專利名稱：一種酶聯(lián)檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體地說涉及一種檢測人血管內皮細胞生長因子 (VEGF)的酶聯(lián)檢測試劑盒。本發(fā)明還涉及上述試劑盒的制備方法。
背景技術：
腫瘤的發(fā)展和轉移是多階段的、復雜的、具有高度選擇性的過程，涉及腫瘤細胞與宿主之間錯綜復雜的關系，其機理尚不甚清楚。近年來關于新的血管生成與腫瘤發(fā)展、轉移和預后關系的研究進展迅速，證明新的血管生成是腫瘤生成、轉移和轉移灶生長的必要條件，血管內皮細胞生長因子(VEGF)是調節(jié)新血管生成的最重要的細胞因子。研究表明血管內皮細胞生長因子(VEGF)在血管系統(tǒng)的發(fā)育分化中具有不可替代的作用O^errara et al. Endocr. Rev. 1997，18 :4-25)。VEGF是一個分子量為45KD的高度糖基化的堿性蛋白，有兩個相同亞單位通過二硫鍵結合形成，等電點為8. 5，有很強的耐熱和耐酸能力。人VEGF基因有5種不同的異構體，分別為 VEGF206、VEGF189, VEGF165、VEGF145, VEGF121。VEGF高親和力結合位點僅位于血管內皮細胞上的3種VEGF受體，即VEGFR-1、 VEGFR-2、VEGFR-3，這3種受體主要分布于血管內皮細胞表面，均是跨膜受體。研究表明， VEGF受體在體外與 VEGF有高度的親和力(Kendall et a 1. PNAS USA，1993，90 10705-9)。VEGF是癌癥生長、轉移所必需的一種因子。目前研究表明，在人類各種惡性腫瘤 (即癌癥)疾病中，VEGF的分泌增加有著普遍性和廣泛性。有大量文獻報道，VEGF在正常人和癌癥患者中的濃度明顯不同，正常人中的VEGF濃度很低或檢測不到，而在癌癥患者中 VEGF濃度很高。因此，檢測人血液中的VEGF濃度，能夠用于癌癥的早期普查診斷。另一方面，VEGF在人體血液中的濃度隨腫瘤的消長情況而變化。腫塊大、生長快時，VEGF的血液濃度就高；而當腫瘤因化療或手術"臨床治愈"時，VEGF的血液濃度降低。故VEGF得檢測可作為療效觀察和預后的指標。VEGF是惡性腫瘤診斷中的一個重要組成部分。另外，血液 VEGF水平增高亦見于糖尿病、血管炎癥性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。Yeo et al. (Clin. Chem. 1992,38 :71)報道了以免疫熒光為基礎的檢測VEGF的 ELISA 方法，但其檢測靈敏度較低。Houck et al. (J Biol. Chem. 1992，267 :26031)報道了以比色發(fā)為基礎的檢測VEGF的ELISA方法，但其檢測敏感度僅為ng/ml。Hanatani et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995,59 :1985)報道了測定 VEGF 的化學發(fā)光 ELISA，測定正常人的血清VEGF水平為8-36ng/l。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種酶聯(lián)免疫檢測人血管內皮細胞生長因子(VEGF)的檢測試劑盒。該試劑盒結果準確穩(wěn)定、特異性強、靈敏度高、使用方便、便于推廣。本發(fā)明的另一目的是提供上述酶聯(lián)檢測試劑盒的生產制備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其組成為1.酶聯(lián)板；2.陽性對照(凍干)；3.陰性對照(凍干)；4.樣品稀釋液；5.酶聯(lián)物；6.濃縮洗滌液；7.顯色劑A&B;8.終止液；9.封板膠紙。本發(fā)明提供了一種試劑盒的制備方法，包括如下步驟(a)以酶聯(lián)反應板為固體支持物，將基因工程表達的VEGF受體及單克隆抗體包被于固體支持物上；(b)用封閉液封閉；(c將生物標本與固定于酶聯(lián)板上的VEGF受體及單克隆抗體接觸和保溫，生物標本中的VEGF特異地與VEGF受體及單克隆抗體結合；(d)從VEGF受體及單克隆抗體上分離生物標本；(e)用辣根過氧化物酶(HRP)標記的VEGF多克隆抗體檢測VEGF，所用顯色底物為 3,3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。本發(fā)明試劑盒的獨特性在于，它使用VEGF受體及單克隆抗體聯(lián)合包被酶聯(lián)板，能夠確保較低水平的VEGF能被本試劑盒所檢測，能對標本有更準確的測定。本試劑盒檢測生物標本中的VEGF，優(yōu)選來自癌癥、血管病病人或其他疾病病人的標本。


圖1 本發(fā)明試劑盒盒體及組成成份。
具體實施例方式
下述實施例是為了更詳細的解釋本發(fā)明，但不應理解為本發(fā)明局限于此。實施例1 本發(fā)明的試劑盒舉例可以是下列物質(I)VEGF受體及單克隆抗體聯(lián)合包被酶聯(lián)板，以及(2)陽性對照(VEGF蛋白凍干粉)1支；(3)陰性對照(動物血清凍干粉)1支；(4)樣品稀釋液0. 05%吐溫-20，牛血清白蛋白，IOmM乙二胺四乙酸二鈉， 0. 05%硫柳汞，0. 4M NaCl，ρΗ6· 5，1 瓶；(5)酶聯(lián)物辣根過氧化物酶標記血管內皮生長因子多克隆抗體，2瓶；(6)濃縮洗滌液為137mM NaCl, 2. 7mM KCl, IOmM Nei2HPO4, 2mMKH2P04，0· 05 % 吐溫-20，Ph7. 4，1 瓶；(7)顯色劑A、B，其中A液位H2O2溶液，B液為3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液， 各1瓶；(8)終止液為 2MH2S04，1 瓶；(9)封板膠紙2張。本例所述的各種物質量均以酶聯(lián)板為96孔(12條8孔或8條12孔)的例子計算的，如果酶聯(lián)板的孔數(shù)多于或少于96孔，則各物質量也相應或多或少。該試劑盒外觀可參閱圖1所示。
其制備方法(I)VEGF基因和VEGF受體基因的克隆以人胎盤cDNA文庫為模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)。依據(jù)VEGF基因的報道序列設計引物，PCR反應條件94°C變性40秒，52°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，30個循環(huán)后 72°C保溫10分鐘。依據(jù)VEGF受體基因的報道序列設計引物，PCR反應條件94°C變性40 秒，52 °C退火1分鐘，72 °C延伸2分鐘，30個循環(huán)后72°C保溫10分鐘。
權利要求
1.一種酶聯(lián)檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括酶聯(lián)板、陽性對照、陰性對照、樣品稀釋液、酶聯(lián)物、濃縮洗滌液、顯色劑、終止液和封板膠紙；其中酶聯(lián)板為血管內皮細胞生長因子受體及單克隆抗體聯(lián)合包被的酶聯(lián)反應板；酶聯(lián)物為辣根過氧化物酶標記血管內皮生長因子多克隆抗體。
2.根據(jù)權利要求1的試劑盒，其特征在于陽性對照為血管內皮細胞生長因子蛋白凍干粉；陰性對照為動物血清凍干粉；樣品稀釋液為0. 05%吐溫-20，牛血清白蛋白，IOmM乙二胺四乙酸二鈉，0. 05%硫柳汞，0. 4M NaCl，ρΗ6· 5 ；濃縮洗滌液為 137mM NaCl，2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4, 2mMKH2P04,0 . 05 % 吐溫-20， Ph7. 4 ；顯色劑為顯色劑A&B，其中A液為H2O2溶液，B液為3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液；終止液為2MH2S04。
3.根據(jù)權利要求1的試劑盒，其特征在于，各物質的量以酶聯(lián)板的孔數(shù)為標準。
4.根據(jù)權利要求1的試劑盒，其特征在于，所述酶聯(lián)板為96孔。
5.一種酶聯(lián)檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟(a)將基因工程表達的血管內皮細胞生長因子受體及單克隆抗體包被于固體支持物酶聯(lián)反應板上；(b)用封閉液封閉；(c)將生物標本加入到預包被的酶聯(lián)反應板反應孔中，生物標本中的血管內皮細胞生長因子特異地與血管內皮細胞生長因子受體及單克隆抗體結合；(d)用血管內皮細胞生長因子多克隆抗體檢測血管內皮細胞生長因子；(e)顯色底物為3，3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液。
6.根據(jù)權利要求5的方法，其特征在于，步驟(a)所述的單克隆抗體是用血管內皮細胞生長因子免疫小鼠所得。
7.根據(jù)權利要求5的方法，其特征在于，步驟(a)所述的基因工程表達的血管內皮細胞生長因子受體用昆蟲細胞表達。
8.根據(jù)權利要求7的方法，其特征在于，所述昆蟲細胞為sf9、sfl2、sfl58或cl27細胞株。
9.根據(jù)權利要求7的方法，其特征在于，所述昆蟲細胞表達的血管內皮細胞生長因子受體用Ni柱純化。
10.根據(jù)權利要求5的方法，其特征在于，步驟(c)所述的生物標本為癌癥、血管病、糖尿病視網(wǎng)膜病及類風濕關節(jié)炎患者的血清、血漿、腦脊液、唾液、組織提取液或尿液。
11.根據(jù)權利要求5的方法，其特征在于，步驟(d)所述的血管內皮細胞生長因子多克隆抗體制備用的血管內皮細胞生長因子用昆蟲細胞表達并用Ni柱純化。
12.根據(jù)權利要求5的方法，其特征在于，步驟(d)所述的多克隆抗體是用血管內皮細胞生長因子免疫家兔所得。
13.根據(jù)權利要求5的方法，其特征在于，步驟(d)所述的多克隆抗體用辣根過氧化物酶標記。
全文摘要
一種檢測人血管內皮生長因子(VEGF)的酶聯(lián)檢測試劑盒。試劑盒盒體內包括VEGF受體及單克隆抗體聯(lián)合包被的酶聯(lián)反應板、辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體加保護劑配置的酶結合物、作為陽性對照的VEGF蛋白的凍干粉、作為陰性對照的蛋白凍干粉、樣品稀釋液、PBST濃縮洗液、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺配置的顯色底物、作為終止液的2MH2SO4、封板膠紙。本試劑盒可用于癌癥、血管病、糖尿病視網(wǎng)膜病及類風濕關節(jié)炎的診斷和預后，具有準確、特異、靈敏、穩(wěn)定、方便等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/535GK102207504SQ201110069600
公開日2011年10月5日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權日2011年3月23日
發(fā)明者鄒檢平 申請人:北京華創(chuàng)遠航科技有限公司