專利名稱：一種檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鹽酸克倫特羅殘留物的檢測試劑，具體涉及一種檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙及其制備方法。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅(Clenbuterol hydrochloride, CL)屬于β-興奮劑，近年來被非法添加到飼料中以提高脂肪型動物的瘦肉率和加速動物生長，因其添加劑量是治療劑量的 5-10倍，以至于在動物體內(nèi)殘留量高而給消費者帶來危害。目前現(xiàn)場篩查用檢測試劑多用鹽酸克倫特羅膠體金試紙進行檢測，但因其靈敏度低不能很好滿足要求，因此需要開發(fā)可在現(xiàn)場更為準(zhǔn)確和快速的檢測方法?；诳乖?抗體免疫學(xué)反應(yīng)的側(cè)流免疫層析檢測技術(shù)(LFIAs)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的新興技術(shù)，因其快捷方便的特性，非常適宜用于現(xiàn)場的快速監(jiān)測。但目前該類技術(shù)多采用膠體金作為信號標(biāo)記分子，受其靈敏度等的限制，只能用于定性檢測。超順磁性復(fù)合粒子具有良好的磁學(xué)特性，由于其受背景干擾小，特別適宜于不含磁性物質(zhì)的生物樣品的檢測。膠體金和熒光標(biāo)記分子用于測流免疫層析檢測時，只可在其檢測區(qū)膜表面觀測到約10%的信號分子強度，而用超順磁性復(fù)合粒子作為標(biāo)記材料，則可檢測到檢測區(qū)膜三維立體結(jié)構(gòu)中的所有磁信號分子，可極大提高靈敏度，并可用對應(yīng)的磁信號檢測儀達到定量測定，因此，超順磁性復(fù)合粒子是近年來在LFIAs中受到關(guān)注的材料。然而，目前報道的生物檢測用磁性納米復(fù)合粒子多采用化學(xué)法如共沉淀法先制備得到有機相的磁性納米粒子后，再采用硅(SiO2)或聚苯乙烯、聚丙烯酸、明膠等高分子材料對其表面進行穩(wěn)定化包覆修飾，以得到穩(wěn)定的、水溶性的磁性標(biāo)記材料。但這些制備修飾方法往往較為繁瑣復(fù)雜，得到的超順磁性復(fù)合粒子在尺寸大小、生物相容性、飽和磁強度、外磁場響應(yīng)速度、穩(wěn)定性和標(biāo)記效率等方面不能同時滿足LFIAs的要求其尺寸多在200 300nm之間，由于磁珠顆粒偏大，在試紙上的泳動時間較慢，顯色時間較長；而太小的粒子又無法提供足夠的磁共振信號；另外還有生物相容性不穩(wěn)定、磁珠容易聚合等問題；這些不足限制了超順磁性復(fù)合粒子在LFIAs中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙。本發(fā)明提供的檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的反應(yīng)墊、連接于所述反應(yīng)墊另一端的吸水墊；所述反應(yīng)墊包被有相互分離的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線含有鹽酸克倫特羅抗原，所述質(zhì)控線含有能與所述鹽酸克倫特羅抗體特異結(jié)合的抗抗體。所述反應(yīng)墊為硝酸纖維素膜；所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體為將鹽酸克倫特羅抗體和超順磁性復(fù)合粒子的以肽鍵共價結(jié)合形成的聚合體；
所述鹽酸克倫特羅抗體為鹽酸克倫特羅單克隆抗體或鹽酸克倫特羅多克隆抗體， 所述鹽酸克倫特羅抗體具體為鹽酸克倫特羅單克隆抗體(北京圣迪隆生物科技有限公司， CL-083)；所述鹽酸克倫特羅抗原為鹽酸克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；小分子抗原物質(zhì)與載體蛋白偶聯(lián)時，每個載體蛋白分子上所連接的半抗原的平均數(shù)目稱為偶聯(lián)比或結(jié)合比。為達到載體蛋白與NC膜的良好結(jié)合，同時又能最大程度地保證鹽酸克倫特羅半抗原空間位點的延展，選擇合適的偶聯(lián)比是非常重要的。偶聯(lián)比的大小與半抗原功能基團的活性、位阻、反應(yīng)投料比及反應(yīng)條件有關(guān)。一般通過調(diào)節(jié)半抗原與載體的摩爾比、反應(yīng)環(huán)境PH 值、溫度、離子強度等來控制偶聯(lián)比。所述載體蛋白與所述鹽酸克倫特羅半抗原的偶聯(lián)比為1 8 1 10，適于抗原的包被和鹽酸克倫特羅半抗原空間位點的延展，所述載體蛋白與所述鹽酸克倫特羅半抗原的偶聯(lián)比具體為1 10;所述與所述鹽酸克倫特羅抗體特異結(jié)合的抗抗體為羊抗鼠IgG抗體；所述鹽酸克倫特羅抗原和所述羊抗鼠IgG抗體的濃度均為lmg/ml。所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體按照如下方法制備1)將每2.5mg超順磁性復(fù)合粒子、0.96mgl-乙基_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)U. 15mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和Iml濃度為0. 1Μ、ρΗ值為4. 7的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液(稱取1. 066g MES,0. 45g NaCl溶于50ml純水，調(diào)pH至4. 7)混勻，反應(yīng)，得到活化后磁性粒子；2)將每2. 5mg步驟1)得到活化后磁性粒子、0. 15mg鹽酸克倫特羅抗體和0. 8ml 濃度為50mM pH為8. 5的硼砂緩沖液混勻、反應(yīng)，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應(yīng)液；3)向步驟2)得到的反應(yīng)液中加入BSA混勻得到混合液、反應(yīng)，得到含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液；所述BSA在所述混合液中的濃度為5% (質(zhì)量百分含量)，所述鹽酸克倫特羅抗原按照如下方法制備A)將每^ig鹽酸克倫特羅半抗原溶解于Iml 0. 2mol/l的HCl溶液中，得到混合液 a,再加入8mg NaNO2,反應(yīng)，得到反應(yīng)液a ；B)將每40mg載體蛋白溶于8ml濃度為0. 02mol/L、pH為7. 4的PBS緩沖液，得到混合液b ；C)將每Iml步驟A)得到的反應(yīng)液a和8ml步驟B)得到的混合液b混勻，反應(yīng)，得到反應(yīng)液C。所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的制備方法中步驟1)中，反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)時間為0. 5h ；步驟2)中，反應(yīng)溫度為25°C，反應(yīng)時間為3. 5h ；步驟3)中，反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)時間為0.證。所述鹽酸克倫特羅抗原的制備方法中，步驟A)中，所述反應(yīng)溫度為4°C，所述反應(yīng)時間為池；所述反應(yīng)的pH值為1 ；步驟C)中，所述反應(yīng)溫度為4°C，所述反應(yīng)時間為Mi ；所述所述反應(yīng)的PH值為 8. 5。
所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的制備方法中在所述步驟幻后，還包括將所述含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液中的封閉后磁性粒子進行洗滌、懸浮，得到超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的步驟，所述洗滌液和懸浮液均為0. 02M pH為7. 4的PBS緩沖液。所述鹽酸克倫特羅抗原的制備方法中，在所述步驟C)后還包括將步驟C)得到的反應(yīng)液c透析、凍干，得到鹽酸克倫特羅抗原的步驟。所述透析液為濃度為0. 02mol/L、pH為7. 4的PBS緩沖液，透析時間為Mh，每Mi
更換一次透析液。所述鹽酸克倫特羅半抗原為鹽酸克倫特羅；所述載體蛋白為BSA;由于鹽酸克倫特羅是小分子物質(zhì)，其分子表面特性不利于與反應(yīng)區(qū)即NC膜的直接結(jié)合，需要將其與載體蛋白進行偶聯(lián)后才能借助于載體蛋白的表面特性而達成與NC膜的良好結(jié)合?？捎米鬏d體蛋白的有各種動物的血清白蛋白，如牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin, BSA)、人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)，還有鑰孔血藍(lán)蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、甲狀腺球蛋白、兔血清白蛋白(RSA)、卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)、纖維蛋白原或兔和雞的丙種球蛋白等。研究發(fā)現(xiàn)，BSA理化性質(zhì)穩(wěn)定，賴氨酸含量高， 自由氨基多，在不同的PH和離子強度下均有較大的溶解度，在含有有機溶劑(如吡啶、DMF 等)的情況下均可和半抗原進行偶聯(lián)，且在偶聯(lián)后仍保持可溶狀態(tài)，是作為載體蛋白的極佳選擇，故本發(fā)明選用BSA作為偶聯(lián)蛋白。所述超順磁性復(fù)合粒子為!^e3O4納米粒子；由于該超順磁性復(fù)合粒子要由上述反應(yīng)板中的樣品墊泳動至反應(yīng)板中間的測試區(qū)實現(xiàn)抗原-抗體的特異結(jié)合和標(biāo)記反應(yīng)，其粒徑太大(> 300nm)在試紙上的泳動時間長，顯色時間慢；在偶聯(lián)時較容易發(fā)生聚集，并容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)；粒徑太小則磁強度又往往不夠。所述超順磁性復(fù)合粒子的粒徑為60 300nm，所述粒徑具體為80 200nm，所述粒徑尤其優(yōu)選為IOOnm ；其粒徑的偏差(CV)在10 30%之間，較好為10 20%之間， 優(yōu)選15%。超順磁性復(fù)合粒子的飽和磁強度及其外磁場響應(yīng)速度直接決定了檢測靈敏度及其精確性的高低，傳統(tǒng)方法制備的超順磁性復(fù)合粒子的飽和磁強度通常都< 30emU/g，外磁場響應(yīng)速度則在100 200秒。為提高其靈敏度及準(zhǔn)確性，所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強度為30 80emu/g，對應(yīng)的外磁場響應(yīng)速度為20 100秒，所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強度具體為35 70emu/g，對應(yīng)的外磁場響應(yīng)速度為20 50秒，所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強度尤其優(yōu)選為40emu/g，對應(yīng)的外磁場響應(yīng)速度為20秒；為用于鹽酸克倫特羅殘留物檢測，超順磁性復(fù)合粒子表面需帶有易于與鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)的基團，這些基團可以是羧基、氨基等基團，優(yōu)化的基團是帶羧基的表面官能團，通常采用化學(xué)方法連接抗體，即用EDC和NHS活化超順磁性復(fù)合粒子后，再與抗體發(fā)生羧合反應(yīng)而完成偶聯(lián)反應(yīng)。在將鹽酸克倫特羅抗體和超順磁性復(fù)合粒子的以肽鍵共價結(jié)合形成的聚合體前，還包括將超順磁性復(fù)合粒子表面官能團即羧基的活化。超順磁性復(fù)合粒子表面的羧基含量不同會影響到檢測的靈敏度，為提高靈敏度，所述官能團具體為羧基，所述羧基的含量為50 500 μ mol/g,所述羧基的含量具體為50 300 μ mol/g,所述羧基的含量尤其優(yōu)選為80 μ mol/g;在免疫檢測中，抗體的性能指標(biāo)對于檢測的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，通常而言，特異性強、親和力高的抗體，可以顯著地提高檢測的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)，為提高靈敏度，所述鹽酸克倫特羅抗體親和常數(shù)為IO6 IO8M4 ；所述鹽酸克倫特羅抗體親和常數(shù)具體為IO7 IO8M4 ； 所述鹽酸克倫特羅抗體親和常數(shù)尤其優(yōu)選為IO8MA本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟I、分別制備樣品墊和含有檢測線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊；II、將步驟I得到的樣品墊、步驟I得到的含有檢測線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊與吸水墊依次粘貼到背板上，得到檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙；所述含有檢測線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊按照如下方法制備將所述鹽酸克倫特羅抗原和所述與鹽酸克倫特羅抗體特異結(jié)合的抗抗體分別噴在反應(yīng)墊的兩端不同區(qū)域，形成檢測線和質(zhì)控線，得到含有檢測線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊；所述樣品墊按照如下方法制備將所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體噴到玻璃纖維紙上，得到樣品墊。在所述樣品墊制備方法中在將所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體噴到所述玻璃纖維紙上前，還包括預(yù)處理所述玻璃纖維紙和預(yù)處理所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的步驟所述預(yù)處理所述玻璃纖維紙為將所述玻璃纖維紙在緩沖液中浸泡1小時，所述緩沖液按照如下方法制備將每aiilTritonX100、10g BSA、50g蔗糖和950ml 濃度為0. 02M、pH為7. 4的PBS緩沖液混合得到緩沖液，調(diào)pH到7. 4，并定容到1000ml。所述浸泡的時間為1小時，浸泡的溫度為37°C ；所述預(yù)處理所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體為將所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體稀釋，所述稀釋倍數(shù)為50倍。所述稀釋液為預(yù)處理玻璃纖維紙中所用的緩沖液。所述反應(yīng)墊為硝酸纖維素膜。在步驟I后，步驟II前，還包括干燥步驟I得到的樣品墊與步驟I得到的含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的步驟。所述試紙在檢測樣品中殘留鹽酸克倫特羅中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍，所述樣品具體包括動物組織樣本、動物尿樣或飼料，所述樣品尤其具體為豬尿。本發(fā)明的技術(shù)原理本發(fā)明的鹽酸克倫特羅檢測試劑與超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記的免疫層析檢測技術(shù)相關(guān)，是采用超順磁性復(fù)合粒子作為標(biāo)記材料，進行快速免疫層析測定的一類方法，該技術(shù)整合了磁性納米材料化學(xué)合成、標(biāo)記技術(shù)、測流免疫層析技術(shù)等相關(guān)領(lǐng)域的研究。本發(fā)明之所以能檢測鹽酸克倫特羅，在于采用了一種基于超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記的測流免疫層析檢測的方法，即將鹽酸克倫特羅抗原和抗鼠IgG抗體分別噴涂于位于反應(yīng)板中間的測試區(qū)(由硝酸纖維素膜即NC膜構(gòu)成)的測試線(T線)和質(zhì)控線(C線)處，反應(yīng)板下端的樣品墊上噴涂超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記的抗鹽酸克倫特羅抗體，反應(yīng)板上端則連接有吸水墊，整個反應(yīng)板的構(gòu)成如圖1所示。基于測流免疫層析的原理，加入待測樣品后， 樣品中的鹽酸克倫特羅與T線處噴涂的鹽酸克倫特羅抗原競爭結(jié)合磁標(biāo)鹽酸克倫特羅抗體，在T線處形成抗原-抗體二元磁標(biāo)免疫復(fù)合物，多余的磁標(biāo)鹽酸克倫特羅抗體則在C線處與抗鼠IgG形成的磁標(biāo)免疫復(fù)合物。用磁性試紙判讀儀測定T線處超順磁性微球的磁強強度，通過與設(shè)定的閾值比對而確定其陽性或陰性結(jié)果，C線測定結(jié)果則作為該測定方法的質(zhì)控內(nèi)標(biāo)。其具體的技術(shù)步驟包括(一 )超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記探針的制備采用適合的納米超順磁性復(fù)合粒子，活化其表面的羧基后，采用化學(xué)偶聯(lián)的方式將鹽酸克倫特羅抗體定向連接到該超順磁性復(fù)合粒子表面。( 二)測試區(qū)T線和C線處抗原/抗體的包被采用專門的噴膜儀器，于測試區(qū)的T線處噴涂鹽酸克倫特羅抗原，于C線處噴涂抗鼠IgG抗體。(三)樣品墊處標(biāo)記探針的包被采用專門的噴涂儀器，于樣品墊特定位置處噴涂超順磁性微球標(biāo)記的抗鹽酸克倫特羅抗體。(四)反應(yīng)板的組裝成型按照反應(yīng)板的結(jié)構(gòu)圖(見圖1)要求，于塑料支撐背板中間粘貼作為測試區(qū)的硝酸纖維素(NC)膜，于NC膜的T線端粘貼樣品墊，C線端粘貼吸水墊。在其上面粘貼透明保護膜。采用專門的試紙分切機，將整塊反應(yīng)板分切為一定寬帶的紙條，用裝有干燥劑的專門的鋁箔袋進行包裝。(五)抗原-抗體磁標(biāo)免疫復(fù)合物的形成于上述組裝成型的反應(yīng)板的加樣孔處加入待測樣品，樣品中的鹽酸克倫特羅與T 線處噴涂的鹽酸克倫特羅抗原競爭結(jié)合磁標(biāo)鹽酸克倫特羅抗體，在T線處形成抗原-抗體二元磁標(biāo)免疫復(fù)合物，多余的磁標(biāo)鹽酸克倫特羅抗體則在C線處與抗鼠IgG形成的磁標(biāo)免疫復(fù)合物。(六)磁標(biāo)免疫復(fù)合物磁場強度檢測用磁性試紙判讀儀測定T線處超順磁性微球的磁場強度，通過與設(shè)定的閾值比對而確定其陽性或陰性結(jié)果，C線測定結(jié)果則作為該測定方法的質(zhì)控內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明采用的超順磁性復(fù)合粒子是購自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為MP-2(聚馬來酸十六醇酯(PMAH)修飾的水溶性納米晶TEM照片見圖2)，所采用的制備方法是將用化學(xué)法制得的油溶性I^e3O4溶解在有機試劑中得到溶液A，將雙親性齊聚物溶于3 次蒸餾水中并調(diào)節(jié)pH為8 10得溶液B，常溫下將溶液B注入溶液A中，混合液進行充分?jǐn)嚢璨⑹褂袡C溶劑揮發(fā)，進行離心分離，將離心分離的產(chǎn)物干燥后即可得水溶性的超順磁性復(fù)合粒子。用該法制備獲得的磁性粒子飽和磁強度高、磁響應(yīng)快、磁珠尺寸均勻、單分散性好、穩(wěn)定性強、涌動時間快，可很好地滿足LFIAs的檢測要求。所述的抗原-抗體磁標(biāo)免疫復(fù)合物，是指加入檢測樣品后，經(jīng)競爭結(jié)合，在T線處形成的鹽酸克倫特羅抗原-磁標(biāo)鹽酸克倫特羅抗體免疫復(fù)合物，以及在C線處形成的抗鼠 IgG 二抗抗體-磁標(biāo)鹽酸克倫特羅抗體免疫復(fù)合物。
所述的磁標(biāo)免疫復(fù)合物的磁場強度，是指在T線和C線處分別滯留下的結(jié)合磁珠的數(shù)量用美國Quantum Dot的超順磁共振檢測儀MAR測定后所得到的數(shù)值。通過優(yōu)化競爭反應(yīng)的條件，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大量測定不同來源如尿樣、血液及組織樣品提取液等的正常樣本，可確定出各不同來源正常樣本的測定均值，以此作為臨界值(cutoff)來確定T線檢測樣本的陽性或陰性結(jié)果。C線測定結(jié)果則作為該測定方法的質(zhì)控內(nèi)標(biāo)。鹽酸克倫特羅的化學(xué)名稱為4-氨基-α -(叔丁胺甲基)_3，5- 二氯苯甲醇鹽酸鹽。本發(fā)明的實驗證明，通過對超順磁性復(fù)合粒子、鹽酸克倫特羅抗原和鹽酸克倫特羅抗體分子特性的研究，通過對多種超順磁性復(fù)合粒子制備、包覆及表面修飾條件的優(yōu)化， 選擇適合的超順磁性復(fù)合粒子與特異性的抗體進行定向共價化學(xué)偶聯(lián)，獲得功能性的磁性標(biāo)記探針，并通過優(yōu)化競爭性免疫反應(yīng)的各種條件，達到對鹽酸克倫特羅殘留藥物的客觀檢測，實現(xiàn)了對鹽酸克倫特羅殘留藥物的快速和高靈敏測定。具有如下優(yōu)點靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現(xiàn)客觀化測定。


圖1為磁性試紙結(jié)構(gòu)示意2為水溶性超順磁性復(fù)合粒子電鏡3為鹽酸克倫特羅磁性試紙檢測值與濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、鹽酸克倫特羅殘留物磁性標(biāo)記快速檢測試紙的制備(一 )超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的制備采用粒徑為lOOnm、磁飽和強度為40emu/g，對應(yīng)的外磁場響應(yīng)速度為20秒、表面羧基含量為80 μ mol/g的超順磁性復(fù)合粒子(超順磁性!^e3O4納米粒子)(購自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為MP-2)標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體。具體方法是1)取2. 5mg的上述磁性粒子用0. IM的MES緩沖液(稱取1. 066g MES,0. 45g NaCl 溶于50ml純水，調(diào)pH至4. 7)洗滌并用0. 4T的磁架分離富集后，用Iml濃度為0. 1Μ、ρΗ值為4. 7的MES緩沖液重懸，加入0. 96mg (終濃度為5mM)的1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基) 碳二亞胺(EDC)和1. 15mg (終濃度為IOmM) N-羥基丁二酰亞胺(NHS)于其中。反應(yīng)溫度為 37°C，反應(yīng)半小時后，得到活化后磁性粒子；2)用50mM pH = 8. 5的硼砂緩沖液洗滌，取0. 15mg鹽酸克倫特羅單克隆抗體(北京圣迪隆生物科技有限公司，CL-083，鹽酸克倫特羅抗體效價106，鹽酸克倫特羅抗體親和常數(shù)為IO8M4)和2. 5mg活化后磁性粒子混合到0. 8ml 50mM pH = 8. 5的硼砂緩沖液(稱取 1. 9g Na2B4O7. IOH2O溶于100ml純水，調(diào)pH至8. 5)中充分混勻。室溫(25°C )下反應(yīng)3. 5 小時，讓抗體和磁性粒子形成穩(wěn)定的肽鍵共價結(jié)合，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應(yīng)液；3)反應(yīng)結(jié)束后，向步驟2)得到的反應(yīng)液中加入終濃度為5% (質(zhì)量百分含量)的BSA(Sigma-aldrich,85041C)對剩余活性氨基位點進行封閉，反應(yīng)在37°C下進行0. 5小時， 得到含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液；完成后，用PH = 7. 4的0. 02M PBS緩沖液(稱取2. 3g Na2HPO4^O. 524g NaH2PO4. H20,8. 77g NaCL 溶于 IL 純水，調(diào) pH 至 7. 4)洗滌，重懸后 4°C保存待用，得到超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體。( 二)鹽酸克倫特羅抗原的合成鹽酸克倫特羅半抗原為鹽酸克倫特羅(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院， 30229CDCT-C11668550)。CL-BSA抗原的合成采用重氮化法，具體步驟如下(1)取^ig鹽酸克倫特羅(CL)溶解于Iml 0. 2mol/l的HCl溶液中，充分溶解后加 A8mg NaNO2，于4°C下充分反應(yīng)池，此時溶液變?yōu)辄S色是克倫特羅的重氮苯鹽酸鹽；反應(yīng)的 PH值為1 ；(2)在 0. 02mol/l，pH 為 7. 4 的 PBS 中加入 40mg BSA 配制成 5mg/ml 的 BSA-PBS 溶液；(3)于Iml上述制備好的重氮苯鹽酸鹽溶液中加入BSA-PBS溶液8ml，用2mol/ INaOH調(diào)節(jié)至pH為8. 5，于4°C下進行耦合反應(yīng)他，得到橘黃色溶液；(4)反應(yīng)液于0. 02mol/l,pH為7. 4的PBS中透析Mh，每6h更換一次透析液。所得產(chǎn)品用凍干機凍干后于-20°C保存，得到鹽酸克倫特羅抗原。(三)鹽酸克倫特羅磁標(biāo)快速檢測試紙的制備采用0. 02M PBS (pH = 7. 4)緩沖液，將羊抗鼠IgG抗體(長沙博優(yōu)生物科技有限公司，ABGAM-0500)和上述(二)得到的鹽酸克倫特羅抗原的濃度均配制為濃度lmg/ml，選用BioDot的XYD050噴膜系統(tǒng)中的BioJet噴頭將羊抗鼠IgG抗體噴至硝酸纖維素膜(NC 膜)的控制線(Control Line，C線)位置，將上述(二)得到的鹽酸克倫特羅抗原噴至檢測線(Test Line, T線)位置，于相對濕度為10%以下的干燥車間進行抽濕4小時后干燥待用。用含2% TritonXlOOU % BSA、1%蔗糖的0. 02M PBS (pH = 7. 4)溶液浸泡玻璃纖維紙1小時，浸泡的溫度為37°C，于同樣的抽濕條件進行抽濕4小時后，用上述膜處理緩沖液按50倍稀釋順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記的鹽酸克倫特羅抗體后，采用BioDot的XYD050噴膜系統(tǒng)中的AirJet噴頭將此稀釋磁標(biāo)抗體噴涂至上述處理過的玻璃纖維素膜上制備形成樣品墊，于同樣的抽濕條件進行干燥。在10萬級潔凈和干燥的車間中把上述干燥好的NC膜、磁墊、吸水紙、背板和保護膜按圖1所示進行搭配組裝后，采用BioDot的CM4000裁切系統(tǒng)將貼好的紙板裁切為5mm/條的寬度，裝入檢測用夾片待用，得到檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙。該試紙的結(jié)果示意圖如圖1所示。實施例2、鹽酸克倫特羅殘留物的免疫層析試紙靈敏度、交叉反應(yīng)和準(zhǔn)確度的檢測1、靈敏度的測定稱取適量鹽酸克倫特羅(北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，產(chǎn)品目錄號 30229CDCT-C11668550)，以 0. OlM HCl 配制為 100ug/ml 的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。用 0. 02M 的 PBS(pH = 7. 4)稀釋配制為 0,0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. l、l、5、10ug/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入由實施例1得到的檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙中，并采用超順磁共振檢測儀 MAR (Magna Biosciences, 8094-101-01&8094-101-02)讀取。檢測步驟檢測前先將待檢測樣品恢復(fù)室溫(25°C )，用精確移液器取待檢測樣品100 μ 1垂直緩慢滴入磁性試紙條的加樣端，然后滴入50ul沖洗液(0. 02M, pH 7. 4，PBS)，20分鐘后用MAR進行測試。其檢測結(jié)果如下表1所示。從檢測結(jié)果數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)鹽酸克倫特羅濃度為 0. 001ug/L時檢測值與Oug/L時的檢測值有交叉，當(dāng)濃度為0. 005ug/L時檢測值與Oug/ L值可以完全區(qū)分開，且濃度曲線R2 = 0. 9871，線性較好，說明試紙的檢測靈敏度能達到 0.005ug/Lo鹽酸克倫特羅磁性試紙檢測值與濃度曲線圖如圖3所示。表1鹽酸克倫特羅不同濃度樣品的磁性試紙檢測值
權(quán)利要求
1.一種檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的反應(yīng)墊、連接于所述反應(yīng)墊另一端的吸水墊； 所述反應(yīng)墊包被有相互分離的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線含有鹽酸克倫特羅抗原，所述質(zhì)控線含有能與所述鹽酸克倫特羅抗體特異結(jié)合的抗抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙，其特征在于 所述反應(yīng)墊為硝酸纖維素膜；所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體為鹽酸克倫特羅抗體和超順磁性復(fù)合粒子的肽鍵共價結(jié)合形成的聚合體；所述鹽酸克倫特羅抗體為鹽酸克倫特羅單克隆抗體或鹽酸克倫特羅多克隆抗體，所述鹽酸克倫特羅抗體具體為鹽酸克倫特羅單克隆抗體；所述鹽酸克倫特羅抗原為鹽酸克倫特羅半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物； 所述載體蛋白與鹽酸克倫特羅半抗原的偶聯(lián)比為1 8 1 10，具體為1 10; 所述與所述鹽酸克倫特羅抗體特異結(jié)合的抗抗體為羊抗鼠IgG抗體； 所述鹽酸克倫特羅抗原和所述羊抗鼠IgG抗體的濃度均為lmg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試紙，其特征在于所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體按照如下方法制備1)將每2.5mg超順磁性復(fù)合粒子、0. 96mgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺、 1. 15mg N-羥基丁二酰亞胺和Iml濃度為0. 1Μ、ρΗ值為4. 7的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液混勻，反應(yīng)，得到活化后磁性粒子；2)將每2.5mg步驟1)得到活化后磁性粒子、0. 15mg鹽酸克倫特羅抗體和0. 8ml濃度為50mM pH為8. 5的硼砂緩沖液混勻、反應(yīng)，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應(yīng)液；3)向步驟幻得到的反應(yīng)液中加入BSA混勻得到混合液、反應(yīng)，得到含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液；所述BSA在所述混合液中的濃度為5% (質(zhì)量百分含量)。 所述鹽酸克倫特羅抗原按照如下方法制備A)將每^ig鹽酸克倫特羅半抗原溶解于Iml0. 2mol/l的HCl溶液中，得到混合液a， 再加入8mg NaNO2,反應(yīng)，得到反應(yīng)液a ；B)將每40mg載體蛋白溶于8ml濃度為0.02mol/L、pH為7. 4的PBS緩沖液，得到混合液b ；C)將每Iml步驟A)得到的反應(yīng)液a和8ml步驟B)得到的混合液b混勻，反應(yīng)，得到反應(yīng)液C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的試紙，其特征在于所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的制備方法中 步驟1)中，反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)時間為0. ; 步驟2)中，反應(yīng)溫度為25°C，反應(yīng)時間為3. ; 步驟3)中，反應(yīng)溫度為37°C，反應(yīng)時間為0. ^！。 所述鹽酸克倫特羅抗原的制備方法中步驟A)中，所述反應(yīng)溫度為4°C，所述反應(yīng)時間為池；所述反應(yīng)的pH值為1 ； 步驟C)中，所述反應(yīng)溫度為4°C，所述反應(yīng)時間為Mi ；所述所述反應(yīng)的pH值為8. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試紙，其特征在于所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的制備方法中在所述步驟幻后，還包括將所述含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液中的封閉后磁性粒子進行洗滌、懸浮，得到超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的步驟，所述洗滌液和懸浮液均為濃度為0. 02M pH為7. 4的PBS緩沖液。所述鹽酸克倫特羅抗原的制備方法中，在所述步驟C)后還包括將步驟C)得到的反應(yīng)液c透析、凍干，得到鹽酸克倫特羅抗原的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的試紙，其特征在于所述鹽酸克倫特羅半抗原為鹽酸克倫特羅；所述載體蛋白為BSA;所述超順磁性復(fù)合粒子為!^e3O4納米粒子；所述超順磁性復(fù)合粒子的粒徑為60 300nm，所述粒徑具體為80 200nm，所述粒徑尤其優(yōu)選為IOOnm ；所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強度為30 80emu/g，對應(yīng)的外磁場響應(yīng)速度為20 100秒，所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強度具體為35 70emu/g，對應(yīng)的外磁場響應(yīng)速度為20 50秒，所述超順磁性復(fù)合粒子的磁飽和強度尤其優(yōu)選為40emu/g，對應(yīng)的外磁場響應(yīng)速度為20秒；所述超順磁性復(fù)合粒子表面的羧基含量為50 500 μ mol/g,所述超順磁性復(fù)合粒子表面的羧基含量具體為50 300 μ mol/g，所述超順磁性復(fù)合粒子表面的羧基含量尤其優(yōu)選為80 μ mol/g;所述鹽酸克倫特羅抗體親和常數(shù)為IO6 IO8M-1 ；所述鹽酸克倫特羅抗體親和常數(shù)具體為IO7 IO8M4 ；所述鹽酸克倫特羅抗體親和常數(shù)尤其優(yōu)選為IO8MA
7.一種制備檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙的方法，包括如下步驟I、分別制備樣品墊和含有檢測線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊；II、將步驟I得到的樣品墊、步驟I得到的含有檢測線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊與吸水墊依次粘貼到背板上，得到檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙；所述含有檢測線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊按照如下方法制備將權(quán)利要求1-6中試紙中的所述鹽酸克倫特羅抗原和權(quán)利要求1-6中試紙中的所述與鹽酸克倫特羅抗體特異結(jié)合的抗抗體分別噴在反應(yīng)墊的兩端不同區(qū)域，形成檢測線和質(zhì)控線，得到含有檢測線和質(zhì)控線的反應(yīng)墊；所述樣品墊按照如下方法制備將權(quán)利要求1-6中試紙中的所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體噴到玻璃纖維紙上，得到樣品墊。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于在所述樣品墊制備方法中在將所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體噴到所述玻璃纖維紙上前，還包括預(yù)處理所述玻璃纖維紙和預(yù)處理所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的步驟所述預(yù)處理所述玻璃纖維紙為將所述玻璃纖維紙在緩沖液中浸泡1小時；所述緩沖液按照如下方法制備將每anlTritonXlOOUOg BSA、50g蔗糖和950ml濃度為0. 02M、pH為7. 4的PBS緩沖液混合得到緩沖液，調(diào)pH到7. 4，并定容到1000ml。所述浸泡的時間為1小時，浸泡的溫度為37°C ；所述預(yù)處理所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體為將所述超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體稀釋，所述稀釋倍數(shù)為50倍； 所述反應(yīng)墊為硝酸纖維素膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于在步驟I后，步驟II前，還包括干燥步驟I得到的樣品墊與步驟I得到的含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的步驟。
10.權(quán)利要求1-6任一所述試紙在檢測樣品中殘留鹽酸克倫特羅中的應(yīng)用，所述樣品具體為動物組織樣本、動物尿樣或飼料，所述樣品尤其具體為豬尿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙及其制備方法。本發(fā)明提供的檢測鹽酸克倫特羅的免疫層析試紙，包括含有超順磁性復(fù)合粒子標(biāo)記鹽酸克倫特羅抗體的樣品墊、連接于所述樣品墊一端的硝酸纖維素膜、連接于所述硝酸纖維素膜另一端的吸水墊；所述硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線含有鹽酸克倫特羅抗原，所述質(zhì)控線含有能與所述鹽酸克倫特羅抗體特異結(jié)合的抗抗體。本發(fā)明的實驗證明，用本發(fā)明提供的試紙檢測鹽酸克倫特羅，靈敏度高、特異性強、快速、簡便，可實現(xiàn)客觀化測定。
文檔編號G01N33/577GK102253211SQ20111015727
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月13日
發(fā)明者盧體康, 吳峰, 秦智鋒, 袁航, 馬嵐 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院