專利名稱：香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物的質(zhì)量分析和鑒定方法，具體涉及一種香蒲假莖中的總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
香蒲(7latifolia L.)，又名蒲菜、蒲草、水蠟燭，為香蒲科香蒲屬多年生宿根性沼澤草本植物，分布于世界各地的沼澤及淡水湖泊中。在我國部分地區(qū)，其營養(yǎng)體幼嫩部分被用來作為蔬菜食用，風(fēng)味獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，并且蒲菜還具有藥用價(jià)值，其性味甘平，微涼， 具有清涼補(bǔ)血，利水消腫之功效，因而是一種營養(yǎng)豐富并具一定藥療功能的保健型蔬菜。蒲菜中的主要營養(yǎng)物質(zhì)和和藥效物質(zhì)為蛋白質(zhì)類化合物，但植株體內(nèi)還含有較多的次生代謝產(chǎn)物(如色素、酚類、醌類等物質(zhì))，現(xiàn)有技術(shù)中還沒有針對蒲菜中蛋白成分的質(zhì)量分析方法。因此為了對香蒲這一藥食兩用植物進(jìn)行深入研究，并能方便鑒別其真?zhèn)危ο闫堰M(jìn)行質(zhì)量控制，為實(shí)現(xiàn)科學(xué)化種植和培育提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，很有必要在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上研究設(shè)計(jì)一種能對香蒲中的總蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，建立適用于香蒲蛋白質(zhì)組分有效分離、分析的方法，該方法可為香蒲水生植物材料蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和參考。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，具體包括以下步驟
(1)采集香蒲假莖，用超純水洗凈，并用濾紙吸去多余水分，放入液氮中速凍，并移至-80°c冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (2)稱取5g步驟(1)保藏的香蒲假莖迅速放入冰浴的研缽中，加液氮研磨成細(xì)粉，研磨過程中加入0. 5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的細(xì)粉轉(zhuǎn)入-20°C預(yù)冷的50ml離心管中，加入 3倍體積-20°C預(yù)冷的三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液，充分混合后，放在-20°C冰箱中靜置2小時(shí)，備用；
(3)取步驟( 得到的香蒲假莖細(xì)粉的三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液，在35000轉(zhuǎn)/分鐘， 4°C離心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20°C 保存1小時(shí)，期間間隔渦旋；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，移去上清液，取沉淀， 再加入25 ml -20°C預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20°C保存1小時(shí)，期間間隔渦旋；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，去掉上清液后，用濾紙將離心管封口，真空冷凍干燥，得到香蒲假莖蛋白粉；備用；
(4)取步驟(3)得到的香蒲假莖蛋白粉在4°C溶于樣品裂解液中1小時(shí)，期間在裂解液中加玻璃珠，并用超聲波超聲三次，每次3分鐘；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，得到上清液；然后用3倍體積預(yù)冷的樣品洗滌液在_20°C沉淀1小時(shí)，然后再在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C、離心30min，棄上清液，得離心沉淀后溶解于樣品裂解液，在4°C溶解1小時(shí)，然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，取上清液，得到香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液，備用；
(5)取步驟(4)得到的香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液，采用考馬斯亮蘭法(Bradford)測定其蛋白濃度，對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量；
(6)取步驟(4)得到的香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行電泳分析或?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜檢測和分析。
第一向等電聚焦電泳按上樣量500μβ，上樣體積450μ1，用水化液對已定量好的香蒲假莖蛋白樣品進(jìn)行稀釋；將香蒲假莖蛋白樣品加入水化盤內(nèi)后，再將線性IPG膠條(優(yōu)選ρΗ 4-7, 24cm, GE Healthcare, Piscataway，NJ, USA)膠面向下放入水化盤中，除去膠面與蛋白樣品液間的氣泡，每個(gè)膠條用7ml礦物油覆蓋膠條，進(jìn)行水化；水化結(jié)束后進(jìn)行等電聚焦；
(7)膠條平衡處理將步驟(6)等電聚焦完成后的IPG膠條進(jìn)行平衡2次，每次平衡時(shí)間為15min，二次平衡緩沖液配制如下
膠條平衡緩沖液母液6mol/L的尿素，質(zhì)量體積比21的十二烷基磺酸鈉(SDS)， 0. 375mol/L的Tris-HCl (優(yōu)選ρΗ為8. 8)，體積比30%甘油，溶劑為水；
第一次膠條平衡緩沖液I
為每Iml膠條平衡緩沖液母液加入20mg 二硫蘇糖醇(DTT)；
第二次膠條平衡緩沖液Π為每Iml膠條平衡緩沖液母液加入25mg碘乙酰胺；
第二向聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳將平衡后的膠條置于膠濃度為12.5% (質(zhì)量體積比)的SDS-PAGE凝膠上，用濃度為0. 5% (質(zhì)量體積比)低熔點(diǎn)瓊脂糖的封膠液封住頂部，其中瓊脂糖中含有質(zhì)量體積比為0. 002%的溴酚藍(lán)，然后按如下參數(shù)進(jìn)行電泳16°C恒溫，恒功率條件下，用2瓦/根膠條電泳1. 5h,再用12瓦/根膠條電泳4 6h，直到溴酚藍(lán)移動(dòng)到需要的位置為止；
(8)電泳結(jié)束后對膠條采用硝酸銀法進(jìn)行染色分析或?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜檢測和分析。。作為優(yōu)選方案，以上所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，步驟
(2)所述的三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液由下列物質(zhì)組成質(zhì)量體積比10%的三氯乙酸，質(zhì)量體積比0. 07%的二硫蘇糖醇(DTT)，lmmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)，其余溶劑為丙酮。作為優(yōu)選方案，以上所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，步驟
(3)所述的樣品洗滌液由下列物質(zhì)組成質(zhì)量體積比0.07%的二硫蘇糖醇和lmmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶劑為丙酮。作為優(yōu)選方案，以上所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，步驟
(4)樣品裂解液由下列物質(zhì)組成7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、質(zhì)量體積比4%的3_[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、65mmol/L的二硫蘇糖醇、lmmol/L苯甲基磺酰氟、體積比0. 2%的載體兩性電解質(zhì)(所用的載體兩性電解質(zhì)可為carrier ampholytes, GE)，溶劑為水。實(shí)驗(yàn)過程中裂解液需現(xiàn)用現(xiàn)配。在香蒲假莖總蛋白提取過程中，本發(fā)明經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究，對三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液、樣品洗滌液和裂解液的組成及配比進(jìn)行大量篩選，以香蒲假莖總蛋白的提取率和總蛋白中各蛋白的提取完整性為指標(biāo)進(jìn)行篩選，優(yōu)化得到最佳配比的三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液、樣品洗滌液和裂解液，采用本發(fā)明提供的三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液、樣品洗滌液和裂解液對香蒲進(jìn)行處理后香蒲假莖中總蛋白的提取率高，且能保證各蛋白全部提出，為后續(xù)分析和鑒定香蒲假莖總蛋白質(zhì)提供有利依據(jù)。作為優(yōu)選方案，以上所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，步驟(6)所述的水化液由下列物質(zhì)組成7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、質(zhì)量體積比m的 3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、65mmol/L的二硫蘇糖醇、體積比 0. 的載體兩性電解質(zhì)(所用的載體兩性電解質(zhì)可為carrier ampholytes, GE)，溶劑為水。實(shí)驗(yàn)過程中水化液需現(xiàn)用現(xiàn)配。作為優(yōu)選方案，以上所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法， 步驟(6)所述的等電聚焦的參數(shù)設(shè)置如下30伏水化，12小時(shí)；200伏(升壓模式為 st印-n-hold)，1小時(shí)；500伏(升壓模式為st印-n-hold)，1小時(shí)；2000伏(升壓模式為st印-n-hold)，l小時(shí)；8000伏(升壓模式為gradiet)，4小時(shí)；8000伏(升壓模式為 step-n-hold),60000Vh ；500 伏(升壓模式為 st印-n-hold，保持)。作為優(yōu)選方案，以上所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，步驟(6)第二向聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳中聚丙烯酰胺凝膠的溶劑由體積比為31 42 25 1 1 0. 14的水、質(zhì)量體積比30%的丙烯酰胺、0. 375mol/L的Tris-HCl (優(yōu)選pH為 8. 8)、質(zhì)量體積比為10%的十二烷基硫酸鈉、質(zhì)量體積比為10%的過硫酸銨和體積比為10% 的四甲基乙二胺組成。作為優(yōu)選方案，以上所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，步驟 (6)中電極緩沖液配制方法如下按質(zhì)量體積比0. 1%的十二烷基硫酸鈉，0. 025mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)和0. 192mol/L的甘氨酸進(jìn)行配制，溶劑為水，并調(diào)制pH值為8. 3。作為優(yōu)選方案，以上所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，步驟 (8)中所述的硝酸銀染色分析方法包括如下程序
步驟a 將電泳結(jié)束后凝膠條放入盛有超純水的染色盤中，用超純水在搖床上洗3次， 每次IOmin ；
步驟b 然后加入IOOml冰乙酸、400ml無水乙醇、加水至IOOOml固定池或過夜； 步驟c:然后取2g硫代硫酸鈉，112. 72g三水合乙酸鈉，300ml無水乙醇，加水至IOOOml將膠條敏化30min ；然后再用600ml超純水漂洗三遍，每次5 10 min ； 步驟d 然后將2. 5g硝酸銀溶于IOOOml水，避光條件下對膠條染色30min ；然后用 600ml超純水漂洗二遍，每次廣5min ；
步驟e 然后用25g無水碳酸鈉，0. 4ml甲醛，加水至1000ml，顯色共2次；第一次待溶液變黃后倒掉，第二次顯色到蛋白質(zhì)點(diǎn)顯現(xiàn)到理想的程度和清晰度為止；
步驟f 最后將凝膠條放入由14. 6g Na2EDTA溶于IOOOml體積的水制成的終止液中終止IOmin以上或過夜，即可。以上所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，步驟(8)所述的質(zhì)譜檢測和分析，采用EI-MS或MS-MS串聯(lián)質(zhì)譜法分析。以上所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法中，整個(gè)過程的溶液配制均需用超純水，實(shí)驗(yàn)過程所需的DTT和碘乙酰胺均需現(xiàn)用現(xiàn)加。有益效果本發(fā)明提供的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法具有以下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)篩選，首先可以高效的將香蒲及其假莖中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取出來，然后根據(jù)香蒲及其假莖中所含化合物的特點(diǎn)，在大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)選條件下，采用雙向電泳方法不僅能將蛋白質(zhì)和次生代謝物 (如色素、酚類、醌類等)成分進(jìn)行分離，而且能將香蒲假莖中各蛋白質(zhì)成分進(jìn)行分離，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明采用的雙向電泳分析方法分離得到的蛋白點(diǎn)多，經(jīng)PDQuest圖像分析軟件檢測，蛋白點(diǎn)多于1000個(gè)，且圖譜清晰，無橫向、縱向條紋，重復(fù)性好，可在香蒲及其假莖蛋白質(zhì)組學(xué)中直接運(yùn)用，并且本發(fā)明再對分離的蛋白質(zhì)采用優(yōu)選的硝酸銀染色法定性分析和/或采用質(zhì)譜儀對蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。本發(fā)明所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法體系，能方便鑒別香蒲這一藥食兩用植物的真?zhèn)?，為對香蒲進(jìn)行深入研究，為實(shí)現(xiàn)科學(xué)化種植和培育提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)依據(jù)。


圖1為實(shí)施例1中香蒲室內(nèi)水培假莖總蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜。圖2為實(shí)施例2中湖泊生長的香蒲假莖總蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。以下實(shí)施例1和2所用的離心機(jī)為高速冷凍離心機(jī)(Beckmen)、雙向電泳為雙向電泳 Ettan2_2A (GE Healthcare)。實(shí)施例1
室內(nèi)水培香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，具體包括以下步驟
(1)采集室內(nèi)水培香蒲假莖，用超純水洗凈，并用濾紙吸去多余水分，放入液氮中速凍， 并移至-80°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (2)稱取5g步驟(1)保藏的香蒲假莖迅速放入冰浴的研缽中，加液氮研磨成細(xì)粉，研磨過程中加入0. 5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的細(xì)粉轉(zhuǎn)入-20°C預(yù)冷的50ml離心管中，加入 3倍體積-20°C預(yù)冷的三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液，充分混合后，放在-20°C冰箱中靜置2小時(shí)，備用；其中所述的三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液由下列物質(zhì)組成質(zhì)量體積比10%的三氯乙酸，質(zhì)量體積比0. 07%的二硫蘇糖醇(DTT)，lmmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)，其余溶劑為丙酮。(3)取步驟⑵得到的香蒲假莖細(xì)粉的三氯乙酸(TCA) /丙酮溶液，在35000轉(zhuǎn) /分鐘，4°C離心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20°C保存1小時(shí)，期間間隔渦旋；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，移去上清液， 取沉淀，再加入25 ml -20°C預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20°C保存1小時(shí)，期間間隔渦旋；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，去掉上清液后，用濾紙將離心管封口，真空冷凍干燥，得到香蒲假莖蛋白粉；備用；其中所述的樣品洗滌液由下列物質(zhì)組成質(zhì)量體積比0. 07%的二硫蘇糖醇和lmmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶劑為丙酮。(4)取步驟(3)得到的香蒲假莖蛋白粉在4°C溶于樣品裂解液中1小時(shí)，期間在裂解液中加玻璃珠，并用超聲波超聲三次，每次3分鐘；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，得到上清液；然后用3倍體積預(yù)冷的樣品洗滌液在_20°C沉淀1小時(shí)，然后再在 35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C、離心30min，棄上清液，得離心沉淀后溶解于樣品裂解液，在4°C溶解 1小時(shí)，然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，取上清液，得到香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液， 備用；其中樣品裂解液由下列物質(zhì)組成7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、質(zhì)量體積比4%的
3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、65mmol/L的二硫蘇糖醇、lmmol/ L苯甲基磺酰氟、體積比0. 的載體兩性電解質(zhì)(carrier ampholytes, GE)。實(shí)驗(yàn)過程中裂解液需現(xiàn)用現(xiàn)配。(5)取步驟(4)得到的香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液，采用Bradford法測定其蛋白濃度，對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量；
(6)取步驟(4)得到的香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行電泳分析 第一向等電聚焦電泳按上樣量500μβ，上樣體積450μ1，用水化液對已定量好的香蒲假莖蛋白樣品進(jìn)行稀釋；將香蒲假莖蛋白樣品加入水化盤內(nèi)后，再將線性IPG膠條(ρΗ
4-7,24cm, GE Healthcare, Piscataway，NJ, USA)膠面向下放入水化盤中，除去膠面與蛋白樣品液間的氣泡，每個(gè)膠條用7ml礦物油覆蓋膠條，進(jìn)行水化；水化結(jié)束后進(jìn)行等電聚焦 (等電聚焦的參數(shù)設(shè)置如下30伏水化，12小時(shí)；200伏(升壓模式為step-n-hold)，1小時(shí)； 500伏(升壓模式為st印-n-hold)，1小時(shí)；2000伏(升壓模式為st印-n-hold)，1小時(shí)；8000 伏(升壓模式為gradiet)，4小時(shí)；8000伏(升壓模式為st印-n-hold)，60000Vh ；500伏(升壓模式為st印-n-hold，保持)；其中所述的水化液由下列物質(zhì)組成7mol/L的尿素、2mol/ 的硫脲、質(zhì)量體積比1的3- [ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS )、65mmo 1/ L的二硫蘇糖醇、體積比0. 2%的載體兩性電解質(zhì)。實(shí)驗(yàn)過程中水化液需現(xiàn)用現(xiàn)配。(7)膠條平衡處理將步驟(6)等電聚焦完成后的IPG膠條進(jìn)行平衡兩次，每次平衡時(shí)間為15min，二次平衡緩沖液配制如下
膠條平衡緩沖液母液6mol/L的尿素，質(zhì)量體積比21的十二烷基磺酸鈉(SDS)， 0. 375mol/L的Tris-HCl CpH為8. 8)，體積比30%甘油，溶劑為水；
第一次膠條平衡緩沖液I為每Iml膠條平衡緩沖液母液加入20mg 二硫蘇糖醇 (DTT)；
第二次膠條平衡緩沖液Π為每Iml膠條平衡緩沖液母液加入25mg碘乙酰胺；
第二向聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳將平衡后的膠條置于膠濃度為12.5% (質(zhì)量體積比)的SDS-PAGE凝膠上，用濃度為0. 5% (質(zhì)量體積比)低熔點(diǎn)瓊脂糖的封膠液封住頂部，其中瓊脂糖中含有質(zhì)量體積比為0. 002%的溴酚藍(lán)，然后按如下參數(shù)進(jìn)行電泳16°C恒溫，恒功率條件下，用2瓦/根膠條電泳1. 5h,再用12瓦/根膠條電泳4 6h，直到溴酚藍(lán)移動(dòng)到需要的位置為止；其中電極緩沖液配制方法如下按質(zhì)量體積比0. 1%的十二烷基硫酸鈉，0. 025mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)和0. 192mol/L的甘氨酸進(jìn)行配制，溶劑為水， 并調(diào)制PH值為8.3。并且第二向SDS-PAGE電泳中聚丙烯酰胺凝膠的溶劑由體積比為31 42 :25:1:1: 0. 14的水、質(zhì)量體積比30%丙烯酰胺、0. 375mol/L的Tris-HCl CpH為8. 8)、質(zhì)量體積比為 10%的十二烷基硫酸鈉、質(zhì)量體積比為10%的過硫酸銨和體積比為10%的四甲基乙二胺組成。(8)電泳結(jié)束后對膠條采用硝酸銀法進(jìn)行染色分析，具體程序如下
步驟a 將電泳結(jié)束后凝膠條放入盛有超純水的染色盤中，用超純水在搖床上洗3次， 每次IOmin ；
步驟b 然后加入IOOml冰乙酸、400ml無水乙醇、加水至IOOOml固定池或過夜； 步驟c:然后取2g硫代硫酸鈉，112. 72g三水合乙酸鈉，300ml無水乙醇，加水至IOOOml將膠條敏化30min ；然后再用600ml超純水漂洗三遍，每次5 10 min ； 步驟d 然后將2. 5g硝酸銀溶于IOOOml水，避光條件下對膠條染色30min ；然后用 600ml超純水漂洗二遍，每次廣5min ；
步驟e 然后用25g無水碳酸鈉，0. 4ml甲醛，加水至1000ml，顯色共2次；第一次待溶液變黃后倒掉，第二次顯色到蛋白質(zhì)點(diǎn)顯現(xiàn)到理想的程度和清晰度為止；
步驟f 最后將凝膠條放入由14. 6g Na2EDTA溶于IOOOml體積的水制成的終止液中終止IOmin以上或過夜，即可。通過上述方法對室內(nèi)培養(yǎng)的香蒲假莖總蛋白質(zhì)進(jìn)行提取和雙向電泳分離，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，該圖表明香蒲假莖總蛋白質(zhì)樣品分離效果好，圖譜清晰，蛋白點(diǎn)多，無橫向、縱向條紋，經(jīng)PDQuest軟件點(diǎn)檢測和分析，蛋白點(diǎn)多于1000個(gè)。并且圖1中橫向?yàn)榈入娋劢?，橫向數(shù)字為蛋白質(zhì)凝膠等電點(diǎn)分布；縱向?yàn)镾DS-PAGE，縱向數(shù)字為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，單位是kD，并且經(jīng)質(zhì)譜分析確定圖1中蛋白點(diǎn)1、2、3、4、5、6、7和8分別為甲硫氨酸合成酶、烯醇化酶、硫腺苷甲硫氨酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、膜粘連蛋白_2、抗壞血酸過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，不僅可以有效的將香蒲及其假莖中總蛋白質(zhì)提取出來，而且還能將各蛋白化合物進(jìn)行有效分離，通過硝酸銀染色定性分析和通過質(zhì)譜可確定蛋白質(zhì)的具體成分，為香蒲及其假莖蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)，為香蒲及其假莖提供質(zhì)量控制方法。實(shí)施例2
江蘇省淮安市沿湖所種植的香蒲假莖中總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，具體包括以下步驟
(1)采集江蘇省淮安市沿湖所種植的香蒲假莖，用超純水洗凈，并用濾紙吸去多余水分，放入液氮中速凍，并移至_80°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> (2)稱取5g步驟(1)保藏的香蒲假莖迅速放入冰浴的研缽中，加液氮研磨成細(xì)粉，研磨過程中加入0. 5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的細(xì)粉轉(zhuǎn)入-20°C預(yù)冷的50ml離心管中，加入 3倍體積-20°C預(yù)冷的三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液，充分混合后，放在-20°C冰箱中靜置2小時(shí)，備用；其中所述的三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液由下列物質(zhì)組成質(zhì)量體積比10%的三氯乙酸，質(zhì)量體積比0. 07%的二硫蘇糖醇(DTT)，lmmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)，其余溶劑為丙酮。(3)取步驟⑵得到的香蒲假莖細(xì)粉的三氯乙酸(TCA) /丙酮溶液，在35000轉(zhuǎn) /分鐘，4°C離心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20°C保存1小時(shí)，期間間隔渦旋；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，移去上清液， 取沉淀，再加入25 ml -20°C預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20°C保存1小時(shí)，期間間隔渦旋；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，去掉上清液后，用濾紙將離心管封口，真空冷凍干燥，得到香蒲假莖蛋白粉；備用；其中所述的樣品洗滌液由下列物質(zhì)組成質(zhì)量體積比0. 07%的二硫蘇糖醇和lmmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶劑為丙酮。(4)取步驟(3)得到的香蒲假莖蛋白粉在4°C溶于樣品裂解液中1小時(shí)，期間在裂解液中加玻璃珠，并用超聲波超聲三次，每次3分鐘；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，得到上清液；然后用3倍體積預(yù)冷的樣品洗滌液在_20°C沉淀1小時(shí)，然后再在 35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C、離心30min，棄上清液，得離心沉淀后溶解于樣品裂解液，在4°C溶解 1小時(shí)，然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，取上清液，得到香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液， 備用；其中樣品裂解液由下列物質(zhì)組成7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、質(zhì)量體積比4%的
3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、65mmol/L的二硫蘇糖醇、lmmol/L 苯甲基磺酰氟、體積比0. 2%的載體兩性電解質(zhì)(carrier ampholytes, GE),實(shí)驗(yàn)過程中裂解液需現(xiàn)用現(xiàn)配。(5)取步驟(4)得到的香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液，采用Bradford法測定其蛋白濃度，對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量；
(6)取步驟(4)得到的香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行電泳分析 第一向等電聚焦電泳按上樣量500μβ，上樣體積450μ1，用水化液對已定量好的香蒲假莖蛋白樣品進(jìn)行稀釋；將香蒲假莖蛋白樣品加入水化盤內(nèi)后，再將線性IPG膠條(ρΗ
4-7,24cm, GE Healthcare, Piscataway，NJ, USA)膠面向下放入水化盤中，除去膠面與蛋白樣品液間的氣泡，每個(gè)膠條用7ml礦物油覆蓋膠條，進(jìn)行水化；水化結(jié)束后進(jìn)行等電聚焦 (等電聚焦的參數(shù)設(shè)置如下30伏水化，12小時(shí)；200伏(升壓模式為st印-n-hold)，l小時(shí)； 500伏(升壓模式為st印-n-hold)，1小時(shí)；2000伏(升壓模式為st印-n-hold)，1小時(shí)；8000 伏(升壓模式為gradiet)，4小時(shí)；8000伏(升壓模式為st印-n-hold)，60000Vh ；500伏(升壓模式為st印-n-hold，保持)；其中所述的水化液由下列物質(zhì)組成7mol/L的尿素、2mol/ 的硫脲、質(zhì)量體積比1的3- [ (3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS )、65mmo 1/ L的二硫蘇糖醇、體積比0. 2%的載體兩性電解質(zhì)。實(shí)驗(yàn)過程中水化液需現(xiàn)用現(xiàn)配。(7)膠條平衡處理將步驟(6)等電聚焦完成后的IPG膠條進(jìn)行平衡2次，每次平衡時(shí)間為15min，二次平衡緩沖液配制如下
膠條平衡緩沖液母液6mol/L的尿素，質(zhì)量體積比21的十二烷基磺酸鈉(SDS)， 0. 375mol/L的Tris-HCl CpH為8. 8)，體積比30%甘油，溶劑為水；
第一次膠條平衡緩沖液I為每Iml膠條平衡緩沖液母液加入20mg 二硫蘇糖醇 (DTT)；
第二次膠條平衡緩沖液Π為每Iml膠條平衡緩沖液母液加入25mg碘乙酰胺；
第二向聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳將平衡后的膠條置于膠濃度為12.5% (質(zhì)量體積比)的SDS-PAGE凝膠上，用濃度為0. 5% (質(zhì)量體積比)低熔點(diǎn)瓊脂糖的封膠液封住頂部，其中瓊脂糖中含有質(zhì)量體積比為0. 002%的溴酚藍(lán)，然后按如下參數(shù)進(jìn)行電泳16°C恒溫，恒功率條件下，用2瓦/根膠條電泳1. 5h,再用12瓦/根膠條電泳4 6h，直到溴酚藍(lán)移動(dòng)到需要的位置為止；其中電極緩沖液配制方法如下按質(zhì)量體積比0. 1%的十二烷基硫酸鈉，0. 025mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)和0. 192mol/L的甘氨酸進(jìn)行配制，溶劑為水，并調(diào)制PH值為8.3。并且第二向SDS-PAGE電泳中聚丙烯酰胺凝膠的溶劑由體積比為31 42 :25:1:1: 0. 14的水、質(zhì)量體積比30%丙烯酰胺、0. 375mol/L的Tris-HCl CpH為8. 8)、質(zhì)量體積比為 10%的十二烷基硫酸鈉、質(zhì)量體積比為10%的過硫酸銨和體積比為10%的四甲基乙二胺組成。(8)電泳結(jié)束后對膠條采用硝酸銀法進(jìn)行染色分析，具體程序如下
步驟a 將電泳結(jié)束后凝膠條放入盛有超純水的染色盤中，用超純水在搖床上洗3次， 每次IOmin ；
步驟b 然后加入IOOml冰乙酸、400ml無水乙醇、加水至IOOOml固定池或過夜； 步驟c:然后取2g硫代硫酸鈉，112. 72g三水合乙酸鈉，300ml無水乙醇，加水至IOOOml將膠條敏化30min ；然后再用600ml超純水漂洗三遍，每次5 10 min ； 步驟d 然后將2. 5g硝酸銀溶于IOOOml水，避光條件下對膠條染色30min ；然后用 600ml超純水漂洗二遍，每次廣5min ；
步驟e 然后用25g無水碳酸鈉，0. 4ml甲醛，加水至1000ml，顯色共2次；第一次待溶液變黃后倒掉，第二次顯色到蛋白質(zhì)點(diǎn)顯現(xiàn)到理想的程度和清晰度為止；
步驟f 最后將凝膠條放入由14. 6g Na2EDTA溶于IOOOml體積的水制成的終止液中終止IOmin以上或過夜，即可。通過上述方法對江蘇省淮安市沿湖所種植的香蒲假莖總蛋白質(zhì)進(jìn)行提取和雙向電泳分離，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，該圖表明香蒲假莖總蛋白質(zhì)樣品分離效果好，圖譜清晰，蛋白點(diǎn)多，無橫向、縱向條紋，經(jīng)PDQuest軟件點(diǎn)檢測和分析，蛋白點(diǎn)多于1000個(gè)。并且圖2中橫向?yàn)榈入娋劢?，橫向數(shù)字為蛋白質(zhì)凝膠等電點(diǎn)分布；縱向?yàn)镾DS-PAGE，縱向數(shù)字為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，單位是kD，經(jīng)質(zhì)譜確定圖2中蛋白點(diǎn)1、2、3、4、5、6、7和8分別為甲硫氨酸合成酶、烯醇化酶、硫腺苷甲硫氨酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、 膜粘連蛋白_2、抗壞血酸過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，可以有效的對香蒲及其假莖中總蛋白質(zhì)進(jìn)行提取、分離和鑒定，該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性好，可作為鑒別香蒲真?zhèn)渭捌滟|(zhì)量控制用，為實(shí)現(xiàn)香蒲科學(xué)化種植、培育和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。以上實(shí)施方式只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人了解本發(fā)明內(nèi)容并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于包括以下步驟(1)采集香蒲假莖，用超純水洗凈，并用濾紙吸去多余水分，放入液氮中速凍，并移至-80°c冰箱保存?zhèn)溆茫?2)稱取5g步驟(1)保藏的香蒲假莖迅速放入冰浴的研缽中，加液氮研磨成細(xì)粉，研磨過程中加入0. 5g聚乙烯吡咯烷酮，把研磨后的細(xì)粉轉(zhuǎn)入-20°C預(yù)冷的50ml離心管中，加入 3倍體積-20°C預(yù)冷的三氯乙酸/丙酮溶液，充分混合后，放在-20°C冰箱中靜置2小時(shí)，備用；(3)取步驟( 得到的香蒲假莖細(xì)粉的三氯乙酸/丙酮溶液，在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C 離心30min，移去上清液，取沉淀，加入25ml預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在_20°C保存1小時(shí)，期間間隔渦旋；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，移去上清液，取沉淀，再加入25 ml -20°C預(yù)冷的樣品洗滌液，充分混合后，放在-20°C保存1小時(shí)，期間間隔渦旋； 然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，去掉上清液后，用濾紙將離心管封口，真空冷凍干燥，得到香蒲假莖蛋白粉；備用；(4)取步驟(3)得到的香蒲假莖蛋白粉在4°C溶于樣品裂解液中1小時(shí)，期間在裂解液中加玻璃珠，并用超聲波超聲三次，每次3分鐘；然后在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，得到上清液；然后用3倍體積預(yù)冷的樣品洗滌液在_20°C沉淀1小時(shí)，然后再在35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C、離心30min，棄上清液，得離心沉淀后溶解于樣品裂解液，在4°C溶解1小時(shí)，然后在 35000轉(zhuǎn)/分鐘，4°C離心30min，取上清液，得到香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液，備用；(5)取步驟(4)得到的香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液，采用考馬斯亮蘭法測定其蛋白濃度，對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量；(6)取步驟(4)得到的香蒲假莖蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行電泳分析第一向等電聚焦電泳按上樣量500μβ，上樣體積450μ1，用水化液對已定量好的香蒲假莖蛋白樣品進(jìn)行稀釋；將香蒲假莖蛋白樣品加入水化盤內(nèi)后，再將線性IPG膠條膠面向下放入水化盤中，除去膠面與蛋白樣品液間的氣泡，每個(gè)膠條用7ml礦物油覆蓋膠條，進(jìn)行水化；水化結(jié)束后進(jìn)行等電聚焦；(7)膠條平衡處理將步驟(6)等電聚焦完成后的IPG膠條進(jìn)行平衡2次，每次平衡時(shí)間為15min，二次平衡緩沖液的配制分別如下膠條平衡緩沖液母液組成6mol/L的尿素，質(zhì)量體積比m的十二烷基磺酸鈉， 0. 375mol/L的Tris-HCl，體積比30%甘油，溶劑為水；第一次膠條平衡緩沖液I為每Iml膠條平衡緩沖液母液加入20mg 二硫蘇糖醇；第二次膠條平衡緩沖液Π為每Iml膠條平衡緩沖液母液加入25mg碘乙酰胺；第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳將平衡后的膠條置于膠濃度為12. 5%的SDS-PAGE凝膠上，用濃度為0. 5%低熔點(diǎn)瓊脂糖的封膠液封住頂部，其中瓊脂糖中含有質(zhì)量體積比為 0. 00 的溴酚藍(lán)，然后按如下參數(shù)進(jìn)行電泳16°C恒溫，恒功率條件下，用2瓦/根膠條電泳1. 5h，再用12瓦/根膠條電泳4 6h，直到溴酚藍(lán)移動(dòng)到需要的位置為止；(8)電泳結(jié)束后對蛋白采用硝酸銀法進(jìn)行染色分析或?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜檢測和分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于，步驟⑵所述的三氯乙酸/丙酮溶液由下列物質(zhì)組成質(zhì)量體積比10%的三氯乙酸，質(zhì)量體積比0. 07%的二硫蘇糖醇，lmmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶劑為丙酮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于，步驟C3)所述的樣品洗滌液由下列物質(zhì)組成質(zhì)量體積比0.07%的二硫蘇糖醇和 lmmol/L的苯甲基磺酰氟，其余溶劑為丙酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于，步驟(4)樣品裂解液由下列物質(zhì)組成7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、質(zhì)量體積比4%的 3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、65mmol/L的二硫蘇糖醇、lmmol/L苯甲基磺酰氟、體積比0. 2%的載體兩性電解質(zhì)，溶劑為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于，步驟(6)所述的水化液由下列物質(zhì)組成7mol/L的尿素、2mol/的硫脲、質(zhì)量體積比m 的3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、65mmol/L的二硫蘇糖醇、體積比0. 2% 的載體兩性電解質(zhì)，溶劑為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于，步驟(6)所述的等電聚焦的參數(shù)設(shè)置如下30伏水化，12小時(shí)；200伏，1小時(shí)；500伏， 1小時(shí)；2000伏1小時(shí)；8000伏，4小時(shí)；8000伏，60000Vh ；500伏，保持。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于，步驟(6)第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳中聚丙烯酰胺凝膠的溶劑由體積比為31 42 25 1 1 0. 14的水、質(zhì)量體積比30%丙烯酰胺、0. 375mol/L的Tris_HCl、質(zhì)量體積比為10%的十二烷基硫酸鈉、質(zhì)量體積比為10%的過硫酸銨和體積比為10%的四甲基乙二胺組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于，步驟(6)中電極緩沖液配制方法如下按質(zhì)量體積比0. 1%的十二烷基硫酸鈉， 0. 025mol/L的三羥甲基氨基甲烷和0. 192mol/L的甘氨酸進(jìn)行配制，溶劑為水，并調(diào)制pH值為 8. 3。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，其特征在于，步驟(8)中所述的硝酸銀染色分析方法程序如下步驟a 將電泳結(jié)束后凝膠條放入盛有超純水的染色盤中，用超純水于搖床上洗3次， 每次IOmin ；步驟b 然后取IOOml冰乙酸、400ml無水乙醇、加水至IOOOml固定池或過夜； 步驟c:然后取2g硫代硫酸鈉，112. 72g三水合乙酸鈉，300ml無水乙醇，加水至 IOOOml敏化膠條30min ；然后再用600ml超純水漂洗三遍，每次5 10 min ；步驟d 然后將2. 5g硝酸銀溶于IOOOml水，避光條件下對膠條染色30min ；然后用 600ml超純水漂洗二遍，每次廣5min ；步驟e 然后用25g無水碳酸鈉，0. 4ml甲醛，加水至1000ml，顯色共2次；第一次待溶液變黃后倒掉，第二次顯色到蛋白質(zhì)點(diǎn)顯現(xiàn)到理想的程度和清晰度為止；步驟f 最后將凝膠條放入由14. 6g Na2EDTA溶于IOOOml體積的水制成的終止液中終止IOmin以上或過夜，即可。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種香蒲假莖總蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳分析方法，本發(fā)明經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)篩選，首先高效地將香蒲假莖中的蛋白質(zhì)提取出來，然后在優(yōu)選條件下，采用雙向電泳方法將蛋白質(zhì)各成分和次生代謝物(如色素、酚類、醌類等)成分進(jìn)行分離，然后采用優(yōu)選條件的硝酸銀染色法進(jìn)行定性分析和/或采用質(zhì)譜儀對分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明采用的雙向電泳分析方法分離得到的蛋白點(diǎn)多，經(jīng)PDQuest圖像分析軟件檢測，蛋白點(diǎn)多于1000個(gè)，且圖譜清晰，無橫向、縱向條紋，該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性好，能方便鑒別香蒲這一藥食兩用植物的真?zhèn)?，為對香蒲進(jìn)行深入研究，為實(shí)現(xiàn)科學(xué)化種植、培育和開發(fā)利用提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)依據(jù)。
文檔編號G01N1/34GK102241730SQ201110128948
公開日2011年11月16日 申請日期2011年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月18日
發(fā)明者張瑞越, 楊立明, 羅玉明, 陳楨雨 申請人:淮陰師范學(xué)院