專利名稱：一種檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氯霉素殘留物的檢測(cè)試劑，具體涉及一種檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙及其制備方法。
背景技術(shù)：
氯霉素(Chloramphenicol，CAP)，是一種有效的廣譜抗生素，常用于動(dòng)物各種傳染性疾病的治療，對(duì)多種病原菌有較強(qiáng)的抑制作用，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)也帶來了水產(chǎn)品中氯霉素殘留的嚴(yán)重問題。氯霉素由于存在嚴(yán)重毒副作用，已被許多國(guó)家和地區(qū)列為禁用藥物。歐盟、美國(guó)等均在法規(guī)中規(guī)定CAP殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”，即不得檢出。我國(guó)是一個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，但養(yǎng)殖過程中濫用抗生素，已成為一個(gè)嚴(yán)重的水產(chǎn)品安全問題。為此我國(guó)在《動(dòng)物性食品獸藥殘留規(guī)定》中規(guī)定可食部分不得檢出，并且在出口的日常檢測(cè)中，將其列為必檢項(xiàng)目，一旦發(fā)現(xiàn)超標(biāo)，一律禁止出口。目前現(xiàn)場(chǎng)篩查用檢測(cè)試劑多用氯霉素膠體金試紙進(jìn)行檢測(cè)，但因其靈敏度低不能很好滿足要求， 因此需要開發(fā)可在現(xiàn)場(chǎng)更為準(zhǔn)確和快速的檢測(cè)方法?；诳乖?抗體免疫學(xué)反應(yīng)的側(cè)流免疫層析檢測(cè)技術(shù)(LFIAs)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的新興技術(shù)，因其快捷方便的特性，非常適宜用于現(xiàn)場(chǎng)的快速監(jiān)測(cè)。但目前該類技術(shù)多采用膠體金作為信號(hào)標(biāo)記分子，受其靈敏度等的限制，只能用于定性檢測(cè)。超順磁性復(fù)合粒子具有良好的磁學(xué)特性，由于其受背景干擾小，特別適宜于不含磁性物質(zhì)的生物樣品的檢測(cè)。膠體金和熒光標(biāo)記分子用于測(cè)流免疫層析檢測(cè)時(shí)，只可在其檢測(cè)區(qū)膜表面觀測(cè)到約10%的信號(hào)分子強(qiáng)度，而用超順磁性復(fù)合粒子作為標(biāo)記材料，則可檢測(cè)到檢測(cè)區(qū)膜三維立體結(jié)構(gòu)中的所有磁信號(hào)分子，可極大提高靈敏度，并可用對(duì)應(yīng)的磁信號(hào)檢測(cè)儀達(dá)到定量測(cè)定，因此，超順磁性復(fù)合粒子是近年來在LFIAs中受到關(guān)注的材料。然而，目前報(bào)道的生物檢測(cè)用磁性納米復(fù)合粒子多采用化學(xué)法如共沉淀法先制備得到有機(jī)相的磁性納米粒子后，再采用硅(SiO2)或聚苯乙烯、聚丙烯酸、明膠等高分子材料對(duì)其表面進(jìn)行穩(wěn)定化包覆修飾，以得到穩(wěn)定的、水溶性的磁性標(biāo)記材料。但這些制備修飾方法往往較為繁瑣復(fù)雜，得到的超順磁性復(fù)合粒子在尺寸大小、生物相容性、飽和磁強(qiáng)度、外磁場(chǎng)響應(yīng)速度、穩(wěn)定性和標(biāo)記效率等方面不能同時(shí)滿足LFIAs的要求其尺寸多在200 300nm之間，由于磁珠顆粒偏大，在試紙上的泳動(dòng)時(shí)間較慢，顯色時(shí)間較長(zhǎng)；而太小的粒子又無法提供足夠的磁共振信號(hào)；另外還有生物相容性不穩(wěn)定、磁珠容易聚合等問題；這些不足限制了超順磁性復(fù)合粒子在LFIAs中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙。本發(fā)明提供的檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的反應(yīng)墊、連接于所述反應(yīng)墊另一端的吸水墊；所述反應(yīng)墊包被有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線含有氯霉素抗原，所述質(zhì)控線含有能與所述氯霉素抗體特異結(jié)合的抗抗體。所述反應(yīng)墊為硝酸纖維素膜；所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體為將氯霉素抗體和超順磁性復(fù)合粒子的以肽鍵共價(jià)結(jié)合形成的聚合體；所述氯霉素抗體為氯霉素單克隆抗體或氯霉素多克隆抗體，所述氯霉素抗體具體為氯霉素單克隆抗體(云南大學(xué)單克隆抗體工程技術(shù)中心，CAP-001)；所述氯霉素抗原為氯霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；小分子抗原物質(zhì)與載體蛋白偶聯(lián)時(shí)，每個(gè)載體蛋白分子上所連接的半抗原的平均數(shù)目稱為偶聯(lián)比或結(jié)合比。為達(dá)到載體蛋白與NC膜的良好結(jié)合，同時(shí)又能最大程度地保證氯霉素半抗原空間位點(diǎn)的延展，選擇合適的偶聯(lián)比是非常重要的。偶聯(lián)比的大小與半抗原功能基團(tuán)的活性、位阻、反應(yīng)投料比及反應(yīng)條件有關(guān)。一般通過調(diào)節(jié)半抗原與載體的摩爾比、反應(yīng)環(huán)境PH值、溫度、離子強(qiáng)度等來控制偶聯(lián)比。所述載體蛋白與所述氯霉素半抗原的偶聯(lián)比為1 8 1 10，適于抗原的包被和氯霉素半抗原空間位點(diǎn)的延展，所述載體蛋白與所述氯霉素半抗原的偶聯(lián)比具體為 1 10 ；所述與所述氯霉素抗體特異結(jié)合的抗抗體為羊抗鼠IgG抗體；所述氯霉素抗原和所述羊抗鼠IgG抗體的濃度均為lmg/ml。所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體按照如下方法制備1)將每2.5mg超順磁性復(fù)合粒子、0.96mgl-乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)U. 15mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和Iml濃度為0. 1Μ、ρΗ值為4. 7的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液(稱取1. 066g MES,0. 45g NaCl溶于50ml純水，調(diào)pH至4. 7)混勻，反應(yīng)，得到活化后磁性粒子；2)將每2. 5mg步驟1)得到活化后磁性粒子、0. 15mg氯霉素抗體和0. 8ml濃度為 50mM pH為8. 5的硼砂緩沖液混勻、反應(yīng)，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應(yīng)液；3)向步驟2)得到的反應(yīng)液中加入BSA混勻得到混合液、反應(yīng)，得到含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液；所述BSA在所述混合液中的濃度為5% (質(zhì)量百分含量)。所述氯霉素抗原按照如下方法制備A)將每50mg氯霉素半抗原、Iml無水乙醇、鋅粉混勻，反應(yīng)，得到反應(yīng)液a ；B)將步驟A)得到的反應(yīng)液a離心取上清液，每Iml上清液(逐滴)加入ISOul濃度為1. 45mol/L的NaNO2水溶液，反應(yīng)，得到溶液b ；C)將每400mg載體蛋白和IOml濃度為0. 02mol/L、pH為7. 4的PBS緩沖液混合， 得到溶液c ；D)將每Iml步驟B)得到的溶液b和IOml步驟C)得到的溶液c混勻，反應(yīng)，得到反應(yīng)液do所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體的制備方法中步驟1)中，反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)時(shí)間為0. 5h ；步驟2)中，反應(yīng)溫度為25°C，反應(yīng)時(shí)間為3. 5h ；步驟3)中，反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)時(shí)間為0.證。
所述氯霉素抗原的制備方法中步驟A)中，反應(yīng)溫度為65°C，反應(yīng)時(shí)間為40分鐘；反應(yīng)的pH值為1 ；步驟B)中，反應(yīng)時(shí)間為池；反應(yīng)溫度為4°C，反應(yīng)pH值為1 ；離心的時(shí)間為IOmiru 離心的離心力為4000g，離心的溫度為4°C ；步驟C)中，所述反應(yīng)的溫度為4°C，所述反應(yīng)的時(shí)間為6h，所述反應(yīng)的pH值為 8. 5。所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體的制備方法中在所述步驟幻后，還包括將所述含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液中的封閉后磁性粒子進(jìn)行洗滌、懸浮，得到超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體的步驟，所述洗滌液和懸浮液均為0. 02M pH為7. 4的PBS緩沖液；所述氯霉素抗原的制備方法中，在所述步驟D)后還包括如下步驟E)將步驟D)得到的反應(yīng)液d透析、凍干，得到氯霉素抗原；所述透析采用的透析液為濃度為0. 02mol/L、pH為7. 4的PBS緩沖液，透析時(shí)間為 48h，每12h更換一次透析液。所述氯霉素半抗原為氯霉素；所述載體蛋白為BSA;由于氯霉素是小分子物質(zhì)，其分子表面特性不利于與反應(yīng)區(qū)即NC膜的直接結(jié)合，需要將其與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)后才能借助于載體蛋白的表面特性而達(dá)成與NC膜的良好結(jié)合?？捎米鬏d體蛋白的有各種動(dòng)物的血清白蛋白，如牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)，還有鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、甲狀腺球蛋白、兔血清白蛋白(RSA)、卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)、纖維蛋白原或兔和雞的丙種球蛋白等。研究發(fā)現(xiàn)，BSA理化性質(zhì)穩(wěn)定，賴氨酸含量高， 自由氨基多，在不同的PH和離子強(qiáng)度下均有較大的溶解度，在含有有機(jī)溶劑(如吡啶、DMF 等)的情況下均可和半抗原進(jìn)行偶聯(lián)，且在偶聯(lián)后仍保持可溶狀態(tài)，是作為載體蛋白的極佳選擇，故本發(fā)明選用BSA作為偶聯(lián)蛋白。所述超順磁性復(fù)合粒子為!^e3O4納米粒子；由于該超順磁性復(fù)合粒子要由上述反應(yīng)板中的樣品墊泳動(dòng)至反應(yīng)板中間的測(cè)試區(qū)實(shí)現(xiàn)抗原-抗體的特異結(jié)合和標(biāo)記反應(yīng)，其粒徑太大(> 300nm)在試紙上的泳動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)，顯色時(shí)間慢；在偶聯(lián)時(shí)較容易發(fā)生聚集，并容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)；粒徑太小則磁強(qiáng)度又往往不夠。所述超順磁性復(fù)合粒子的粒徑為60 300nm，所述粒徑具體為80 200nm，所述粒徑尤其優(yōu)選為IOOnm ；其粒徑的偏差(CV)在10 30%之間，較好為10 20%之間，優(yōu)選 15%。超順磁性復(fù)合粒子的飽和磁強(qiáng)度及其外磁場(chǎng)響應(yīng)速度直接決定了檢測(cè)靈敏度及其精確性的高低，傳統(tǒng)方法制備的超順磁性復(fù)合粒子的飽和磁強(qiáng)度通常都< 30emU/g，外磁場(chǎng)響應(yīng)速度則在100 200秒。為提高其靈敏度及準(zhǔn)確性，所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強(qiáng)度為30 SOemu/ g，對(duì)應(yīng)的外磁場(chǎng)響應(yīng)速度為20 100秒，所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強(qiáng)度具體為35 70emu/g，對(duì)應(yīng)的外磁場(chǎng)響應(yīng)速度為20 50秒，所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強(qiáng)度尤其優(yōu)選為40emu/g，對(duì)應(yīng)的外磁場(chǎng)響應(yīng)速度為20秒；為用于氯霉素殘留物檢測(cè)，超順磁性復(fù)合粒子表面需帶有易于與氯霉素抗體偶聯(lián)的基團(tuán)，這些基團(tuán)可以是羧基、氨基等基團(tuán)，優(yōu)化的基團(tuán)是帶羧基的表面官能團(tuán)，通常采用化學(xué)方法連接抗體，即用EDC和NHS活化超順磁性復(fù)合粒子后，再與抗體發(fā)生羧合反應(yīng)而完成偶聯(lián)反應(yīng)。在將氯霉素抗體和超順磁性復(fù)合粒子的以肽鍵共價(jià)結(jié)合形成的聚合體前，還包括活化所述超順磁性復(fù)合粒子表面官能團(tuán)的步驟。超順磁性復(fù)合粒子表面的羧基含量不同會(huì)影響到檢測(cè)的靈敏度，為提高靈敏度，所述官能團(tuán)具體為羧基，所述羧基的含量為 50 500 μ mol/g,所述羧基的含量具體為50 300 μ mol/g,所述羧基的含量尤其優(yōu)選為 80 μmol/g ；在免疫檢測(cè)中，抗體的性能指標(biāo)對(duì)于檢測(cè)的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，通常而言，特異性強(qiáng)、親和力高的抗體，可以顯著地提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所選用的氯霉素抗體與氯霉素琥珀酸鈉有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)外，與其它的氯霉素結(jié)構(gòu)類似物如甲砜霉素等的交叉反應(yīng)需小于0. 1，否則會(huì)因交叉反應(yīng)產(chǎn)生假陽性。所述氯霉素抗體親和常數(shù)為IO6 IO8M-1 ；所述氯霉素抗體親和常數(shù)具體為IO7 IO8M-1 ；所述氯霉素抗體親和常數(shù)尤其優(yōu)選為IO8MA本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟I、分別制備樣品墊和含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊；II、將步驟I得到的樣品墊、步驟I得到的含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊與吸水墊依次粘貼到背板上，得到檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙；所述含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊按照如下方法制備將所述氯霉素抗原和所述與氯霉素抗體特異結(jié)合的抗抗體分別噴在反應(yīng)墊的兩端不同區(qū)域，形成檢測(cè)線和質(zhì)控線， 得到含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊；所述樣品墊按照如下方法制備將所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體噴到玻璃纖維紙上，得到樣品墊。在所述樣品墊制備方法中在將所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體噴到所述玻璃纖維紙上前，還包括預(yù)處理所述玻璃纖維紙和預(yù)處理所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體的步驟所述預(yù)處理所述玻璃纖維紙為將所述玻璃纖維紙?jiān)诰彌_液中浸泡1小時(shí)，每IL所述緩沖液按照如下方法制備將每aiilTritonX100、10g BSA、50g蔗糖和950ml濃度為0. 02M、pH為7. 4的PBS緩沖液混合得到緩沖液，調(diào)pH到7. 4，并定容到 1000ml。所述浸泡的時(shí)間為1小時(shí)，浸泡的溫度為37°C ；所述預(yù)處理所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體為將所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體稀釋，所述稀釋倍數(shù)為50倍。所述稀釋液為預(yù)處理玻璃纖維紙中所用的緩沖液。所述反應(yīng)墊為硝酸纖維素膜。
在步驟I后，步驟II前，還包括干燥步驟I得到的樣品墊與步驟I得到的含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的步驟。所述試紙?jiān)跈z測(cè)樣品中殘留氯霉素中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，所述樣品具體為動(dòng)物組織樣本、動(dòng)物尿樣、飼料、蜂蜜或牛奶樣本，所述樣品尤其具體為豬尿。本發(fā)明的技術(shù)原理本發(fā)明的氯霉素檢測(cè)試劑與超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記的免疫層析檢測(cè)技術(shù)相關(guān)，是采用超順磁性復(fù)合粒子作為標(biāo)記材料，進(jìn)行快速免疫層析測(cè)定的一類方法，該技術(shù)整合了磁性納米材料化學(xué)合成、標(biāo)記技術(shù)、測(cè)流免疫層析技術(shù)等相關(guān)領(lǐng)域的研究。本發(fā)明之所以能檢測(cè)氯霉素，在于采用了一種基于超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記的測(cè)流免疫層析檢測(cè)的方法，即將氯霉素抗原和抗鼠IgG抗體分別噴涂于位于反應(yīng)板中間的測(cè)試區(qū)(由硝酸纖維素膜即NC膜構(gòu)成)的測(cè)試線(T線)和質(zhì)控線(C線)處，反應(yīng)板下端的樣品墊上噴涂超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記的抗氯霉素抗體，反應(yīng)板上端則連接有吸水墊，整個(gè)反應(yīng)板的構(gòu)成如圖1所示?；跍y(cè)流免疫層析的原理，加入待測(cè)樣品后，樣品中的氯霉素與T 線處噴涂的氯霉素抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磁標(biāo)氯霉素抗體，在T線處形成抗原-抗體二元磁標(biāo)免疫復(fù)合物，多余的磁標(biāo)氯霉素抗體則在C線處與抗鼠IgG形成的磁標(biāo)免疫復(fù)合物。用磁性試紙判讀儀測(cè)定T線處超順磁性微球的磁強(qiáng)強(qiáng)度，通過與設(shè)定的閾值比對(duì)而確定其陽性或陰性結(jié)果，C線測(cè)定結(jié)果則作為該測(cè)定方法的質(zhì)控內(nèi)標(biāo)。其具體的技術(shù)步驟包括(一 )超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記探針的制備采用適合的納米超順磁性復(fù)合粒子，活化其表面的羧基后，采用化學(xué)偶聯(lián)的方式將氯霉素抗體定向連接到該超順磁性復(fù)合粒子表面。( 二)測(cè)試區(qū)T線和C線處抗原/抗體的包被采用專門的噴膜儀器，于測(cè)試區(qū)的T線處噴涂氯霉素抗原，于C線處噴涂抗鼠IgG 抗體。(三)樣品墊處標(biāo)記探針的包被采用專門的噴涂?jī)x器，于樣品墊特定位置處噴涂超順磁性微球標(biāo)記的抗氯霉素抗體。(四)反應(yīng)板的組裝成型按照反應(yīng)板的結(jié)構(gòu)圖(見圖1)要求，于塑料支撐背板中間粘貼作為測(cè)試區(qū)的硝酸纖維素(NC)膜，于NC膜的T線端粘貼樣品墊，C線端粘貼吸水墊。在其上面粘貼透明保護(hù)膜。采用專門的試紙分切機(jī)，將整塊反應(yīng)板分切為一定寬帶的紙條，用裝有干燥劑的專門的鋁箔袋進(jìn)行包裝。(五)抗原-抗體磁標(biāo)免疫復(fù)合物的形成于上述組裝成型的反應(yīng)板的加樣孔處加入待測(cè)樣品，樣品中的氯霉素與T線處噴涂的氯霉素抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合磁標(biāo)氯霉素抗體，在T線處形成抗原-抗體二元磁標(biāo)免疫復(fù)合物， 多余的磁標(biāo)氯霉素抗體則在C線處與抗鼠IgG形成的磁標(biāo)免疫復(fù)合物。(六)磁標(biāo)免疫復(fù)合物磁場(chǎng)強(qiáng)度檢測(cè)用磁性試紙判讀儀測(cè)定T線處超順磁性微球的磁場(chǎng)強(qiáng)度，通過與設(shè)定的閾值比對(duì)而確定其陽性或陰性結(jié)果，C線測(cè)定結(jié)果則作為該測(cè)定方法的質(zhì)控內(nèi)標(biāo)。
本發(fā)明采用的超順磁性復(fù)合粒子是購自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為MP-2(聚馬來酸十六醇酯(PMAH)修飾的水溶性納米晶TEM照片見圖2)，所采用的制備方法是將用化學(xué)法制得的油溶性I^e3O4溶解在有機(jī)試劑中得到溶液A，將雙親性齊聚物溶于3 次蒸餾水中并調(diào)節(jié)pH為8 10得溶液B，常溫下將溶液B注入溶液A中，混合液進(jìn)行充分?jǐn)嚢璨⑹褂袡C(jī)溶劑揮發(fā)，進(jìn)行離心分離，將離心分離的產(chǎn)物干燥后即可得水溶性的超順磁性復(fù)合粒子。用該法制備獲得的磁性粒子飽和磁強(qiáng)度高、磁響應(yīng)快、磁珠尺寸均勻、單分散性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、涌動(dòng)時(shí)間快，可很好地滿足LFIAs的檢測(cè)要求。所述的抗原-抗體磁標(biāo)免疫復(fù)合物，是指加入檢測(cè)樣品后，經(jīng)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，在T線處形成的氯霉素抗原-磁標(biāo)氯霉素抗體免疫復(fù)合物，以及在C線處形成的抗鼠IgG 二抗抗體-磁標(biāo)氯霉素抗體免疫復(fù)合物。所述的磁標(biāo)免疫復(fù)合物的磁場(chǎng)強(qiáng)度，是指在T線和C線處分別滯留下的結(jié)合磁珠的數(shù)量用美國(guó)Quantum Dot的超順磁共振檢測(cè)儀MAR測(cè)定后所得到的數(shù)值。通過優(yōu)化競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的條件，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大量測(cè)定不同來源如尿樣、血液及組織樣品提取液等的正常樣本，可確定出各不同來源正常樣本的測(cè)定均值，以此作為臨界值(cutoff)來確定T線檢測(cè)樣本的陽性或陰性結(jié)果。C線測(cè)定結(jié)果則作為該測(cè)定方法的質(zhì)控內(nèi)標(biāo)。氯霉素的化學(xué)名稱為D-蘇式_(-)-N-[(-(羥基甲基)-(_羥基-對(duì)硝基苯乙基]-2，2-二氯乙酰胺。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，通過對(duì)超順磁性復(fù)合粒子、氯霉素抗原和氯霉素抗體分子特性的研究，通過對(duì)多種超順磁性復(fù)合粒子制備、包覆及表面修飾條件的優(yōu)化，選擇適合的超順磁性復(fù)合粒子與特異性的抗體進(jìn)行定向共價(jià)化學(xué)偶聯(lián)，獲得功能性的磁性標(biāo)記探針，并通過優(yōu)化競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)的各種條件，達(dá)到對(duì)氯霉素殘留藥物的客觀檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)氯霉素殘留藥物的快速和高靈敏測(cè)定。具有如下優(yōu)點(diǎn)靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)客觀化測(cè)定。


圖1為磁性試紙結(jié)構(gòu)示意2為聚馬來酸十六醇酯(PMAH)修飾的水溶性納米晶TEM照片圖3為氯霉素磁性試紙檢測(cè)值與濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、氯霉素殘留物磁性標(biāo)記快速檢測(cè)試紙的制備(一 )超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體的制備采用粒徑為lOOnm、磁飽和強(qiáng)度為40emu/g，對(duì)應(yīng)的外磁場(chǎng)響應(yīng)速度為20秒、表面羧基含量為80 μ mol/g的超順磁性復(fù)合粒子(超順磁性!^e3O4納米粒子)(購自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為MP-2)標(biāo)記氯霉素抗體。具體方法是1)取2. 5mg的上述磁性粒子用0. IM的MES緩沖液(稱取1. 066g MES,0. 45g NaCl溶于50ml純水，調(diào)pH至4. 7)洗滌并用0. 4T的磁架分離富集后，用Iml濃度為0. 1M、PH值為4. 7的MES緩沖液重懸，加入0. 96mg (終濃度為5mM)的1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基) 碳二亞胺(EDC)和1. 15mg (終濃度為IOmM) N-羥基丁二酰亞胺(NHS)于其中。反應(yīng)溫度為 37°C，反應(yīng)半小時(shí)后，得到活化后磁性粒子；2)用50mM pH = 8. 5的硼砂緩沖液洗滌，取0. 15mg氯霉素單克隆抗體(云南大學(xué)單克隆抗體工程技術(shù)中心，CAP-001，氯霉素抗體效價(jià)106，氯霉素抗體親和常數(shù)為IO8M-1)和 2. 5mg活化后磁性粒子混合到0. 8ml 50mM pH = 8. 5的硼砂緩沖液(稱取1. 9gNa2B407. IOH2O 溶于IOOml純水，調(diào)pH至8. 5)中充分混勻。室溫(25°C )下反應(yīng)3. 5小時(shí)，讓抗體和磁性粒子形成穩(wěn)定的肽鍵共價(jià)結(jié)合，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應(yīng)液；3)反應(yīng)結(jié)束后，向步驟2)得到的反應(yīng)液中加入終濃度為5% (質(zhì)量百分含量)的 BSA(Sigma-aldrich,85041C)對(duì)剩余活性氨基位點(diǎn)進(jìn)行封閉，反應(yīng)在37°C下進(jìn)行0. 5小時(shí)， 得到含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液；完成后，用PH = 7. 4的0. 02M PBS緩沖液(稱取2. 3g Na2HPO4^O. 524g NaH2PO4. H20,8. 77g NaCL 溶于 IL 純水，調(diào) pH 至 7. 4)洗滌，重懸后 4°C保存待用，得到超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體。(二)氯霉素抗原的合成氯霉素半抗原為氯霉素(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，2857GBW(E) 060907)。CAP-BSA抗原的合成采用重氮化法，具體步驟如下(1)取50mg氯霉素溶解于Iml 無水乙醇溶液中，用lmol/L HCl調(diào)PH至1.0，然后加入Mmg鋅粉65°C反應(yīng)40分鐘，得到反應(yīng)液a ； (2)反應(yīng)液a離心(離心的時(shí)間為IOmiru離心的離心力為4000g，離心的溫度為 40C )，取上清液，用lmol/L HCl調(diào)pH至1. 0，于4°C逐滴加入180ul濃度為1. 45mol/L的 NaNO2水溶液，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)3h，得到溶液b ； ( 在IOml 0. 02mol/L, pH為7. 4的PBS中加入 400mg BSA (Sigma-aldrich, 85041C)配制成 40g/L 的 BSA-PBS 溶液(溶液 c)，(4)將 Iml (2)所得溶液b中加入BSA-PBS溶液10ml，用2mol/l NaOH調(diào)節(jié)至pH至8. 5，于4°C下進(jìn)行耦合反應(yīng)他；得到反應(yīng)液d ； (5)將反應(yīng)液d于0. 02mol/L,pH為7. 4的PBS中透析48h， 每1 更換一次透析液。所得產(chǎn)品用凍干機(jī)凍干，于_20°C保存，得到氯霉素抗原。(三)氯霉素磁標(biāo)快速檢測(cè)試紙的制備采用0. 02M PBS(pH= 7. 4)緩沖液，將羊抗鼠IgG抗體(長(zhǎng)沙博優(yōu)生物科技有限公司，ABGAM-0500)和上述(二)得到的氯霉素抗原的濃度均配制為濃度lmg/ml，選用BioDot 的XYB050噴膜系統(tǒng)中的BioJet噴頭將羊抗鼠IgG抗體噴至硝酸纖維素膜(NC膜)的控制線(Control Line，C線)位置，將上述(二)得到的氯霉素抗原噴至檢測(cè)線(Test Line, T 線)位置，于相對(duì)濕度為10%以下的干燥車間進(jìn)行抽濕4小時(shí)后干燥待用。用膜處理緩沖液(每IL所述緩沖液按照如下方法制備將每aiilTritonX100、10g BSA、50g蔗糖和950ml 濃度為0. 02M、pH為7. 4的PBS緩沖液混合得到緩沖液，調(diào)pH到7. 4，并定容到1000ml)浸泡玻璃纖維紙1小時(shí)，浸泡的溫度為37°C，于同樣的抽濕條件進(jìn)行抽濕4小時(shí)后，用上述膜處理緩沖液按50倍稀釋順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記的氯霉素抗體后，采用BioDot的XYB050噴膜系統(tǒng)中的AirJet噴頭將此稀釋磁標(biāo)抗體噴涂至上述處理過的玻璃纖維素膜上制備形成樣品墊，于同樣的抽濕條件進(jìn)行干燥。在10萬級(jí)潔凈和干燥的車間中把上述干燥好的NC 膜、磁墊、吸水紙、背板和保護(hù)膜按圖1所示進(jìn)行搭配組裝后，采用BioDot的CM4000裁切系統(tǒng)將貼好的紙板裁切為5mm/條的寬度，裝入檢測(cè)用夾片待用，得到檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙。該試紙的結(jié)果示意圖如圖1所示。實(shí)施例2、氯霉素殘留物的免疫層析試紙靈敏度、交叉反應(yīng)和準(zhǔn)確度的檢測(cè)1、靈敏度的測(cè)定稱取適量氯霉素(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，產(chǎn)品目錄號(hào) 2857GBff(E) 060907)，以甲醇配制為100ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。用0. 02M的PBS (pH = 7. 4) 稀釋配制為0,0. 001,0. 005,0.01,0. 05,0. l、l、5、10ug/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入由實(shí)施例1 得到的檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙中，并采用超順磁共振檢測(cè)儀MAR(MagnaBic^Ciences， 8094-101-01 & 8094-101-02)讀取。檢測(cè)步驟檢測(cè)前先將待檢測(cè)樣品恢復(fù)室溫(25°C ), 用精確移液器取待檢測(cè)樣品100 μ 1垂直緩慢滴入磁性試紙條的加樣端，然后滴入50ul沖洗液(0. 02M, pH 7. 4，PBS)，20分鐘后用MAR進(jìn)行測(cè)試。其檢測(cè)結(jié)果如下表1所示。從檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)氯霉素濃度為0. 001ug/L 時(shí)檢測(cè)值與Oug/L時(shí)的檢測(cè)值有交叉，當(dāng)濃度為0. 005ug/L時(shí)檢測(cè)值與0ug/L值可以完全區(qū)分開，且濃度曲線R2 = 0. 9868，線性較好，說明試紙的檢測(cè)靈敏度能達(dá)到0. 005ug/L。氯霉素磁性試紙檢測(cè)值與濃度曲線圖如圖3所示。表1氯霉素不同濃度樣品的磁性試紙檢測(cè)值
氯霉素濃度(ug/L)
00.0010.0050.010.050.10.51510檢測(cè)試1356.3355.1322.5270.5236.5195.6138.6107.836.930.9測(cè)測(cè)試2341.5332.6326.2273.7241.3200.2135.4102.438.732.5值平均值348.9343.85324.4272.1238.9197.9137.0105.137.831.72、交叉反應(yīng)的測(cè)定選擇氯霉素琥珀酸鈉(Sigma-aldriCh，C3787-5G)、氟甲砜霉素(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，30242⑶CT-C13665000)、甲砜霉素(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，14814 NIC-130433)、氨卞西林(Sigma-aldrich，A9393-5G)和磺胺二甲基嘧啶(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，30137⑶CT-C16996500)5種藥物，分別配成系列濃度，用由實(shí)施例1的檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算各競(jìng)爭(zhēng)物的IC50，用以下公式分別計(jì)算這5種藥物與CAP磁性試紙的交叉反應(yīng)率。計(jì)算公式為交叉反應(yīng)率(％ ) = [IC50(CAP)/IC50(待測(cè)藥物)]X 100。測(cè)定及計(jì)算結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，氯霉素磁性試紙除對(duì)氯霉素琥珀酸鈉有較高交叉反應(yīng)而對(duì)其余4種交叉反應(yīng)率都小于0. 1 %。表2氯霉素磁性試紙與其它藥物的交叉反應(yīng)
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的反應(yīng)墊、連接于所述反應(yīng)墊另一端的吸水墊；所述反應(yīng)墊包被有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線含有氯霉素抗原，所述質(zhì)控線含有能與所述氯霉素抗體特異結(jié)合的抗抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙，其特征在于 所述反應(yīng)墊為硝酸纖維素膜；所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體為氯霉素抗體和超順磁性復(fù)合粒子的肽鍵共價(jià)結(jié)合形成的聚合體；所述氯霉素抗體為氯霉素單克隆抗體或氯霉素多克隆抗體，所述氯霉素抗體具體為氯霉素單克隆抗體；所述氯霉素抗原為氯霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；所述載體蛋白與氯霉素半抗原的偶聯(lián)比為1 8 1 10，所述載體蛋白與氯霉素半抗原的偶聯(lián)比具體為1 10;所述與所述氯霉素抗體特異結(jié)合的抗抗體為羊抗鼠IgG抗體； 所述氯霉素抗原和所述羊抗鼠IgG抗體的濃度均為lmg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試紙，其特征在于所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體按照如下方法制備1)將每2.5mg超順磁性復(fù)合粒子、0. 96mgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺、 1. 15mg N-羥基丁二酰亞胺和Iml濃度為0. 1M、PH值為4. 7的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液混勻，反應(yīng)，得到活化后磁性粒子；2)將每2.5mg步驟1)得到活化后磁性粒子、0. 15mg氯霉素抗體和0. 8ml濃度為50mM PH為8. 5的硼砂緩沖液混勻、反應(yīng)，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應(yīng)液；3)向步驟幻得到的反應(yīng)液中加入BSA混勻得到混合液、反應(yīng)，得到含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液；所述BSA在所述混合液中的濃度為5% (質(zhì)量百分含量)， 所述氯霉素抗原按照如下方法制備A)將每50mg氯霉素半抗原、Iml無水乙醇、鋅粉混勻，反應(yīng)，得到反應(yīng)液a；B)將步驟A)得到的反應(yīng)液a離心取上清液，每Iml上清液加入ISOul濃度為1.45mol/ L的NaNO2水溶液反應(yīng)，得到溶液b ；C)將每400mg載體蛋白和IOml濃度為0.02mol/L、pH為7. 4的PBS緩沖液混合，得到溶液c ；D)將每Iml步驟B)得到的溶液b和IOml步驟C)得到的溶液c混勻，反應(yīng)，得到反應(yīng)液d。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的試紙，其特征在于 所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體的制備方法中 步驟1)中，所述反應(yīng)溫度為37°C，所述反應(yīng)時(shí)間為0. 5h, 步驟2)中，所述反應(yīng)溫度為25°C，所述反應(yīng)時(shí)間為3. 5h, 步驟3)中，所述反應(yīng)溫度為37°C，所述反應(yīng)時(shí)間為0. 5h, 所述氯霉素抗原的制備方法中，步驟A)中，所述反應(yīng)溫度為65°C，所述反應(yīng)時(shí)間為40分鐘；所述反應(yīng)的pH值為1 ； 步驟B)中，所述反應(yīng)時(shí)間為池；所述反應(yīng)溫度為4°C，所述反應(yīng)pH值為1 ；所述離心的時(shí)間為IOmiru所述離心的離心力為4000g，所述離心的溫度為4°C ；步驟C)中，所述反應(yīng)的溫度為4°C，所述反應(yīng)的時(shí)間為6h，所述反應(yīng)的PH值為8. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試紙，其特征在于 所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體的制備方法中在所述步驟幻后，還包括將所述含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液中的封閉后磁性粒子進(jìn)行洗滌、懸浮，得到超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體的步驟，所述洗滌液和懸浮液均為濃度為0. 02M pH為7. 4的PBS緩沖液； 所述氯霉素抗原的制備方法中， 在所述步驟D)后還包括如下步驟E) 將步驟D)得到的反應(yīng)液d透析、凍干，得到氯霉素抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的試紙，其特征在于 所述氯霉素半抗原為氯霉素；所述載體蛋白為BSA;所述超順磁性復(fù)合粒子為!^e3O4納米粒子；所述超順磁性復(fù)合粒子的粒徑為60 300nm，所述粒徑具體為80 200nm，所述粒徑尤其優(yōu)選為IOOnm ；所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強(qiáng)度為30 80emu/g，對(duì)應(yīng)的外磁場(chǎng)響應(yīng)速度為20 100秒，所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強(qiáng)度具體為35 70emu/g，對(duì)應(yīng)的外磁場(chǎng)響應(yīng)速度為20 50秒，所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強(qiáng)度尤其優(yōu)選為40emu/g，對(duì)應(yīng)的外磁場(chǎng)響應(yīng)速度為20秒；所述超順磁性復(fù)合粒子表面的羧基含量為50 500ymol/g，所述超順磁性復(fù)合粒子表面的羧基含量具體為50 300 μ mol/g，所述超順磁性復(fù)合粒子表面的羧基含量尤其優(yōu)選為80 μ mol/g;所述氯霉素抗體親和常數(shù)為IO6 IO8M-1 ；所述氯霉素抗體親和常數(shù)具體為IO7 IO8M-1 ；所述氯霉素抗體親和常數(shù)尤其優(yōu)選為IO8MA
7.一種制備檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙的方法，包括如下步驟I、分別制備樣品墊和含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊；II、將步驟I得到的樣品墊、步驟I得到的含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊與吸水墊依次粘貼到背板上，得到檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙；所述含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊按照如下方法制備將權(quán)利要求1-6中試紙中的所述氯霉素抗原和權(quán)利要求1-6中試紙中的所述與氯霉素抗體特異結(jié)合的抗抗體分別噴在反應(yīng)墊的兩端不同區(qū)域，形成檢測(cè)線和質(zhì)控線，得到含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊；所述樣品墊按照如下方法制備將權(quán)利要求1-6中試紙中的所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體噴到玻璃纖維紙上，得到樣品墊。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于在所述樣品墊制備方法中在將所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體噴到所述玻璃纖維紙上前，還包括預(yù)處理所述玻璃纖維紙和預(yù)處理所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體的步驟所述預(yù)處理所述玻璃纖維紙為將所述玻璃纖維紙?jiān)诰彌_液中浸泡1小時(shí)， 所述緩沖液按照如下方法制備將每anlTritonXlOOUOg BSA、50g蔗糖和950ml濃度為0. 02M、pH為7. 4的PBS緩沖液混合得到緩沖液，調(diào)pH到7. 4，并定容到1000ml。 所述浸泡的時(shí)間為1小時(shí)，浸泡的溫度為37°C ；所述預(yù)處理所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體為將所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體稀釋，所述稀釋倍數(shù)為50倍； 所述反應(yīng)墊為硝酸纖維素膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于在步驟I后，步驟II前，還包括干燥步驟I得到的樣品墊與步驟I得到的含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的步驟。
10.權(quán)利要求1-6任一所述試紙?jiān)跈z測(cè)樣品中殘留氯霉素中的應(yīng)用，所述樣品具體為動(dòng)物組織樣本、動(dòng)物尿樣、飼料、蜂蜜或牛奶樣本，所述樣品尤其具體為豬尿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙及其制備方法。本發(fā)明提供的檢測(cè)氯霉素的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記氯霉素抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的硝酸纖維素膜、連接于所述硝酸纖維素膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線含有氯霉素抗原，所述質(zhì)控線含有能與所述氯霉素抗體特異結(jié)合的抗抗體。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明提供的試紙檢測(cè)氯霉素，靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)客觀化測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102353774SQ20111015749
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月13日
發(fā)明者盧體康, 吳峰, 秦智鋒, 袁航, 馬嵐 申請(qǐng)人:清華大學(xué)深圳研究生院