁。本發(fā)明的技術原理本發(fā)明的孔雀石綠檢測試劑與超順磁性復合粒子標記的免疫層析檢測技術相關， 是采用超順磁性復合粒子作為標記材料，進行快速免疫層析測定的一類方法，該技術整合了磁性納米材料化學合成、標記技術、測流免疫層析技術等相關領域的研究。本發(fā)明之所以能檢測孔雀石綠，在于采用了一種基于超順磁性復合粒子標記的測流免疫層析檢測的方法，即將孔雀石綠抗原和抗鼠IgG抗體分別噴涂于位于反應板中間的測試區(qū)(由硝酸纖維素膜即NC膜構成)的測試線(T線)和質(zhì)控線(C線)處，反應板下端的樣品墊上噴涂超順磁性復合粒子標記的抗孔雀石綠抗體，反應板上端則連接有吸水墊， 整個反應板的構成如圖1所示?；跍y流免疫層析的原理，加入待測樣品后，樣品中的孔雀石綠與T線處噴涂的孔雀石綠抗原競爭結合磁標孔雀石綠抗體，在T線處形成抗原-抗體二元磁標免疫復合物，多余的磁標孔雀石綠抗體則在C線處與抗鼠IgG形成的磁標免疫復合物。用磁性試紙判讀儀測定T線處超順磁性微球的磁強強度，通過與設定的閾值比對而確定其陽性或陰性結果，C線測定結果則作為該測定方法的質(zhì)控內(nèi)標。其具體的技術步驟包括(一 )超順磁性復合粒子標記探針的制備采用適合的納米超順磁性復合粒子，活化其表面的羧基后，采用化學偶聯(lián)的方式將孔雀石綠抗體定向連接到該超順磁性復合粒子表面。( 二)測試區(qū)T線和C線處抗原/抗體的包被采用專門的噴膜儀器，于測試區(qū)的T線處噴涂孔雀石綠抗原，于C線處噴涂抗鼠 IgG抗體。(三)樣品墊處標記探針的包被采用專門的噴涂儀器，于樣品墊特定位置處噴涂超順磁性微球標記的抗孔雀石綠抗體。(四)反應板的組裝成型按照反應板的結構圖(見圖1)要求，于塑料支撐背板中間粘貼作為測試區(qū)的硝酸纖維素(NC)膜，于NC膜的T線端粘貼樣品墊，C線端粘貼吸水墊。在其上面粘貼透明保護膜。采用專門的試紙分切機，將整塊反應板分切為一定寬帶的紙條，用裝有干燥劑的專門的鋁箔袋進行包裝。(五)抗原-抗體磁標免疫復合物的形成于上述組裝成型的反應板的加樣孔處加入待測樣品，樣品中的孔雀石綠與T線處噴涂的孔雀石綠抗原競爭結合磁標孔雀石綠抗體，在T線處形成抗原-抗體二元磁標免疫復合物，多余的磁標孔雀石綠抗體則在C線處與抗鼠IgG形成的磁標免疫復合物。(六)磁標免疫復合物磁場強度檢測用磁性試紙判讀儀測定T線處超順磁性微球的磁場強度，通過與設定的閾值比對而確定其陽性或陰性結果，C線測定結果則作為該測定方法的質(zhì)控內(nèi)標。本發(fā)明采用的超順磁性復合粒子是購自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為MP-2(聚馬來酸十六醇酯(PMAH)修飾的水溶性納米晶TEM照片見圖2)，所采用的制備方法是將用化學法制得的油溶性I^e3O4溶解在有機試劑中得到溶液A，將雙親性齊聚物溶于3 次蒸餾水中并調(diào)節(jié)PH為8 10得溶液B，常溫下將溶液B注入溶液A中，混合液進行充分攪拌并使有機溶劑揮發(fā)，進行離心分離，將離心分離的產(chǎn)物干燥后即可得水溶性的超順磁性復合粒子。用該法制備獲得的磁性粒子飽和磁強度高、磁響應快、磁珠尺寸均勻、單分散性好、穩(wěn)定性強、涌動時間快，可很好地滿足LFIAs的檢測要求。所述的抗原-抗體磁標免疫復合物，是指加入檢測樣品后，經(jīng)競爭結合，在T線處形成的孔雀石綠抗原-磁標孔雀石綠抗體免疫復合物，以及在C線處形成的抗鼠IgG 二抗抗體-磁標孔雀石綠抗體免疫復合物。所述的磁標免疫復合物的磁場強度，是指在T線和C線處分別滯留下的結合磁珠的數(shù)量用美國Quantum Dot的超順磁共振檢測儀MAR測定后所得到的數(shù)值。通過優(yōu)化競爭反應的條件，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大量測定不同來源如尿樣、血液及組織樣品提取液等的正常樣本，可確定出各不同來源正常樣本的測定均值，以此作為臨界值(cutoff)來確定T線檢測樣本的陽性或陰性結果。C線測定結果則作為該測定方法的質(zhì)控內(nèi)標?？兹甘G的化學名稱為四甲基代二氨基三苯甲烷。本發(fā)明的實驗證明，通過對超順磁性復合粒子、孔雀石綠抗原和孔雀石綠抗體分子特性的研究，通過對多種超順磁性復合粒子制備、包覆及表面修飾條件的優(yōu)化，選擇適合的超順磁性復合粒子與特異性的抗體進行定向共價化學偶聯(lián)，獲得功能性的磁性標記探針，并通過優(yōu)化競爭性免疫反應的各種條件，達到對孔雀石綠殘留藥物的客觀檢測，實現(xiàn)了對孔雀石綠殘留藥物的快速和高靈敏測定。具有如下優(yōu)點靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現(xiàn)客觀化測定。


圖1為磁性試紙結構示意2為水溶性超順磁性復合粒子電鏡3為孔雀石綠磁性試紙檢測值與濃度標準曲線圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、孔雀石綠殘留物磁性標記快速檢測試紙的制備(一 )超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的制備采用粒徑為lOOnm、磁飽和強度為40emu/g，對應的外磁場響應速度為20秒、表面羧基含量為80 μ mol/g的超順磁性復合粒子(超順磁性!^e3O4納米粒子)(購自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為MP-2)標記孔雀石綠抗體。 具體方法是1)取2. 5mg的上述磁性粒子用0. IM的MES緩沖液(稱取1. 066gMES、 0. 45g NaCl溶于50ml純水，調(diào)pH至4. 7)洗滌并用0. 4T的磁架分離富集后，用Iml濃度為 0. 1Μ、ρΗ值為4. 7的MES緩沖液重懸，加入0. 96mg (終濃度為5mM)的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和1. 15mg(終濃度為IOmM)N-羥基丁二酰亞胺(NHS)于其中。 反應溫度為37°C，反應半小時后，得到活化后磁性粒子；
2)用50mM pH = 8. 5的硼砂緩沖液洗滌，取0. 15mg孔雀石綠單克隆抗體(北京邁克隆興生物技術有限公司，0010，孔雀石綠抗體效價106，孔雀石綠抗體親和常數(shù)為IO8M-1)和2. 5mg活化后磁性粒子混合到0. 8ml 50mM pH = 8. 5的硼砂緩沖液(稱取 1. 9gNa2B407. IOH2O溶于IOOml純水，調(diào)pH至8. 5)中充分混勻。室溫(25°C )下反應3. 5小時，讓抗體和磁性粒子形成穩(wěn)定的肽鍵共價結合，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應液；3)反應結束后，向步驟2)得到的反應液加入終濃度為5% (質(zhì)量百分含量)的 BSA(Sigma-aldrich,85041C)對剩余活性氨基位點進行封閉，反應在37°C下進行0. 5小時。 完成后，用 pH = 7. 4 的 0. 02M PBS 緩沖液(稱取 2. 3g Na2HPO4^O. 524gNaH2P04. H20,8. 77g NaCL溶于IL純水，調(diào)pH至7. 4)洗滌，重懸后4°C保存待用，得到超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體。( 二)孔雀石綠抗原的合成孔雀石綠半抗原為孔雀石綠(北京恒元啟天化工技術研究院，1245BW3811)。先合成孔雀石綠的中間體，再與蛋白偶聯(lián)。具體步驟為1)在三口瓶中注入60ml無水乙醇，塞上帶溫度計的膠塞以控制溫度，安裝好冷凝回流管和氮氣導入口，緩慢升溫，防止出現(xiàn)暴沸，待瓶內(nèi)攪拌子轉動下的酒精穩(wěn)定沸騰 (85 0C )開始緩慢打開氮氣閥，控制速率，讓氣流能在瓶內(nèi)穩(wěn)定鼓出氣泡，3分鐘后，待瓶內(nèi)空氣完全被氮氣取代形成一個氮氣保護氛圍，加入24g約ISmmol無水ZnC12做催化劑，并使其完全溶解，加入催化量(約5mg)固體強酸離子交換樹脂(阿拉丁公司，1098585)，加入 0. 9g約6mmol 4-對羧基苯甲醛，并使之充分混勻，加入2. 4ml約19mmol N, N- 二甲苯胺， 保持以上條件反應25h，得到反應液a ；2)反應結束后，冷卻反應液a靜置12小時(室溫)，瓶內(nèi)溶液由淡綠色變?yōu)樯罹G色，62. 4ml冷卻后反應液a中再加入^iil lmol/L鹽酸和30ml無水甲醇后，瓶內(nèi)慢慢出現(xiàn)深綠色結晶和膠狀物質(zhì)，得到羧基化孔雀石綠；3)取82mg (約0. 2mmol)步驟幻得到的羧基化孔雀石綠溶解于8ml DMF (N，N-二甲苯胺)中使之充分溶解，加入20. 6mg(約0. lmmol)DCC(N,N- 二環(huán)己基碳化二亞胺)在室溫 (250C )下活化15min，加入NHS (N-羥基丁二酰亞胺)28. 6mg (約0. 2mmol)在室溫(25°C ) 下反應lh，之后轉入4°C下反應1.證，得到活化的孔雀石綠；4)取IOOmg BSA溶解于8ml，得到活化的孔雀石綠0. lmol/L、pH為8. 5的硼酸鈉溶液中，得到BSA硼酸溶液，4°C下保存待用；5)將每82mg步驟3)得到的活化的孔雀石綠在冰浴下緩慢加入8ml步驟4)得到的BSA硼酸溶液中4°C反應3. 5h ；6)產(chǎn)物于0. 02mol/L, pH = 7. 5PBS中透析M小時，每Mi換次透析液，所得產(chǎn)品用凍干機凍干，于_20°C保存。(三)孔雀石綠磁標快速檢測試紙的制備采用0. 02M PBS (pH = 7. 4)緩沖液，將羊抗鼠IgG抗體(長沙博優(yōu)生物科技有限公司，ABGAM-0500)和上述(二)得到的孔雀石綠抗原的濃度均配制為濃度lmg/ml，選用 BioDot的XYD050噴膜系統(tǒng)中的BioJet噴頭將羊抗鼠IgG抗體噴至硝酸纖維素膜(NC膜) 的控制線(Control Line，C線)位置，將上述(二)得到的孔雀石綠抗原噴至檢測線(Test
11Line，T線)位置，于相對濕度為10%以下的干燥車間進行抽濕4小時后干燥待用。用含 2% TritonXlOOU% BSA、1%蔗糖的0. 02M PBS(pH = 7. 4)溶液浸泡玻璃纖維紙1小時， 浸泡的溫度為37°C，于同樣的抽濕條件進行抽濕4小時后，用上述膜處理緩沖液按50倍稀釋順磁性復合粒子標記的孔雀石綠抗體后，采用BioDot的XYB050噴膜系統(tǒng)中的AirJet 噴頭將此稀釋磁標抗體噴涂至上述處理過的玻璃纖維素膜上制備形成樣品墊，于同樣的抽濕條件進行干燥。在10萬級潔凈和干燥的車間中把上述干燥好的NC膜、磁墊、吸水紙、背板和保護膜按圖1所示進行搭配組裝后，采用BioDot的CM4000裁切系統(tǒng)將貼好的紙板裁切為5mm/條的寬度，裝入檢測用夾片待用，得到檢測孔雀石綠的免疫層析試紙。該試紙的結果示意圖如圖1所示。實施例2、孔雀石綠殘留物的免疫層析試紙靈敏度、交叉反應和準確度的檢測。1、靈敏度的測定稱取適量孔雀石綠(北京恒元啟天化工技術研究院，產(chǎn)品目錄號1245BW3811)， 以去離子水溶解配制為lOOug/ml的標準儲備溶液。用0. 02M的PBS(pH = 7. 4)稀釋配制為0,0. 005,0.01,0. 05,0. 1,0. 5、l、5、10ug/L的標準溶液，分別加入由實施例1得到的檢測孔雀石綠的免疫層析試紙中，并采用超順磁共振檢測儀MAR (Magna Biosciences, 8094-101-01 & 8094-101-02)讀取。檢測步驟檢測前先將待檢測樣品恢復室溫(25°C )， 用精確移液器取待檢測樣品100 μ 1垂直緩慢滴入磁性試紙條的加樣端，然后滴入50ul沖洗液(0. 02M, pH 7. 4，PBS)，20分鐘后用MAR進行測試。其檢測結果如下表1所示。從檢測結果數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)孔雀石綠濃度為0. 005ug/ L時檢測值與Oug/L時的檢測值有交叉，當濃度為0. 01ug/L時檢測值與Oug/L值可以完全區(qū)分開，且濃度曲線R2 = 0. 9837，線性較好，說明試紙的檢測靈敏度能達到0. Olug/L?？兹甘G磁性試紙檢測值與濃度曲線圖如圖3所示。表1孔雀石綠不同濃度樣品的磁性試紙檢測值
權利要求
1.一種檢測孔雀石綠的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的反應墊、連接于所述反應墊另一端的吸水墊；所述反應墊包被有相互分離的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線含有孔雀石綠抗原，所述質(zhì)控線含有能與所述孔雀石綠抗體特異結合的抗抗體。
2.根據(jù)權利要求1所述的試紙，其特征在于 所述反應墊為硝酸纖維素膜；所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體為孔雀石綠抗體和超順磁性復合粒子的肽鍵共價結合形成的聚合體；所述孔雀石綠抗體為孔雀石綠單克隆抗體或孔雀石綠多克隆抗體，所述孔雀石綠抗體具體為孔雀石綠單克隆抗體；所述孔雀石綠抗原為孔雀石綠半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物； 所述載體蛋白與孔雀石綠半抗原的偶聯(lián)比為1 8 1 10，具體為1 10; 所述與所述孔雀石綠抗體特異結合的抗抗體為羊抗鼠IgG抗體； 所述孔雀石綠抗原和所述羊抗鼠IgG抗體的濃度均為lmg/ml。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的試紙，其特征在于所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體按照如下方法制備1)將每2.5mg超順磁性復合粒子、0. 96mgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺、 1. 15mg N-羥基丁二酰亞胺和Iml濃度為0. 1Μ、ρΗ值為4. 7的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液混勻，反應，得到活化后磁性粒子；2)將每2.5mg步驟1)得到活化后磁性粒子、0. 15mg孔雀石綠抗體和0. 8ml濃度為50mM PH為8. 5的硼砂緩沖液混勻、反應，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應液；3)向步驟幻得到的反應液中加入BSA混勻得到混合液、反應，得到含有封閉后磁性粒子的反應液；所述BSA在所述混合液中的濃度為5% (質(zhì)量百分含量)。 所述孔雀石綠抗原按照如下方法制備A)將每60ml無水乙醇、24g無水a(chǎn)iCl2、5mg固體強酸離子交換樹脂、0.9g4-對羧基苯甲醛、2.細11 N，N-二甲苯胺混勻，反應，得到反應液a ；B)冷卻步驟A)得到的反應液a，在每62.4ml冷卻后反應液a中加入2ml濃度為lmol/ L的鹽酸、30ml無水甲醇，混勻至出現(xiàn)結晶，得到羧基化孔雀石綠；C)將每82mg步驟B)得到的羧基化孔雀石綠溶解于8mlN，N-二甲苯胺，再加入20. 6mg N，N- 二環(huán)己基碳化二亞胺混合，再加入8. 6mgN-羥基丁二酰亞胺反應，得到活化的孔雀石綠；D)將每IOOmg載體蛋白溶解于8ml濃度為0.lmol/L、pH為8. 5的硼酸鈉溶液，得到載體蛋白硼酸溶液；E)將每82mg步驟C)得到的活化的孔雀石綠加入8ml步驟D)得到的載體蛋白硼酸溶液，反應，得到反應液b。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的試紙，其特征在于 所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的制備方法中 步驟1)中，反應溫度為37°C，反應時間為0. ;步驟2)中，反應溫度為25°C，反應時間為3. ; 步驟3)中，反應溫度為37°C，反應時間為0. ！。 所述孔雀石綠抗原的制備方法中 步驟A)中，所述反應溫度為85°C，所述反應時間為25h ； 步驟B)中，所述冷卻的時間為12小時；步驟C)中，所述混合的溫度為25°C，所述混合的時間為15min，所述反應為先在25°C下反應lh，再在4°C下反應1. ;步驟E)中，所述反應溫度為4°C，所述反應時間為3.證。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一所述的試紙，其特征在于 所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的制備方法中在所述步驟幻后，還包括將所述含有封閉后磁性粒子的反應液中的封閉后磁性粒子進行洗滌、懸浮，得到超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的步驟，所述洗滌液和懸浮液均為濃度為0. 02M pH為7. 4的PBS緩沖液。 所述孔雀石綠抗原的制備方法中，在所述步驟E)后還包括將步驟E)得到的反應液b透析、凍干，得到孔雀石綠抗原的步馬聚ο
6.根據(jù)權利要求1-5中任一所述的試紙，其特征在于 所述孔雀石綠半抗原為孔雀石綠；所述載體蛋白為BSA;所述超順磁性復合粒子為!^e3O4納米粒子；所述超順磁性復合粒子的粒徑為60 300nm，所述粒徑具體為80 200nm，所述粒徑尤其優(yōu)選為IOOnm ；所述超順磁性復合粒子的磁飽和強度為30 80emu/g，對應的外磁場響應速度為20 100秒，所述超順磁性復合粒子的磁飽和強度具體為35 70emu/g，對應的外磁場響應速度為20 50秒，所述超順磁性復合粒子的磁飽和強度尤其優(yōu)選為40emu/g，對應的外磁場響應速度為20秒；所述超順磁性復合粒子表面的羧基含量為50 500ymol/g，所述超順磁性復合粒子表面的羧基含量具體為50 300 μ mol/g，所述超順磁性復合粒子表面的羧基含量尤其優(yōu)選為80 μ mol/g;所述孔雀石綠抗體親和常數(shù)為IO6 IO8M-1 ；所述孔雀石綠抗體親和常數(shù)具體為IO7 IO8M-1 ；所述孔雀石綠抗體親和常數(shù)尤其優(yōu)選為IO8MA
7.一種制備檢測孔雀石綠的免疫層析試紙的方法，包括如下步驟I、分別制備樣品墊和含有檢測線和質(zhì)控線的反應墊；II、將步驟I得到的樣品墊、步驟I得到的含有檢測線和質(zhì)控線的反應墊與吸水墊依次粘貼到背板上，得到檢測孔雀石綠的免疫層析試紙；所述含有檢測線和質(zhì)控線的反應墊按照如下方法制備將權利要求1-6中試紙中的所述孔雀石綠抗原和權利要求1-6中試紙中的所述與孔雀石綠抗體特異結合的抗抗體分別噴在反應墊的兩端不同區(qū)域，形成檢測線和質(zhì)控線，得到含有檢測線和質(zhì)控線的反應墊；所述樣品墊按照如下方法制備將權利要求1-6中試紙中的所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體噴到玻璃纖維紙上，得到樣品墊。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于在所述樣品墊制備方法中在將所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體噴到所述玻璃纖維紙上前，還包括預處理所述玻璃纖維紙和預處理所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的步驟所述預處理所述玻璃纖維紙為將所述玻璃纖維紙在緩沖液中浸泡1小時，所述緩沖液按照如下方法制備將每anlTritonXlOOUOg BSA、50g蔗糖和950ml濃度為0. 02M、pH為7. 4的PBS緩沖液混合得到緩沖液，調(diào)pH到7. 4，并定容到1000ml。所述浸泡的時間為1小時，浸泡的溫度為37°C ；所述預處理所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體為將所述超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體稀釋，所述稀釋倍數(shù)為50倍；所述反應墊為硝酸纖維素膜。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的方法，其特征在于在步驟I后，步驟II前，還包括干燥步驟I得到的樣品墊與步驟I得到的含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的步驟。
10.權利要求1-6任一所述試紙在檢測樣品中殘留孔雀石綠中的應用，所述樣品具體為動物組織樣本、動物尿樣、飼料、蜂蜜或牛奶樣本，所述樣品尤其具體為蝦仁。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測孔雀石綠的免疫層析試紙及其制備方法。本發(fā)明提供的檢測孔雀石綠的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復合粒子標記孔雀石綠抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的硝酸纖維素膜、連接于所述硝酸纖維素膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線含有孔雀石綠抗原，所述質(zhì)控線含有能與所述孔雀石綠抗體特異結合的抗抗體。本發(fā)明的實驗證明，用本發(fā)明提供的試紙檢測孔雀石綠，靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現(xiàn)客觀化測定。
文檔編號G01N33/558GK102353775SQ20111015763
公開日2012年2月15日 申請日期2011年6月13日 優(yōu)先權日2011年6月13日
發(fā)明者吳峰, 袁航, 馬嵐 申請人:清華大學深圳研究生院